一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法
阅读说明：本技术 一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法 (Method for simultaneously detecting contents of escherichia coli and salmonella in sample to be detected ) 是由 郑金铠 李玉芝 陆畅 周帅帅 高飞 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法。该方法依次包括如下步骤：(1)向待测样品中加入过量的大肠杆菌捕获探针和过量的沙门氏菌捕获探针,孵育；(2)加入过量的大肠杆菌信号探针和过量的沙门氏菌信号探针,孵育；(3)SERS检测拉曼信号强度；(4)将该拉曼信号强度代入根据标准溶液中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的浓度的Lg值和相应拉曼信号强度绘制标准曲线,得到待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量。实验证明,该方法可以同时检测待测食品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量且具有较高的准确性。本发明具有重要的应用价值。(The invention discloses a method for simultaneously detecting the contents of escherichia coli and salmonella in a sample to be detected. The method sequentially comprises the following steps: (1) adding excessive escherichia coli capture probes and excessive salmonella capture probes into a sample to be tested, and incubating; (2) adding excessive escherichia coli signal probes and excessive salmonella signal probes, and incubating; (3) SERS detects the intensity of Raman signal; (4) and substituting the Raman signal intensity into an Lg value and a corresponding Raman signal intensity according to the concentration of Escherichia coli O157: H7 and salmonella in the standard solution to draw a standard curve, so as to obtain the contents of Escherichia coli O157: H7 and salmonella in the sample to be detected. Experiments prove that the method can simultaneously detect the contents of Escherichia coli O157, H7 and salmonella in the food to be detected and has higher accuracy. The invention has important application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法。
背景技术
食源性致病菌是指存在于食品中的、能够导致人或动物患病的微生物。大肠杆菌和沙门氏菌是常见的食源性致病菌，易污染蔬菜、水果、鸡蛋、牛奶等食品。由食源性致病菌引起的食物中毒事件频频发生，造成巨大的损失。
对食源性致病菌的有效检测是避免食物中毒事件发生的重要手段之一。目前，针对食源性致病菌的常规检测技术主要有分离培养法、免疫学检测法(如酶联免疫法)、分子生物学检测法(如PCR法)，虽然可以满足对食源性致病菌的常规检测需求，但仍存在一定的缺点，例如分离培养法比较耗时，酶联免疫法和PCR法容易出现假阳性，而且也不能满足食品样本中多种致病菌同时、快速、高灵敏的现场检测需求。随着生物技术、工程技术、材料技术的发展，生物传感器检测法(如光学生物传感器)集合了选择性好、灵敏度高、速度快、成本低等特点，成为食源性致病菌检测的一项重要方法。
发明内容
本发明的目的是检测待测食品中的细菌含量。
本发明首先保护一种检测待测样品中不同细菌含量的试剂盒甲，可包括若干个用于检测不同细菌的试剂甲；
每个用于检测细菌的试剂甲可包括细菌抗体、单链DNA分子和拉曼信号报告物；
所述单链DNA分子从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段1和DNA片段2；
所述DNA片段1可由N个T、C或A组成，N为16以上的自然数；
所述DNA片段2可为所述细菌的适配体DNA；
每个用于检测细菌的试剂甲中，所述细菌抗体、所述DNA片段2和所述拉曼信号报告物均不同，用于检测不同的细菌。
每个用于检测细菌的试剂甲具体可由所述细菌抗体、所述单链DNA分子和所述拉曼信号报告物组成。
所述试剂盒甲具体可由若干个用于检测不同细菌的试剂甲组成。
上述任一所述试剂盒甲中，若干个用于检测不同细菌的试剂甲之间没有交叉反应。
上述任一所述试剂盒甲还可包括化合物B、可与所述化合物B结合的化合物A和金纳米材料。
上述任一所述试剂盒甲具体可由若干个用于检测不同细菌的试剂甲、化合物B、可与所述化合物B结合的化合物A和金纳米材料组成。
上述任一所述试剂盒甲还可包括纳米微球。
上述任一所述试剂盒甲具体可由若干个用于检测不同细菌的试剂、化合物B、可与所述化合物B结合的化合物A、金纳米材料和纳米微球组成。
本发明还保护一种检测待测样品中不同细菌含量的试剂盒乙，可包括若干个用于检测不同细菌的试剂乙；
每个用于检测细菌的试剂乙可包括化合物B修饰的细菌抗体、可与所述化合物B结合的化合物A修饰的纳米微球和信号探针；所述信号探针可为单链DNA分子和拉曼信号报告物共同标记的金纳米材料；
所述单链DNA分子从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段1和DNA片段2；
所述DNA片段1可由N个T、C或A组成，N为16以上的自然数；
所述DNA片段2可为所述细菌的适配体DNA；
每个用于检测细菌的试剂乙中，所述化合物B修饰的细菌抗体、所述可与化合物B结合的化合物A修饰的纳米微球和所述信号探针均不同，用于检测不同的细菌。
上述试剂盒乙中，所述信号探针的制备方法可为：将金纳米材料、单链DNA分子和拉曼信号报告物混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，沉淀即为信号探针。
每个用于检测细菌的试剂乙具体可由所述化合物B修饰的细菌抗体、所述可与化合物B结合的化合物A修饰的纳米微球和所述信号探针组成。
所述试剂盒乙具体可由若干个用于检测不同细菌的试剂乙组成。
上述任一所述试剂盒乙中，若干个用于检测不同细菌的试剂乙之间没有交叉反应。
上述任一所述单链DNA分子具体可由所述DNA片段1和所述DNA片段2组成。
上述任一所述DNA片段1中，N具体可为20。
本发明还保护一种检测待测样品中不同细菌含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)：
所述步骤(a)可包括如下步骤：
(a-1)将细菌抗体进行化合物B修饰，得到化合物B修饰的细菌抗体；将纳米微球进行可与所述化合物B结合的化合物A修饰，得到化合物A修饰的纳米微球；将化合物B修饰的细菌抗体和化合物A修饰的纳米微球进行连接，得到捕获探针；
(a-2)按照步骤(a-1)的方法，制备不同的捕获探针；不同的捕获探针组成捕获探针组；捕获探针组中每个捕获探针用于捕获一种细菌；
(a-3)将金纳米材料、单链DNA分子和拉曼信号报告物混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀；沉淀即为信号探针；
所述单链DNA分子从5’末端到3’末端依次包括DNA片段1和DNA片段2；
所述DNA片段1由N个T、C或A组成，N为16以上的自然数；
所述DNA片段2为细菌的适配体DNA；
(a-4)按照步骤(a-3)的方法，制备不同的信号探针；不同的信号探针组成信号探针组；信号探针组中每个信号探针用于检测一种细菌；
所述步骤(b)可包括如下步骤：
(b-1)向待测样品中加入过量的捕获探针组，孵育；
(b-2)完成步骤(b-1)后，加入过量的信号探针组，孵育；
(b-3)完成步骤(b-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(c)可包括如下步骤：
(c-1)向细菌标准溶液加入过量的捕获探针组，孵育；
(c-2)完成步骤(c-1)后，加入过量的信号探针组，孵育；
(c-3)完成步骤(c-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(d)：根据细菌标准溶液中的各个细菌浓度和相应拉曼信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(b-3)得到的拉曼信号强度代入所述标准曲线，得到待测样品中各个细菌的含量。
本发明还保护一种检测待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌含量的方法，可包括步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)：
所述步骤(1)可包括如下步骤：
(1-1)将大肠杆菌O157:H7单克隆抗体进行化合物B修饰，得到化合物B修饰的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体；将纳米微球进行可与所述化合物B结合的化合物A修饰，得到化合物A修饰的纳米微球；将化合物B修饰的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体和化合物A修饰的纳米微球进行连接，得到大肠杆菌捕获探针；
(1-2)将沙门氏菌单克隆抗体进行化合物B修饰，得到化合物B修饰的沙门氏菌单克隆抗体；将化合物B修饰的沙门氏菌单克隆抗体和化合物A修饰的纳米微球进行连接，得到沙门氏菌捕获探针；
(1-3)将金纳米材料、单链DNA分子甲和拉曼信号报告物甲混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀；沉淀即为大肠杆菌信号探针；
所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段3和DNA片段4；
所述DNA片段3由N个T、C或A组成，N为16以上的自然数；
所述DNA片段4的核苷酸序列可如SEQ ID NO.1自5’末端起第21至62位所示；
(1-4)将金纳米材料、单链DNA分子乙和拉曼信号报告物乙混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀；沉淀即为沙门氏菌信号探针；
所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段5和DNA片段6；
所述DNA片段5由N个T、C或A组成，N为16以上的自然数；
所述DNA片段6的核苷酸序列可如SEQ ID NO.2自5’末端起第21至60位所示；
所述步骤(2)可包括如下步骤：
(2-1)向待测样品中加入过量的大肠杆菌捕获探针和过量的沙门氏菌捕获探针，孵育；
(2-2)完成步骤(2-1)后，加入过量的大肠杆菌信号探针和过量的沙门氏菌信号探针，孵育；
(2-3)完成步骤(2-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(3)可包括如下步骤：
(3-1)向大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的标准溶液加入过量的大肠杆菌捕获探针和过量的沙门氏菌捕获探针，孵育；
(3-2)完成步骤(3-1)后，加入过量的大肠杆菌信号探针和过量的沙门氏菌信号探针，孵育；
(3-3)完成步骤(3-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(4)：根据标准溶液中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的浓度和相应拉曼信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(2-3)得到的拉曼信号强度代入所述标准曲线，得到待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量。
本发明还保护一种检测待测样品中大肠杆菌O157:H7含量的方法，可包括步骤(f)、步骤(g)、步骤(h)和步骤(i)：
所述步骤(f)可包括如下步骤：
(f-1)将大肠杆菌O157:H7单克隆抗体进行化合物B修饰，得到化合物B修饰的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体；将纳米微球进行可与所述化合物B结合的化合物A修饰，得到化合物A修饰的纳米微球；将化合物B修饰的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体和化合物A修饰的纳米微球进行连接，得到大肠杆菌捕获探针；
(f-2)将金纳米材料、单链DNA分子甲和拉曼信号报告物甲混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀；沉淀即为大肠杆菌信号探针；
所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段3和DNA片段4；
所述DNA片段3由N个T、C或A组成，N为16以上的自然数；
所述DNA片段4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1自5’末端起第21至62位所示；
所述步骤(g)可包括如下步骤：
(g-1)向待测样品中加入过量的大肠杆菌捕获探针，孵育；
(g-2)完成步骤(g-1)后，加入过量的大肠杆菌信号探针，孵育；
(g-3)完成步骤(g-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(h)可包括如下步骤：
(h-1)向大肠杆菌O157:H7标准溶液加入过量的大肠杆菌捕获探针，孵育；
(h-2)完成步骤(h-1)后，加入过量的大肠杆菌信号探针，孵育；
(h-3)完成步骤(h-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(i)：根据大肠杆菌O157:H7标准溶液中大肠杆菌O157:H7的浓度和相应拉曼信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(g-3)得到的拉曼信号强度代入所述标准曲线，得到待测样品中大肠杆菌O157:H7的含量。
本发明还保护一种检测待测样品中沙门氏菌含量的方法，可包括步骤(o)、步骤(p)、步骤(q)和步骤(r)：
所述步骤(o)可包括如下步骤：
(o-1)将沙门氏菌单克隆抗体进行化合物B修饰，得到化合物B修饰的沙门氏菌单克隆抗体；将纳米微球进行可与所述化合物B结合的化合物A修饰，得到化合物A修饰的纳米微球；将化合物B修饰的沙门氏菌单克隆抗体和化合物A修饰的纳米微球进行连接，得到沙门氏菌捕获探针；
(o-2)将金纳米材料、单链DNA分子乙和拉曼信号报告物乙混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀；沉淀即为沙门氏菌信号探针；
所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段5和DNA片段6；
所述DNA片段5由N个T、C或A组成，N为16以上的自然数；
所述DNA片段6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2自5’末端起第21至60位所示；
所述步骤(p)可包括如下步骤：
(p-1)向待测样品中加入过量的沙门氏菌捕获探针，孵育；
(p-2)完成步骤(p-1)后，加入过量的沙门氏菌信号探针，孵育；
(p-3)完成步骤(p-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(q)可包括如下步骤：
(q-1)向沙门氏菌标准溶液加入过量的沙门氏菌捕获探针，孵育；
(q-2)完成步骤(q-1)后，加入过量的沙门氏菌信号探针，孵育；
(q-3)完成步骤(q-2)后，SERS检测拉曼信号强度；
所述步骤(r)：根据沙门氏菌标准溶液中沙门氏菌的浓度和相应拉曼信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(p-3)得到的拉曼信号强度代入所述标准曲线，得到待测样品中沙门氏菌的含量。
上述任一所述“将金纳米材料、单链DNA分子和拉曼信号报告物混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀”可为“将金纳米材料和单链DNA分子混合，避光反应；加入拉曼信号报告物，混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀”。
上述任一所述“将金纳米材料、单链DNA分子和拉曼信号报告物混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀”中，金纳米材料、单链DNA分子、拉曼信号报告物、氯金酸和羟胺盐酸盐溶液体积比可为180:6:2:2:5，其中DNA溶液浓度可为80-100μM(如80-90μM、90-100μM、80μM、90μM或100μM)，拉曼信号报告物浓度可为0.5-2mM(如0.5-1mM、1-2mM、0.5mM、1mM或2mM)，氯金酸浓度可为0.8-1.2％(如0.8-1.0％、1.0-1.2％、0.8％、1.0％或1.2％)，羟胺盐酸盐溶液浓度可为0.35-0.45M(如0.35-0.40M、0.40-0.45M、0.35M、0.40M或0.45M)。
上述任一所述“将金纳米材料、单链DNA分子和拉曼信号报告物混合，避光反应；然后加入氯金酸和羟胺盐酸盐，反应，收集沉淀”的具体步骤可如下：
(K1)将金纳米材料水溶液、单链DNA分子水溶液和拉曼信号报告物水溶液混匀，室温避光静置反应；
(K2)完成步骤(K1)后，加入氯金酸水溶液和羟胺盐酸盐溶液，35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)振荡反应，收集沉淀。
所述步骤(K1)中，金纳米材料水溶液的浓度可为0.1nmol/L。金纳米材料水溶液的加入量可为90μL。单链DNA分子水溶液的浓度可为100μM。单链DNA分子水溶液的加入量可为2μL。拉曼信号报告物水溶液的浓度可为1mM。拉曼信号报告物水溶液的加入量可为0.5μL。
所述步骤(K1)中，反应的时间可为0.5-2h(如0.5-1h、1-2h、0.5h、1h或2h)。
所述步骤(K1)具体可为先将金纳米材料水溶液和单链DNA分子水溶液混匀，室温避光静置反应0.5-1h(如0.5h或1h)；然后加入拉曼信号报告物水溶液，混匀，室温避光静置反应0.5-1h(如0.5h或1h)。
所述步骤(K1)中，所述单链DNA分子可为单链DNA分子甲或单链DNA分子乙。
所述步骤(K1)中，当单链DNA分子为单链DNA分子甲时，所述拉曼信号报告物可为拉曼信号报告物甲。当单链DNA分子为单链DNA分子乙时，所述拉曼信号报告物可为拉曼信号报告物乙。
所述步骤(2)中，氯金酸水溶液的浓度可为1mM。氯金酸水溶液的加入量可为1.5μL。羟胺盐酸盐溶液的浓度可为0.4M。羟胺盐酸盐溶液的加入量可为0.25μL。
所述步骤(2)中，振荡反应具体可为150-250rpm(如150-200rpm、200-250rpm、150rpm、200rpm或250rpm)振荡1-2h(如1-1.5h、1.5-2h、1h、1.5hhuo 2h)。
所述步骤(b-1)、所述步骤(c-1)、所述步骤(2-1)、所述步骤(3-1)、所述步骤(g-1)、所述步骤(h-1)、所述步骤(p-1)、所述步骤(q-1)、所述步骤(b-2)、所述步骤(c-2)、所述步骤(2-2)、所述步骤(3-2)、所述步骤(g-2)、所述步骤(h-2)、所述步骤(p-2)和所述步骤(q-2)中，孵育具体可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、10-20rpm(10-15rpm、15-20rpm、10rpm、15rpm或20rpm)混匀40-50min(如40-45min、45-50min、40min、45min或50min)。
所述步骤(b-1)、所述步骤(c-1)、所述步骤(2-1)、所述步骤(3-1)、所述步骤(g-1)、所述步骤(h-1)、所述步骤(p-1)、所述步骤(q-1)、所述步骤(b-2)、所述步骤(c-2)、所述步骤(2-2)、所述步骤(3-2)、所述步骤(g-2)、所述步骤(h-2)、所述步骤(p-2)和所述步骤(q-2)中，孵育后还可包括获得捕获目标物的步骤；获得捕获目标物的目的为去除杂质，实现浓缩。所述捕获目标物的方法具体可为分离纳米微球。分离纳米微球可通过自然沉淀或离心实现。当纳米微球为磁性四氧化三铁纳米微球时，分离磁性四氧化三铁纳米微球可通过磁分离实现。
上述任一所述SERS检测的参数如下：设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。
上述任一所述化合物B可为生物素。
上述任一所述化合物A可为亲和素。所述亲和素可为链霉亲和素。
上述任一所述纳米微球可为磁性四氧化三铁纳米微球。
上述任一所述单链DNA分子甲具体可由所述DNA片段3和所述DNA片段4组成。
上述任一所述单链DNA分子甲的核苷酸序列可如SEQ ID NO.1所示。
上述任一所述单链DNA分子乙具体可由所述DNA片段5和所述DNA片段6组成。
上述任一所述单链DNA分子乙的核苷酸序列可如SEQ ID NO.2所示。
上述任一所述拉曼信号报告物甲可为DTNB。
上述任一所述拉曼信号报告物乙可为MBA。
上述任一所述细菌抗体可为细菌的单克隆抗体或细菌的多克隆抗体。
上文中，上述任一所述待测样品可先进行前处理得到待测样品处理液，再进行检测。
如果待测样品是固体，前处理的步骤可为：向待测样品中加入等质量的PBS缓冲液，混合，研磨，然后过滤，收集滤液；滤液即为待测样品处理液。过滤的目的可为除去直径大于1mm的颗粒。
如果待测样品是液体，前处理的步骤可为：向待测样品中加入等质量的PBS缓冲液，混合，得到待测样品处理液。
上述任一所述待测样品可为待测食品。所述待测食品可为黄瓜、鸡肉、饮料等。
上文中，根据标准溶液和相应拉曼信号强度绘制标准曲线具体可为根据标准溶液的Lg值和相应拉曼信号强度绘制标准曲线。
本文中的拉曼信号报告物是指可以产生拉曼光谱信号的物质，如DTNB、MBA。
上述任一所述金纳米材料具体可为不同形状的金纳米材料，如金纳米棒、金纳米颗粒、金纳米笼、金纳米壳、金纳米三角片、金纳米星、金纳米链。
本发明提供的方法可以同时检测待测样品中不同细菌含量且具有较高的准确性。在本发明的一个实施例中，本发明提供的方法可以同时检测待测食品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量且具有较高的准确性。与平板培养法相比，本发明所提供的方法还具有如下优点：1、快速，无需长时间的预培养；2、灵敏度高，最低检出限达到3cfu/mL；3、可以同时检测体系中的多种菌，而平板法不能快速区分多种菌。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中步骤二制备的信号探针的SRES检测。
图2为Au NR、Tag1和Tag2的UV-vis表征。
图3为Au NR、Tag1和Tag2的TEM表征。
图4为实施例1步骤三中检测大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的SERS谱图以及检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线和检测沙门氏菌的标准曲线的制备。
图5为实施例1步骤四中检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线和实施例1步骤五中检测沙门氏菌的标准曲线。
图6为实施例2特异性实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
链霉素修饰的磁性四氧化三铁纳米微球为Ocean nanotech公司的产品。DTNB和MBA均为Sigma公司的产品。大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体和沙门氏菌单克隆抗体均为Meridian Life Science公司的产品，产品目录号分别为B65001R和C86309M。1×PBSbuffer为Solarbio公司的产品。长臂生物素修饰试剂盒为Elabscience Biotechnology公司的产品。
实施例1、待测样品中大肠杆菌O157:H7和/或沙门氏菌的含量的检测
一、捕获探针的制备
1、大肠杆菌捕获探针的制备
(1)将大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体使用长臂生物素修饰试剂盒进行生物素修饰，得到浓度为1mg/mL的生物素修饰的大肠杆菌抗体。
(2)完成步骤(1)后，取30μL浓度为1mg/mL的链霉素修饰的磁性四氧化三铁纳米微球，用1×PBS buffer充分洗涤；然后加入0.6μL生物素修饰的大肠杆菌抗体，37℃、15rpm混匀反应45min，分离除去未结合的抗体，得到大肠杆菌单克隆抗体修饰的磁性四氧化三铁纳米微球，即大肠杆菌捕获探针(简称捕获探针1)。
2、沙门氏菌捕获探针的制备
(1)将沙门氏菌单克隆抗体使用长臂生物素修饰试剂盒进行生物素修饰，得到浓度为1mg/mL的生物素修饰的沙门氏菌抗体。
(2)完成步骤(1)后，取30μL浓度为1mg/mL的链霉素修饰的磁性四氧化三铁纳米微球，用1×PBS buffer充分洗涤；然后加入0.6μL生物素修饰的沙门氏菌抗体，37℃、15rpm混匀反应45min离心除去未结合的抗体，得到沙门氏菌单克隆抗体修饰的磁性四氧化三铁纳米微球，即沙门氏菌捕获探针(简称捕获探针2)。
二、信号探针的制备及其表征
单链DNA分子甲的核苷酸序列为：
单链DNA分子乙的核苷酸序列为：
1、大肠杆菌信号探针1的制备
(1)取烧瓶，先加入5mLCTAB水溶液(浓度为0.2mol/L)和5mL氯金酸水溶液(浓度为0.5mM)，混匀；然后加入600μL硼氢化钠水溶液(浓度为10mmol/L)，混匀，室温静置反应2h，得到种子溶液。
(2)完成步骤(1)后，另取一圆底烧瓶，先加入10mLCTAB水溶液(浓度为0.2mol/L)，再加入300μL硝酸银水溶液(浓度为4mmol/L)、10mL氯金酸水溶液(浓度为1mM)、140μL抗坏血酸AA水溶液(浓度为78.8mmol/L)和24μL种子溶液，混匀，30℃静置反应2h，得到金纳米棒。
(3)取完成步骤(2)的体系，离心，收集沉淀并溶于超纯水，得到浓度为0.1nmol/L金纳米棒溶液(以下简称Au NR)。
(4)取90μL金纳米棒溶液，加入2μL单链DNA分子甲水溶液(浓度为100μM)和0.5μLDTNB水溶液(浓度为1mM)，混匀，室温避光静置反应1h；之后加入1.5μL氯金酸水溶液(浓度为1mM)和0.25μL羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.4M)，37℃、200rpm振荡1.5h，离心，收集沉淀并溶于超纯水，得到浓度为0.1nmol/L的大肠杆菌信号探针1(以下简称Tag1(Au NR-apt1-DTNB)或Tag1)。
进行步骤(4)的目的是：对步骤(3)得到的Au NR进行再生长。
2、沙门氏菌信号探针2的制备
(1)同步骤1中(1)。
(2)同步骤1中(2)。
(3)同步骤1中(3)。
(4)取90μL金纳米棒溶液，加入2μL单链DNA分子乙水溶液(浓度为100μM)和0.5μLMBA水溶液(浓度为1mM)，混匀，室温避光静置反应1h；之后加入1.5μL氯金酸水溶液(浓度为1mM)和0.25μL羟胺盐酸盐溶液(浓度为0.4M)，37℃、200rpm振荡1.5h，离心，收集沉淀并溶于超纯水，得到浓度为0.1nmol/L的沙门氏菌信号探针2(以下简称Tag2(Au NR-apt2-MBA)或Tag2)。
进行步骤(4)的目的是：对步骤(3)得到的Au NR进行再生长。
3、大肠杆菌对比信号探针的制备
(1)同步骤1中(1)。
(2)同步骤1中(2)。
(3)同步骤1中(3)。
(4)取90μL金纳米棒溶液，加入2μL单链DNA分子甲水溶液(浓度为100μM)和0.5μLDTNB水溶液(浓度为1mM)，混匀，室温避光静置反应1h；离心，收集沉淀并溶于超纯水，得到浓度为0.1nmol/L的大肠杆菌对比信号探针(简称Au NR-DTNB)。
4、沙门氏菌对比信号探针的制备
(1)同步骤1中(1)。
(2)同步骤1中(2)。
(3)同步骤1中(3)。
(4)取90μL金纳米棒溶液，加入2μL单链DNA分子乙水溶液(浓度为100μM)和0.5μLMBA水溶液(浓度为1mM)，混匀，室温避光静置反应1h；离心，收集沉淀并溶于超纯水，得到浓度为0.1nmol/L的沙门氏菌对比信号探针(简称Au NR-MBA)。
5、SRES检测
用毛细管吸取少量DTNB水溶液(浓度为1mM)、MBA水溶液(浓度为1mM)、Tag1、Tag2、Au NR-DTNB或Au NR-MBA，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集。
检测结果见图1(DTNB为DTNB水溶液，MBA为MBA水溶液)。结果表明，DTNB水溶液和MBA水溶液的拉曼信号强度值均小于10，Au NR-DTNB和Au NR-MBA的拉曼信号强度值均在100左右，Tag1和Tag2的拉曼信号强度值均在400左右。结果表明，与Au NR-DTNB相比，Tag1中的DTNB进行了更好的包裹和吸附；与Au NR-MBA相比，Tag2中的MBA进行了更好的包裹和吸附；Tag1和Tag2更有利于SERS检测过程中拉曼热点的形成，获得更大的拉曼信号强度。
6、表征
(1)UV-vis表征
取微量比色皿，使用王水浸泡，超纯水清洗后干燥；然后向所述微量比色皿中加入Au NR、Tag1或Tag2(见图2中(b))，使用紫外可见分光光度计进行波谱扫描。设置扫描范围为220-800nm，步长0.1nm/s。
波谱扫描结果见图2中(a)。结果表明，Au NR有两个吸收峰，分别为520nm和650nm；Tag1的吸收峰发生红移，两个吸收峰分别为523nm和670nm；Tag2的吸收峰发生红移，两个吸收峰分别为536nm和678nm。由此可见，Au NR经过再生长后，金纳米棒的长径和短径均有所增加。有两个明显的吸收峰，说明合成的Tag1和Tag2形状均一。
(2)TEM表征
向铜网上滴加10μLAu NR、Tag1(Au NR-apt1-DTNB)或Tag2(Au NR-apt2-MBA)，2min后，用滤纸吸干多余溶液；然后将该铜网置于干净环境，至干燥。使用透射电镜进行样品形貌观察。
结果见图3((a)为Au NR，(b)为Tag1(Au NR-apt1-DTNB)，(c)为Tag2(Au NR-apt2-MBA))。结果表明，Au NR的短径为15-20nm，长径为55-60nm；Tag1(Au NR-apt1-DTNB)介导再生长，形貌为哑铃状，短径为20-25nm，长径为70-75nm；Tag2(Au NR-apt2-MBA)介导再生长，形貌为周身刺状金棒，短径为20-25nm，长径为75-80nm。由此可见，单链DNA分子甲和单链DNA分子乙均可以介导金纳米棒的生长，但得到不同的不规则尖锐形状。
根据上述结果，选择Tag1和Tag2进行后续实验。
三、待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量的检测
A、待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量的检测步骤如下：
1、检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线和检测沙门氏菌的标准曲线的制备
(1)取大肠杆菌O157:H7，用LB液体培养基培养，得到大肠杆菌菌液。取沙门氏菌，用LB液体培养基培养，得到沙门氏菌菌液。
(2)完成步骤(1)后，将大肠杆菌菌液和沙门氏菌菌液混合，得到大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌浓度均为101cfu/mL的溶液1、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌浓度均为102cfu/mL的溶液2、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌浓度均为103cfu/mL的溶液3、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌浓度均为104cfu/mL的溶液4、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌浓度均为105cfu/mL的溶液5和大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌浓度均为106cfu/mL的溶液6。
(3)完成步骤(2)后，取0.5mL溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5或溶液6，加入过量的捕获探针1(具体为加入30μL浓度为1mg/mL的捕获探针1)和过量的捕获探针2(具体为加入30μL浓度为1mg/mL的捕获探针2)，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集菌液。
(4)取步骤(3)收集的富集菌液，加入3倍体积的大肠杆菌信号探针1(具体为加入180μL浓度为0.4nmol/L的大肠杆菌信号探针1)和3倍体积的沙门氏菌信号探针2(具体为加入180μL浓度为0.4nmol/L的沙门氏菌信号探针2)，37℃、15rpm混匀反应45min，磁分离，收集富集菌液。
(5)用毛细管吸取少量步骤(4)收集的富集菌液，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集。
检测结果见图4中(a)(101cfu/mL为溶液1，102cfu/mL为溶液2，103cfu/mL为溶液3，104cfu/mL为溶液4，105cfu/mL为溶液5，106cfu/mL为溶液6；1331cm-1处的峰为与大肠杆菌O157:H7结合的Tag1上的DTNB产生，1074cm-1和1586cm-1处的峰为与沙门氏菌结合的Tag2上的MBA产生)。
以大肠杆菌O157:H7的lg值为横坐标，相应的拉曼信号强度为纵坐标，绘制检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线。检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线如图4中(b)所示，线性关系为：Y＝91.0X+185.7，R2＝0.9914。
以沙门氏菌的lg值为横坐标，相应的拉曼信号强度为纵坐标，绘制检测沙门氏菌的标准曲线。检测沙门氏菌的标准曲线如图4中(c)所示，线性关系为：Y＝64.2X+99.7，R2＝0.9800。
最低定量浓度＝3×最低检出浓度。大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的最低定量浓度均为10cfu/mL，因此，大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的最低检出限均为3cfu/mL。
2、检测待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量
(1)取待测样品，进行前处理，得到待测样品处理液。
如果待测样品是固体，前处理的方法为：向待测样品中加入等质量的1×PBSbuffer，混合，研磨，然后过滤(目的为除去直径大于1mm的颗粒)，收集滤液。滤液即为待测样品处理液。
如果待测样品是液体，前处理的方法为：向待测样品中加入等质量的1×PBSbuffer，混合，得到待测样品处理液。
(2)取0.5mL步骤(1)得到的待测样品处理液，加入过量的捕获探针1和过量的捕获探针2，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
(3)取步骤(2)收集的富集液，加入3倍体积的大肠杆菌信号探针1和3倍体积的沙门氏菌信号探针2，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
(4)用毛细管吸取少量步骤(3)收集的富集液，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集，获得待测样品处理液的拉曼信号强度。
(5)根据检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线和检测沙门氏菌的标准曲线即可计算得出待测样品处理液中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量，进一步获得待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量。
B、准确性检测
1、取待测样品(自来水、市售黄瓜或市售鸡肉)，先121℃高压灭菌15min，然后加入大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌，得到含大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的待测样品。含大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的待测样品中，大肠杆菌O157:H7的浓度为3.5×102cfu/mL，沙门氏菌的浓度为2.0×102cfu/mL。
2、完成步骤1后，采用步骤A中的方法检测含大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量。然后分别计算两种细菌的回收率，回收率(％)＝NSERS/N加入×100％，其中NSERS为SERS方法检测的细菌数量，N加入为加入的细菌数量。
3、完成步骤1后，采用平板培养法(记载于如下文献中：Biosensors andBioelectronics 74(2015)504–511)检测含大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的总含量。
4、完成步骤2和3后，计算偏差，偏差(％)＝(NSERS-N平板)/N平板×100％，其中NSERS为SERS方法检测的细菌数量，N平板为平板培养法检测的细菌数量。
检测结果见表1。本发明所提供的方法可以同时检测待测样品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的含量，且具有较高的准确性。同时，与平板培养法相比，本发明所提供的方法还具有如下优点：1、快速，无需长时间的预培养；2、灵敏度高，最低检出限达到3cfu/mL；3、可以同时检测体系中的多种菌，而平板法不能快速区分多种菌。
表1
四、待测样品中大肠杆菌O157:H7含量的检测
待测样品中大肠杆菌O157:H7含量的检测步骤如下：
1、检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线的制备
(1)取大肠杆菌O157:H7，用LB液体培养基培养，分别得到大肠杆菌O157:H7浓度101cfu/mL的溶液1、大肠杆菌O157:H7浓度为102cfu/mL的溶液2、大肠杆菌O157:H7浓度为103cfu/mL的溶液3、大肠杆菌O157:H7浓度为104cfu/mL的溶液4、大肠杆菌O157:H7浓度为105cfu/mL的溶液5和大肠杆菌O157:H7浓度为106cfu/mL的溶液6。
(2)完成步骤(1)后，取0.5mL溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5或溶液6，加入过量的捕获探针1，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集菌液。
(3)取步骤(2)收集的富集菌液，加入3倍体积大肠杆菌信号探针1，37℃、15rpm混匀反应45min，磁分离，收集富集菌液。
(4)用毛细管吸取少量步骤(3)收集的富集菌液，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集。
以大肠杆菌O157:H7的lg值为横坐标，相应的拉曼信号强度为纵坐标，绘制检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线。检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线如图5中(a)所示，线性关系为：Y＝105.4X+254.7，R2＝0.9942。
最低定量浓度＝3×最低检出浓度。大肠杆菌O157:H7的最低定量浓度为10cfu/mL，因此，大肠杆菌O157:H7的最低检出限为3cfu/mL。
2、待测样品中大肠杆菌O157:H7含量的检测
(1)同步骤三2中(1)。
(2)取0.5mL步骤(1)得到的待测样品处理液，加入过量的捕获探针1，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
(3)取步骤(2)收集的富集液，加入3倍体积的大肠杆菌信号探针1，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
(4)用毛细管吸取少量步骤(3)收集的富集液，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集，获得待测样品处理液的拉曼信号强度。
(5)根据检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线即可计算得出待测样品处理液中大肠杆菌O157:H7的含量，进一步获得待测样品中大肠杆菌O157:H7的含量。
五、待测样品中沙门氏菌含量的检测
待测样品中沙门氏菌含量的检测步骤如下：
1、检测沙门氏菌的标准曲线的制备
(1)取沙门氏菌，用LB液体培养基培养，分别得到沙门氏菌浓度101cfu/mL的溶液1、沙门氏菌浓度为102cfu/mL的溶液2、沙门氏菌浓度为103cfu/mL的溶液3、沙门氏菌浓度为104cfu/mL的溶液4、沙门氏菌浓度为105cfu/mL的溶液5和沙门氏菌浓度为106cfu/mL的溶液6。
(2)完成步骤(1)后，取0.5mL溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5或溶液6，加入过量的捕获探针2，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集菌液。
(3)取步骤(2)收集的富集菌液，加入3倍体积的沙门氏菌信号探针2，37℃、15rpm混匀反应45min，磁分离，收集富集菌液。
(4)用毛细管吸取少量步骤(3)收集的富集菌液，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集。
以沙门氏菌的lg值为横坐标，相应的拉曼信号强度为纵坐标，绘制检测沙门氏菌的标准曲线。检测沙门氏菌的标准曲线如图5中(b)所示，线性关系为：Y＝87.6X+59.5，R2＝0.9955。
最低定量浓度＝3×最低检出浓度。沙门氏菌的最低定量浓度为10cfu/mL，因此，沙门氏菌的最低检出限为3cfu/mL。
2、待测样品中沙门氏菌含量的检测
(1)同步骤三2中(1)。
(2)取0.5mL步骤(1)得到的待测样品处理液，加入过量的捕获探针2，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
(3)取步骤(2)收集的富集液，加入3倍体积的沙门氏菌信号探针2，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
(4)用毛细管吸取少量步骤(3)收集的富集液，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集，获得待测样品处理液的拉曼信号强度。
(5)根据检测沙门氏菌的标准曲线即可计算得出待测样品处理液中沙门氏菌的含量，进一步获得待测样品中沙门氏菌的含量。
实施例2、特异性检测
1、待测样品的制备
待测样品分别为待测样品一、待测样品二、待测样品三、待测样品四、待测样品五和待测样品六。
待测样品一为混合菌溶液。该混合菌溶液中，大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的浓度均为105cfu/mL，大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的浓度均为103cfu/mL。
待测样品二为浓度为105cfu/mL的大肠杆菌DH5α菌液。
待测样品三为浓度为105cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液。
待测样品四为浓度为105cfu/mL的副溶血弧菌菌液。
待测样品五为浓度为103cfu/mL的大肠杆菌O157:H7菌液。
待测样品六为浓度为103cfu/mL的沙门氏菌菌液。
2、完成步骤1后，分别向待测样品中加入等质量的1×PBS buffer，混合，依次得到待测样品处理液。
3、分别取0.5mL待测样品处理液，加入过量的捕获探针1和过量的捕获探针2，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
4、取步骤3收集的富集液，加入3倍体积的大肠杆菌信号探针1和3倍体积的沙门氏菌信号探针2，37℃、15rpm混匀45min，磁分离，收集富集液。
5、用毛细管吸取少量步骤4收集的富集液，置于激光共焦拉曼显微镜下。设置仪器光源为633nm，激光强度为20W，信号采集时间10s，2个循环。将光源聚焦到毛细管之后，关闭可见光，打开激光，进行信号采集，获得待测样品处理液的拉曼信号强度。
检测结果见图6(Mixture为待测样品一，大肠杆菌为待测样品二，金黄色葡萄球菌为待测样品三，副溶血弧菌为待测样品四，大肠杆菌O157:H7为待测样品五，沙门氏菌为待测样品六)。结果表明，本发明提供的方法可特异性的检测到大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的特征信号，对其它菌(如大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌)无明显的信号响应。
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tttttttttt tttttttttt ccggacgctt atgccttgcc atctacagag caggtgtgac 60
gg 62
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<211> 60
<212> DNA
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<400> 2
cccccccccc cccccccccc tatggcggcg tcacccgacg gggacttgac attatgacag 60