阅读说明：本技术 一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法 (Method for evaluating skin anti-aging efficacy based on combination of enzymology system and multiple in-vitro models ) 是由 杜娟 程树军 冯鉴鸿 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法,包括以下步骤：(一)基于化学水平的抗衰老功效预测；(二)基于细胞水平的抗衰老功效预测；(三)基于3D皮肤模型的抗衰老功效预测；(四)基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效预测模型的建立；该方法可全面体现受试物在酶学系统中的多水平的表达,非动物测试,可以对受试物进行全面的抗衰老功效预测,数据信息丰富,能广泛应用。(The invention discloses a method for evaluating skin anti-aging efficacy by combining multiple in-vitro models based on an enzymology system, which comprises the following steps: (one) chemical level-based prediction of anti-aging efficacy; (II) predicting anti-aging efficacy based on cell level; (III) anti-aging efficacy prediction based on the 3D skin model; (IV) establishing a prediction model for evaluating the skin anti-aging efficacy by combining a plurality of in-vitro models based on an enzymology system; the method can comprehensively reflect the multi-level expression of the tested substance in an enzymology system, can carry out non-animal test, can comprehensively predict the anti-aging efficacy of the tested substance, has rich data information, and can be widely applied.)

一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的 方法

技术领域

本发明属于皮肤抗衰老评价技术领域，具体涉及一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法。

背景技术

皮肤作为人体与外界接触的屏障，对人体健康起着重要的保护作用。皮肤衰老是一个复杂的多因素综合作用的过程。皮肤衰老分为内源性衰老和外源性衰老，其中年龄引起的自然衰老为内源性老化。主要表现为皮肤干燥、皱纹、松弛、下垂。外源性衰老主要为环境因素引起的，包括紫外线辐射、空气污染物、细颗粒物(PM2.5,P10)、臭氧、气溶胶、吸烟，接触化学有害物质等。其中，紫外线辐射和PM2.5引起皮肤衰老外源性主要因素，长期暴露于紫外线引起的皮肤衰老也称为皮肤光老化。通常表现为皮肤色素沉着、皮革状、干燥、较深的皱纹。

皮肤衰老的内源性机制非常复杂，比较有代表性的衰老学说主要包括自由基学说、损伤学说、交联学说、神经内分泌学说和端粒学说。外源性过程主要是紫外线照射引起的，发生的途径主要包括诱导蛋白激酶信号通路活化、诱导活性氧生成、激活表皮细胞生长因子和诱导金属蛋白酶类表达。具体作用机制为：紫外线作用后，皮肤组织内活性氧水平明显上升，直接导致DNA损伤或抑制酪氨酸磷酸酯酶(PTP)，并激活基质金属蛋白酶(MMP)基因。活性蛋白-1(AP-1)是一种包含c-Fos和c-Jun杂合二聚体的转录因子复合物，紫外线亦可直接上调转录因子c-Jun并下调视黄酸(RA)受体，从而降低RA对AP-1的抑制作用，而AP-1过度激活将引起MMP表达增加和胶原降解。此外，紫外线还可改变核因子κB(NF-κB)和转化生长因子β(TGF-β)表达，而这些分子的表达与胶原合成、降解及炎性细胞因子产生有关，其中涉及透明质酸酶、胶原酶等多种酶活性的变化。另外，皮肤对紫外线的吸收可直接导致细胞的氧化损伤，包括细胞壁、脂质膜、线粒体和DNA的损伤，最终引发皮肤光老化。

皮肤抗衰老已成为药品和护肤化妆品研究的热点，市场上出现很多宣传可以延缓皮肤衰老的产品，但对其是否能达到宣称的效果至今尚无标准化的评价体系。目前对于化妆品中原料或者产品抗衰功效，法规并没有要求用相应的体外方法评价其功效，更多的是采用人体评价和动物实验。若能在人体评价或动物实验前采用体外方法对产品的安全性和有效性进行初步的评估，不仅可以提供实验室数据的支持，而且有助于提高产品的开发效率，对于后续人体评价和产品上市更具保障。因此，建立标准化的抗衰老体外检测筛查体系和方法有利于对化妆品原料及产品的功效进行评价。

利用适宜的生物学系统(细胞、动物或人体组织)进行药理和毒理测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的需要。在个人护理用品的安全性和有效性评价中，传统的评价实验常用动物进行，不仅试验周期长，成本高，会给动物造成极大的痛苦，而且鉴于动物皮肤结构功能与人皮肤存在差异，动物试验的结果与人的相关性较差。另外，人体评价的涉及对象是人体，不可避免地面临伦理道德、安全性与科学性等问题。近20年来，化妆品的皮肤安全和效果测试逐渐转向不再以动物模式为基础的毒理学系统进行，而是采用来源于正常人的皮肤细胞或组织，或利用人的皮肤细胞体外重建的皮肤模型。

体外抗衰老功效测试根据所用系统可分为化学水平、细胞水平及3D皮肤模型水平三个维度。化学测试主要分为两大类，一类是针对应激过程中起关键作用的自由基，把检测自由基水平的降低或清除自由基的能力作为抗衰老功效的证据，这些抗衰老的化学检测方法通常以易于氧化的底物为测试系统，加入具有抗氧化性质的受试物发生化学反应形成氧化产物(如各种活性氧和自由基)，然后加入受试物检测其自由基清除能力作为判断依据。例如自由基清除能力测试(DPPH)是一种化学方法，测试体系由DPPH与受试物混合，30min孵育后比较吸光度，以DPPH去色百分比表示受试物自由基的清除效率。另一类是测试受试物对弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶的抑制作用以及对晚期糖基化终产物的清除能力等评价产品的抗衰功效。化学测试是在实验室人工模拟环境中进行，反应体系单一，并且由于不涉及活的生物体系，化学测试结果与体内实际应用效果存在差异。

细胞测试则是采用人原代成纤维细胞和角质细胞，细胞系与正常人体来源的细胞在形态和基因结构方面接近，所以原代分离的皮肤细胞更能有效代表人体使用的实际情况。例如弹性蛋白酶抑制试验是一种细胞测试方法，采用物理方式(UVA或UVB照射)或化学方式(H₂O₂)建立细胞老化模型，在进行老化模型前加入受试物予以保护作用，计算弹性蛋白酶的抑制率。细胞测试是基于二维水平对产品的筛查，操作简单、费用低、可大量应用。但细胞呈平面生长无法构建出一个真实立体的微环境，且不能反映出样品的透皮性，因此需要更进一步的验证。

利用体外重建的组织工程化皮肤是毒性和功效评价的另一途径，目前皮肤模型按照复杂程度分为表皮模型、真皮模型和全层模型，比较常见的是表皮模型，主要用于药品、化妆品和皮肤刺激试验等。例如，Bila等将保湿霜涂于EpiDerm模型上进行自由基吸收能力的测试。这些三维重建的组织工程化皮肤少数已实现商业化供应，为皮肤抗衰老的功效评价提供了材料来源，但其价格昂贵，短期无法实现大规模应用，并且抗衰老作用的全层皮肤模型存在多细胞共培养技术不成熟、组织结构较简单、各细胞层分化不良以及标志物不规则表达等缺陷，因此需要进一步改进。

上述三个维度的化妆品原料及终产品抗衰老功效评价的体外方法都存在一定的局限性，并且缺少权重分析和决策策略，应当深入研究建立分层逐步模型，或开发可行的整合测试策略。另外，衰老的机制非常复杂，评价终点的选择和合理组合是解决方法实用性的两大因素。基于酶学体系的抗衰老策略以衰老过程中限制性的酶谱变化为依据，选择关键酶进行组合测试。为体外抗老化产品功效产品的评价提供解决方案，具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，该方法基于皮肤老化过程中的酶学原理，组合化学测试、细胞测试和3D皮肤模型测试三种维度的体外系统，并建立了权重分析和决策策略，筛查化妆品、植物提取物等原料及产品在不同水平的酶学模型中的抗衰老安全和功效评估，对于实现产品功效的初筛、提高评估的准确性和节约检测的成本具有重要意义。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，包括以下步骤：

(一)基于酶学系统在化学水平方面抗衰老功效预测：

采用弹性蛋白酶抑制试验、胶原蛋白酶抑制试验、基质金属蛋白酶-1抑制试验或透明质酸酶抑制试验来确定受试物是否具有抗衰老作用，设置不同浓度的受试物，加入上述不同酶，不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之则不具有抗衰老作用；

(二)基于酶学系统在细胞水平方面抗衰老功效预测：

(2.1)正常人皮肤原代细胞的分离、培养和鉴定：以离体***为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人皮肤原代细胞；

(2.2)受试物的配制及受试物浓度的确定：将受试物配制一组具有浓度梯度的溶液，当正常人原代细胞的细胞密度长至80％时，将该组具有浓度梯度的受试物，分别加入多个正常人原代细胞中形成受试物组，并分别设置空白对照以及阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，用酶标仪测试各组的吸光度，按照公式：细胞活性＝(受试物吸光度值－空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取细胞活性＞80％的受试物浓度为最高试验浓度，以最高试验浓度或连续向下稀释2-3个浓度进行测试；

(2.3)紫外线诱导辐射剂量的确定：正常人原代细胞的细胞密度长至80％时，设置具有梯度的UVA或UVB辐照量，按具有梯度的UVA或UVB辐照量分别照射多个正常人原代细胞形成辐照组，并设置空白对照和阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，利用酶标仪测试辐照组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性＝(辐照组吸光度值－空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取细胞活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验；

(2.4)受试物抗衰老效果的确认：根据步骤(2.2)确定的受试物浓度和步骤(2.3)中确定的UVA或UVB辐照剂量，待正常人原代细胞长至80％时，分别设立分别设立空白对照、阴性对照、阳性对照、辐照组和实验组，利用酶标仪测试各组的同步骤(一)中弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶或透明质酸酶水平，并根据测试结果，判断各产品的抗衰老效果，与辐照组相比，不同浓度的受试物与细胞酶水平变化呈现剂量-效应关系，且一个或多个浓度变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之，则不具有抗衰老作用；

(三)基于酶学系统在3D皮肤模型方面的抗衰老功效预测：

(3.1)3D皮肤模型的建立：3D皮肤模型购买获得或实验室根据常规方法自备；

(3.2)受试物的配制及受试物浓度的确定：除采用3D皮肤模型外，其余同步骤(2.2)；

(3.3)紫外线诱导辐射剂量的确定：除采用3D皮肤模型外，其余同步骤(2.3)；

(3.4)受试物抗衰老效果的确认：除采用3D皮肤模型外，其余同步骤(2.4)；

(四)基于酶学系统组合多种体外方法评价皮肤抗衰老功效预测模型的建立：

在该基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法中：

可选地，本发明步骤(一)～步骤(三)中所述受试物是可能具有皮肤抗衰老作用的原料、药品或产品，比如所述受试物为化妆品、植物提取物、药品、食品添加剂、农药、生物制品或化学品等。

可选地，用于溶解受试物的溶剂按照优先顺序可以为MEM培养基/DMEM培养基、PBS、无血清培养基、二甲基亚砜或无水乙醇，应用时根据受试物的特点选择具体的溶剂和溶解方法。

可选地，本发明可以采用下述常规的弹性蛋白酶抑制试验、胶原蛋白酶抑制试验、基质金属蛋白酶-1抑制试验和透明质酸酶抑制试验中的任意一种来确定受试物是否具有抗衰老作用。

作为其中的一种优选的实施方式，列举如下：

弹性蛋白酶抑制试验：将100μL的0.2mol/L的tris-HCl缓冲液(Ph＝8.0)，25μL的10mmol/L的MAAPVN(N-甲氧基丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-4-硝基苯胺，英文名N-(methoxysuccinyl)-ala-ala-pro-val-4-nitroanilide，是弹性蛋白酶的底物)和50μL的受试物混匀，在25℃条件下孵育15min；再加入25μL的0.3U/mL的弹性蛋白酶(活性最高)继续孵育15min。酶标仪在410nm条件下检测OD值，并通过以下公式计算抑制率。EGCG(Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)为阳性对照。抑制率(％)＝[(对照组吸光度-样品组吸光度)/对照组吸光度]×100％。不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之，则不具有抗衰老作用。

胶原蛋白酶抑制试验：用茚三酮反应监测受试物被胶原蛋白酶片段化后的肽的量，将胶原蛋白Ⅰ(胶原蛋白Ⅰ可商品购买，来源于牛跟腱或小鼠尾巴，是胶原蛋白酶的底物)与TES(pH7.5,含Tris-HCl、EDTA和SDS)缓冲液、稀释的受试物、胶原蛋白Ⅳ混匀，在37℃条件下孵育5h，然后再2000rpm条件下离心5min。收集上清液，将其与茚三酮混匀，在80℃加热10min后冷却。溶液与异丙醇按1:1的比例混合，在4℃，12000rpm下离心10min。上清液加入到96孔板中，在600nm下检测其吸光度。计算抑制率。以EGCG为阳性对照。抑制率(％)＝[(对照组吸光度-样品组吸光度)/对照组吸光度]×100％。不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之，则不具有抗衰老作用。

基质金属蛋白酶-1抑制试验：用200μL的缓冲液稀释1μL的抑制剂NNGH(N-异丁基-N-4-甲氧基苯基磺酰基-甘氨酰基异羟肟酸，是基质金属蛋白酶-1的底物)。每孔加入10μL的底物，再加入20μL的稀释基质金属蛋白酶。混合物加热至室温。实验缓冲液用移液管按照以下方法加入培养板中：空白对照(无MMP1)为90μL,对照组(无抑制剂)为70μL，抑制剂(NNGH)为50μL。将培养板平衡到37℃后，每孔加入20μL的MMP1(除空白组)，然后再NNGH抑制剂孔中加入20μL的抑制剂。将测试的抑制剂加入到每个孔中后，将培养板在37℃孵育30min，以便抑制剂与酶的反应。最后在每个孔中加入10μL的底物，在412nm的条件下每间隔1min读数一次，持续读数10min。计算抑制率：抑制率(％)＝[(对照组吸光度-样品组吸光度)/对照组吸光度]×100％。不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之，则不具有抗衰老作用。

透明质酸酶抑制试验：将100μL的透明质酸酶、100μL的PBS缓冲液、50mmol/L的NaCl和0.01％的BSA与50μL的样品溶液混匀作为培养基，在培养基中37℃孵育10min。然后加入100μL的透明质酸酶溶液(0.03％，溶液300mmol/L的磷酸盐溶液，pH＝5.35)作为反映的开始，在37℃条件下孵育45min。未经水解的透明质酸用1.0mL的酸白蛋白溶液(0.1％的BSA溶液24mmol/L的乙酸钠和79mmol/L的乙酸，pH＝3.75)沉淀。然后将混合物在室温放置10min，用酶标仪在600nm处检测该混合物的吸光度。未加酶的测试组为最大抑制率的对照，抗坏血酸为阳性对照。计算抑制率：抑制率(％)＝[(对照组吸光度-样品组吸光度)/对照组吸光度]×100％。不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之，则不具有抗衰老作用。

可选地，步骤(2.1)中的正常人原代细胞的分离和培养是指离体***为原料，经分离培养获得正常人原代细胞；其中正常人原代细胞为正常人原代角质细胞和正常人原代人成纤维细胞，细胞的分离和培养为常规方法。

正常人皮肤原代细胞的细胞鉴定是指原代人角质细胞和成纤维细胞的特征鉴别，可以通过特征性蛋白免疫组化或基因学方法进行鉴定。常用的角质细胞免疫组化鉴定应为广谱角质蛋白(P-CK)阳性、人角蛋白17(CK17)阳性；人成纤维细胞免疫组化鉴定应为人波形蛋白(Vimentin)阳性。

可选地，步骤(2.2)～步骤(2.3)中实验各组分别是：空白对照组中仅含有细胞培养液；受试物组中含有受试物、正常人原代细胞和细胞培养液；阴性对照组中含有正常人原代细胞和细胞培养液。

可选地，步骤(2.2)中受试物的配制及受试物浓度的确定时，作为一种优选的实施方式，具体可以采用如下过程：待细胞在细胞瓶中密度长至80％时，以1×10⁴/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，根据受试物理化特性设定浓度范围，将稀释的皮肤抗衰老物质添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，受试物组，每组设6个复孔。如使用DMSO，乙醇等细胞毒性物质，其在稀释液中的终浓度不得高于0.5％。添加皮肤抗衰老物质后放入培养箱中继续孵化18～24小时，结束后每孔加20μL 5mg/ml MTT溶液，作用4小时后，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min，用酶标仪波长在570nm处测量每孔读数。

细胞活性计算：细胞活性＝(皮肤抗氧化剂孔OD值—空白对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值)；

选取细胞活性在80％以上的受试物浓度进行实验。

皮肤抗衰老功效的研究需要在外界因素造成皮肤模型氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，本发明采用紫外线照射。

可选地，步骤(2.3)中紫外线诱导辐射剂量的确定时，可以建立紫外线诱导皮肤细胞光损伤模型。作为一种优选的实施方式，具体可以采用如下过程：待细胞在细胞瓶中密度长至80％时，以1×10⁴/孔将细胞铺96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，使用PBS替换培养基，将96孔板置于4℃平整冰袋上，使用照度计测量UVA或UVB辐照强度，每个辐照剂量设6个复孔。辐照后将PBS更换为新培养基，后放入培养箱中继续孵化18～24小时，孵化结束后每孔加5mg/mL MTT溶液20μL，作用4小时，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min，用酶标仪波长在570nm处测量每孔读数。

细胞活性计算：细胞活性＝(紫外线照射正常细胞OD值—空白对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值)×100％。选取细胞活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验。

本发明所述的MTT英文全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，MTT比色法是一种常用检测细胞存活和生长的方法。

可选地，步骤(2.4)受试物抗衰老效果的确认时，根据步骤(2.2)确定的皮肤抗衰老物质浓度和步骤(2.3)中确定的UVA或UVB辐照剂量，待正常人原代细胞长至80％时，设立未辐照组(阴性对照)、辐照后加皮肤抗衰老受试物组(受试物组)以及辐照后不加皮肤抗衰老受试物组(模型组)，开启UVA或UVB辐射后，测试各组的弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶、胶原蛋白酶和透明质酸酶水平，并根据测试结果，判断产品的抗衰老效果。

作为一种优选的实施方式，细胞水平抗衰老过程具体可以采用如下过程：待细胞在75cm²的细胞瓶中密度长至80％时，以6.4×10⁵/孔将细胞铺于12孔板中，放入培养箱中孵育24小时，设未辐照皿，辐照后加抗衰老受试物皿，及辐照后不加抗衰老受试物皿。照度计测量UVA或UVB辐照强度，辐照前使用常温PBS清洗培养皿1次，未辐照皿与辐照皿处理一致，辐照皿使用PBS替代培养基，未辐照皿更换新培养基后放于培养箱中。辐照皿放置于平整的4℃冰袋上，辐照后添加抗衰老受试物，避光，于细胞培养箱中继续孵化18-24小时。

本发明根据步骤(2.4)中根据各组的细胞弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶或透明质酸酶水平测试结果，经统计学分析，判断受试物抗衰老程序如下：与模型对照(辐照组)相比，不同浓度的受试物与细胞酶水平变化呈现剂量-效应关系，且一个或多个浓度变化水平具有统计学意义(P<0.05)，预测该物质具有抗衰老作用，反之，则不具有抗衰老作用。

可选地，步骤(2.2)～(2.4)中用酶标仪在550～570nm处分别测试各组的吸光度。

可选地，步骤(2.3)中确定的辐照剂量为：UVA辐射强度为8～10J/cm²，UVB辐照强度为0.6～0.8J/cm²。

可选地，步骤(2.2)～步骤(2.4)中所述的阴性对照中含有正常人原代细胞和正常人原代细胞的培养液并不经紫外线照射，所述的空白对照中仅含有正常人原代细胞的培养液并不经紫外线照射；步骤(2.4)中所述阳性对照中含有已知的抗衰老物质、正常人原代细胞和正常人原代细胞的培养液并经紫外线照射，所述辐照组中含有正常人原代细胞和正常人原代细胞的培养液并经紫外线照射，所述受试物组含有受试物、正常人原代细胞和正常人原代细胞的培养液并经紫外线照射。

其中阴性对照(未辐照组)、辐照组(模型组，不加受试物)、受试物组(辐照后加相应的受试物)、阳性对照(辐照后加阳性物质；辐照后加EGCG)。这些用词之间可以相互对应。

可选地，步骤(3.1)中3D皮肤模型购买获得或实验室自备，但模型应符合质控标准。试剂盒为12孔或24孔，取含有皮肤模型的培养板，每孔加入维持培养基1-2mL/孔，将皮肤模型移至含新鲜培养基的培养孔中，置于37℃，5％CO2培养过夜。质控标准为：检查商品化试剂盒的生产日期、批号、pH值、试剂盒温度、检测培养液的温度、维持培养液温度等。

可选地，步骤(3.2)中受试物的配制及受试物浓度的确定具体包括以下步骤：将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，受试物形成受试物组，同时设立阴性对照组和空白对照组，待皮肤模型与MTT反应3h后，取出皮肤模型后在各组中分别加入酸性异丙醇，避光过夜后用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算皮肤模型活率，皮肤模型活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％。

皮肤抗衰老功效的研究需要在外界因素造成皮肤模型氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，应选取皮肤模型活性＞80％的受试物浓度为最高试验浓度；以最高浓度或连续向下稀释2-3个浓度进行测试。

可选地，步骤(3.3)中紫外线诱导辐射剂量的确定，具体包括以下步骤：设置具有梯度的UVA或UVB辐照量，按具有梯度的UVA或UVB辐照量分别照射皮肤模型，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测试紫外线照射正常皮肤模型、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：皮肤模型活性＝(紫外线照射正常皮肤模型组吸光度值—空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取皮肤模型活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验。

可选地，步骤(3.4)中受试物抗衰老效果的确认，具体包括以下步骤：根据步骤(3.2)确定的受试物浓度和步骤(3.3)中确定的UVA或者UVB辐照剂量，分别设立空白对照、阴性对照、模型对照、阳性对照和受试物组，以正常皮肤模型经紫外线照射前添加EGCG为阳性对照，测试各组的弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶和透明质酸酶水平，并根据测试结果，判断各产品的抗衰老效果。

可选地，步骤(3.2)～(3.4)中用酶标仪在550～570nm处分别测试各组的吸光度。

可选地，步骤(3.3)中确定的辐照剂量为：UVA辐射强度为8～10J/cm²，UVB辐照强度为0.6～0.8J/cm²。

可选地，步骤(3.4)中结果判定时，具体包括：与模型对照(辐照组)相比，不同浓度的受试物与细胞酶水平变化呈现剂量-效应关系，且一个或多个浓度变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用。

可选地，步骤(3.2)～步骤(3.4)中所述的阴性对照中含有3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并不经紫外线照射；所述的空白对照中仅含有3D皮肤模型的培养液并不经紫外线照射；步骤(3.4)中所述阳性对照中含有已知的抗衰老物质、3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并经紫外线照射；所述辐照组中含有3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并经紫外线照射；所述受试物组含有受试物、3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并经紫外线照射。

可选地，所述已知的抗衰老物质为表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)、维生素E或维生素C或其他已知的抗衰老活性物质。

可选地，步骤(2.4)中以及步骤(3.4)中利用ELISA试剂盒测试弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶或透明质酸酶水平。

可选地，步骤(四)中基于权重的原则，基于3D皮肤模型的抗衰老功效预测＞基于细胞水平的抗衰老功效预测＞基于化学水平的抗衰老功效预测，在三种抗衰老功效预测不一致的情况下，以权重高的抗衰老功效预测为主要判断依据。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明使用体外培养的多种正常人皮肤细胞，培养技术成熟，原代***增殖能力强、标准化程度高、批间差异小，具有与体内相同的活性和功能；

(2)本发明利用正常健康人皮肤细胞比动物或人源的细胞系获得的结果更可信；从定性和定量两方面评价待测物质的毒性作用和抗衰老功效，方法重复性好；

(3)本发明组合多种体外方法，利用紫外线诱导皮肤细胞的老化模型，模拟人体皮肤暴露于紫外线的情况，通过加入抗衰老物质，判定其能否保护受诱导的细胞免于光损伤。该模拟方法能够较为直观的反应紫外线老化作用及抗衰老物质对于皮肤的作用，敏感程度高，能满足常规的抗衰老物质筛检试验。

(4)本发明基于光老化的酶谱原理，从化学、细胞、3D皮肤三个维度，考虑证据权重原则，综合判定抗衰老物质是否具有作用，既能满足活性原料潜在的毒性检测的需要，又能分析其抗体衰老功能的强弱及可能机制。

(5)本发明建立的组合测试策略可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、化妆品、药品等产品中抗衰老物质的毒性和功效试验；组合策略方法快速、精准、科学，可以对物质进行科学有效的筛查。

具体实施方式

以下实施例中采用的各原料如试剂、培养液等，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1基于化学水平、细胞水平、3D皮肤模型的方法评估某品牌葡糖基芦丁的抗衰老作用评价

1.基于化学水平的原料抗衰老功效预测

弹性蛋白酶抑制试验：将100μL的0.2mol/L的tris-HCl缓冲液(Ph＝8.0)，25μL的10mmol/L的MAAPVN(N-甲氧基丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-4-硝基苯胺)和50μL的原料稀释液混匀，在25℃条件下孵育15min；再加入25μL的0.3U/mL的弹性蛋白酶(活性最高)继续孵育15min。酶标仪在410nm条件下检测OD值，并通过以下公式计算抑制率。EGCG((Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)为阳性对照。抑制率(％)＝[(对照组吸光度-样品组吸光度)/对照组吸光度]×100％。不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用。

化学水平弹性蛋白酶测试结果分析如下：

SEM：平均值的标准误差*P<0.05**P<0.01

葡糖基芦丁在50mg/ml时，有弹性蛋白酶抑制作用，有抗衰老作用。

2.基于细胞水平的葡糖基芦丁抗衰老功效预测

(1)正常人皮肤成纤维细胞的分离、培养和鉴定：以离体***为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人皮肤成纤维细胞；

(2)受试物的配制及受试物浓度的确定：葡糖基芦丁终浓度为100mg/mL，依次稀释成31.6mg/mL，10mg/mL，3.2mg/mL，1mg/mL，0.32mg/mL。将稀释的受试物添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个复孔。使用多通道移液器以减少孔间差异。置于培养箱中孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液(噻唑蓝)，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO(二甲基亚砜)，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min后。用酶标仪在570nm处测量步骤得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC₈₀(即80％细胞活性时受试物浓度)，按照公式：细胞活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％。

细胞毒性分析：得到试验结果为：100mg/L时细胞存活率为48.89％，31.6mg/L时为56.89％，10.01mg/L为80.91％，3.16mg/L时为89.69％，1.00mg/L时为92.36％、0.32mg/L时为97.26％。经统计得到葡糖基芦丁的，IC₈₀为10.58mg/mL，选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为抗衰老测试的最高试验浓度。

(3)紫外线诱导辐射剂量的确定

正常人原代皮肤成纤维细胞的密度长至80％时，以0.8×10⁵接种于96孔板中设置6-8J UVA辐照量，按梯度辐照正常人原代细胞组，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测试正常人原代细胞组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性＝(紫外线照射正常人原代细胞组吸光度值－空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取细胞活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验；

选取UVA 8J/cm²辐照剂量，进行造模处理。

(4)受试物抗衰老效果的确认

根据步骤(2)确定的受试物浓度为10.58mg/mL，步骤(3)中确定的UVA辐照剂量为8J/cm²，待正常人原代细胞长至80％时，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组(10.58mg/mL，5.29mg/mL，2.65mg/mL)以及辐照后不加受试物组，以正常人原代皮肤细胞经紫外线照射前添加EGCG(Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)为阳性对照，测试各组的弹性蛋白酶水平，并根据测试结果，判断葡糖基芦丁的抗衰老效果。与辐照后不加受试物组相比，不同浓度的受试物组弹性蛋白酶水平显著降低(P<0.05)，具有统计学意义，表明该物质具有抗衰老作用。

与辐照组相比*P<0.05**P<0.01

实验结果表明，5.29mg/mL葡糖基芦丁与10.58mg/mlL葡糖基芦丁与辐照后不加受试物组相比，不同浓度的受试物组弹性蛋白酶表达水平显著降低(P<0.05)，具有统计学意义，表明葡糖基芦丁具有抗衰老作用。

3.基于3D皮肤模型评价葡糖基芦丁的抗衰老作用

(1)皮肤模型的处理，3D皮肤模型购买获得，取12孔板，每孔加入维持培养基2mL/孔，将皮肤模型移至含新鲜培养基的培养孔中，置于37℃，5％CO₂培养过夜。

(2)受试物的配制及受试物浓度的确定

将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，待皮肤模型与MTT反应3h后，取出皮肤模型后在各组中分别加入酸性异丙醇，避光过夜后用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算皮肤模型活率，皮肤模型活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％。

皮肤抗衰老功效的研究需要在外界因素造成皮肤模型氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，本实施例采用紫外线照射，应选取皮肤模型活性＞80％的受试物浓度为最高试验浓度，因此葡糖基芦丁的受试物浓度为1mg/mL、10mg/mL；

(3)紫外线诱导辐射剂量的确定

设置具有梯度的UVA辐照量，按具有梯度的UVA辐照量分别照射皮肤模型，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测试正常皮肤模型、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：皮肤模型活性＝(紫外线照射正常皮肤模型组吸光度值—空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取皮肤模型活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验；

实验结果表明，选取10J/cm²进行抗衰老效果试验。

(4)受试物抗衰老效果的确认

根据步骤(3)确定的受试物浓度和步骤(4)中确定的UVA辐照剂量，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组以及辐照后不加受试物组，以正常皮肤模型经紫外线照射前添加表没食子儿茶素没食子酸酯为阳性对照，测试各组的弹性蛋白酶，并根据测试结果，判断各产品的抗衰老效果。实验结果表明，与辐照后不加受试物组相比，不同浓度的受试物组弹性蛋白酶水平显著降低(P<0.05)，具有统计学意义，表明该物质具有抗衰老作用。

与辐照组相比*P<0.05**P<0.01

实验结果表明，葡糖基芦丁在化学水平、细胞水平、3D皮肤模型均具有抗衰老作用，最终实验结论为葡糖基芦丁具有抗衰老作用。

实施例2基于化学水平、细胞水平、3D皮肤模型的方法评估某品牌生育酚衍生物的抗衰老作用评价

1.基于化学水平的原料抗衰老功效预测

透明质酸酶抑制试验：将100μL的透明质酸酶、100μL的PBS缓冲液、50mmol/L的NaCl和0.01％的BSA与50μL的样品溶液混匀作为培养基，在培养基中37℃孵育10min。然后加入100μL的透明质酸酶溶液(0.03％，溶液300mmol/L的磷酸盐溶液，pH＝5.35)作为反映的开始，在37℃条件下孵育45min。未经水解的透明质酸用1.0mL的酸白蛋白溶液(0.1％的BSA溶液24mmol/L的乙酸钠和79mmol/L的乙酸，pH＝3.75)沉淀。然后将混合物在室温放置10min，用酶标仪在600nm处检测该混合物的吸光度。未加酶的测试组为最大抑制率的对照，抗坏血酸为阳性对照。计算抑制率：抑制率(％)＝[(对照组吸光度-样品组吸光度)/对照组吸光度]×100％。不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用。

化学水平透明质酸酶测试结果分析如下：

与未加酶的测试组相比*P<0.05**P<0.01

实验结果表明，在化学水平，生育酚衍生物无透明质酸酶抑制作用，无抗衰老作用。

2.基于细胞水平的生育酚衍生物抗衰老功效预测

(1)正常人角质细胞的分离、培养和鉴定：以离体***为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人角质细胞；

(2)受试物的配制及受试物浓度的确定：生育酚衍生物终浓度为100mg/mL，依次稀释成31.6mg/mL，10mg/mL，3.2mg/mL，1mg/mL，0.32mg/mL。将稀释的受试物添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个复孔。使用多通道移液器以减少孔间差异。置于培养箱中孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液(噻唑蓝)，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO(二甲基亚砜)，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min后。用酶标仪在570nm处测量步骤得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC₈₀(即80％细胞活性时受试物浓度)，按照公式：细胞活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％

细胞毒性分析：得到试验结果为：100mg/L时细胞存活率为38.94％，31.6mg/L时为46.24％，10.01mg/L为65.25％，3.16mg/L时为84.69％，1.00mg/L时为86.36％、0.32mg/L时为95.32％。经统计得到生育酚衍生物的IC80为3.28mg/mL，选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为抗衰老测试的最高试验浓度。

(3)紫外线诱导辐射剂量的确定

正常人角质细胞的密度长至80％时，以1×10⁵接种于96孔板中设置0.6-0.8J UVB辐照量辐照正常人原代皮肤成纤维细胞组，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测试正常人原代细胞组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性＝(紫外线照射正常人原代细胞组吸光度值－空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取细胞活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验；

选取UVB 0.8J/cm²辐照剂量，进行造模处理。

(4)受试物抗衰老效果的确认

根据步骤(2)确定的受试物浓度为3.28mg/mL，步骤(3)中确定的UVB辐照剂量0.8J/cm²，待正常人原代细胞长至80％时，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组(3.28mg/mL，1.64mg/mL，0.82mg/mL)以及辐照后不加受试物组，以正常人原代皮肤细胞经紫外线照射前添加EGCG(Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)为阳性对照，测试各组的透明质酸酶水平，并根据测试结果，判断生育酚衍生物的抗衰老效果。实验结果表明，3.28mg/mL、1.64mg/mL、0.82mg/mL生育酚衍生物与辐照后不加受试物组相比，不同浓度的受试物组透明质酸酶抑制率与辐照组相比无统计学意义，表明生育酚衍生物无抗衰老作用。

与辐照组相比*P<0.05**P<0.01

3.基于3D皮肤模型评价生育酚衍生物的抗衰老作用

(1)皮肤模型的处理，3D皮肤模型购买获得，取12孔板，每孔加入维持培养基2mL/孔，将皮肤模型移至含新鲜培养基的培养孔中，置于37℃，5％CO₂培养过夜。

(2)受试物的配制及受试物浓度的确定

将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，待皮肤模型与MTT反应3h后，取出皮肤模型后在各组中分别加入酸性异丙醇，避光过夜后用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算皮肤模型活率，皮肤模型活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％。

皮肤抗衰老功效的研究需要在外界因素造成皮肤模型氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，应选取皮肤模型活性＞80％的受试物浓度为最高试验浓度，因此生育酚衍生物的受试物浓度为1mg/mL、10mg/mL。

(3)紫外线诱导辐射剂量的确定

设置具有梯度的UVB辐照量，按具有梯度的UVB辐照量分别照射皮肤模型，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测试正常皮肤模型、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：皮肤模型活性＝(紫外线照射正常皮肤模型组吸光度值—空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取皮肤模型活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验；

实验结果表明，选取0.8J/cm²进行抗衰老效果试验。

(4)受试物抗衰老效果的确认

根据步骤(3)确定的受试物浓度和步骤(4)中确定的UVB辐照剂量，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组以及辐照后不加受试物组，以正常皮肤模型经紫外线照射前添加表没食子儿茶素没食子酸酯为阳性对照，测试各组的透明质酸酶，并根据测试结果，判断各产品的抗衰老效果。

与辐照组相比*P<0.05

实验结果表明，10mg/mL、1mg/mL生育酚衍生物与辐照后不加受试物组相比，不同浓度的受试物组抑制率与辐照组相比无统计学意义，表明生育酚衍生物无抗衰老作用。

生育酚衍生物在化学水平、细胞水平、3D皮肤模型均无抗衰老作用，最终实验结论为生育酚衍生物无抗衰老作用。

实施例3基于化学水平、细胞水平、3D皮肤模型的方法评估某品牌胶原蛋白衍生物的抗衰老作用评价

1.基于化学水平的原料抗衰老功效预测

1.1胶原蛋白酶抑制试验：用茚三酮反应监测受试物被胶原蛋白酶片段化后的肽的量，将胶原蛋白Ⅰ与TES(pH7.5,含Tris-HCl、EDTA和SDS)缓冲液、稀释的受试物、胶原蛋白Ⅳ混匀，在37℃条件下孵育5h，然后再2000rpm条件下离心5min。收集上清液，将其与茚三酮混匀，在80℃加热10min后冷却。溶液与异丙醇按1:1的比例混合，在4℃，12000rpm下离心10min。上清液加入到96孔板中，在600nm下检测其吸光度。计算抑制率。以EGCG((Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)为阳性对照。抑制率(％)＝[(对照组吸光度-样品组吸光度)/对照组吸光度]×100％。不同浓度的受试物组抑制率水平显著升高(P<0.05)，具有统计学意义，表明该物质具有抗衰老作用。

化学水平胶原蛋白酶测试结果分析

SEM：平均值的标准误差*P<0.05**P<0.01

实验结果表明，在化学水平，胶原蛋白衍生物在50mg/ml时，有胶原蛋白酶抑制作用，有抗衰老作用。

2.基于细胞水平的胶原蛋白衍生物抗衰老功效预测

(1)正常人皮肤成纤维细胞的分离、培养和鉴定：以离体***为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人皮肤成纤维细胞；

(2)受试物的配制及受试物浓度的确定：胶原蛋白衍生物的终浓度为100mg/mL，依次稀释成31.6mg/mL，10mg/mL，3.2mg/mL，1mg/mL，0.32mg/mL。将稀释的受试物添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个复孔。使用多通道移液器以减少孔间差异。置于培养箱中孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μL，5mg/mL MTT溶液(噻唑蓝)，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO(二甲基亚砜)，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min后。用酶标仪在570nm处测量步骤得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC₈₀(即80％细胞活性时受试物浓度)，按照公式：细胞活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％

细胞毒性分析：得到试验结果为：100mg/L时细胞存活率为65.52％，31.6mg/L时为68.89％，10.01mg/L为95.65％，3.16mg/L时为96.58％，1.00mg/L时为94.23％、0.32mg/L时为98.26％。经统计得到葡糖基芦丁的，IC₈₀为50.64mg/mL，选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为抗衰老测试的最高试验浓度。

(3)紫外线诱导辐射剂量的确定

正常人原代皮肤成纤维细胞的密度长至80％时，以0.8×10⁵接种于96孔板中设置6-8J UVA辐照量，按梯度辐照正常人原代细胞组，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测试正常人原代细胞组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性＝(紫外线照射正常人原代细胞组吸光度值－空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取细胞活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验；

选取UVA 8J/cm²辐照剂量，进行造模处理。

(4)受试物抗衰老效果的确认

根据步骤(2)确定的受试物浓度为50.64mg/mL，步骤(3)中确定的UVA辐照剂量为8J/cm²，待正常人原代细胞长至80％时，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组(50.64mg/mL，25.32mg/mL，12.66mg/mL)以及辐照后不加受试物组，以正常人原代皮肤细胞经紫外线照射前添加EGCG(Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)为阳性对照，测试各组的胶原蛋白酶水平，并根据测试结果，判断葡糖基芦丁的抗衰老效果。与辐照后不加受试物组相比，不同浓度的受试物组抑制率水平显著升高(P<0.05)，具有统计学意义，表明该物质具有抗衰老作用。

与辐照组相比*P<0.05**P<0.01

实验结果表明，50.64mg/mL胶原蛋白衍生物与25.32mg/mL胶原蛋白衍生物与与辐照后不加受试物组相比，不同浓度的受试物组抑制率水平显著降低(P<0.05)，具有统计学意义，表明胶原蛋白衍生物具有抗衰老作用。

3.基于3D皮肤模型评价胶原蛋白衍生物的抗衰老作用

(1)皮肤模型的处理，3D皮肤模型购买获得，取12孔板，每孔加入维持培养基2mL/孔，将皮肤模型移至含新鲜培养基的培养孔中，置于37℃，5％CO₂培养过夜。

(2)受试物的配制及受试物浓度的确定

将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，待皮肤模型与MTT反应3h后，取出皮肤模型后在各组中分别加入酸性异丙醇，避光过夜后用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算皮肤模型活率，皮肤模型活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％。

皮肤抗衰老功效的研究需要在外界因素造成皮肤模型氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，应选取皮肤模型活性＞80％的受试物浓度为最高试验浓度，因此葡糖基芦丁的受试物浓度为1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL。

(3)紫外线诱导辐射剂量的确定

设置具有梯度的UVA辐照量，按具有梯度的UVA辐照量分别照射皮肤模型，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪在波长550nm～570nm范围内分别测试正常皮肤模型、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：皮肤模型活性＝(紫外线照射正常皮肤模型组吸光度值—空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取皮肤模型活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验；

实验结果表明，选取8J/cm²进行抗衰老效果试验。

(4)受试物抗衰老效果的确认

根据步骤(3)确定的受试物浓度和步骤(4)中确定的UVA辐照剂量，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组以及辐照后不加受试物组，以正常皮肤模型经紫外线照射前添加表没食子儿茶素没食子酸酯为阳性对照，测试各组的弹性蛋白酶，并根据测试结果，判断各产品的抗衰老效果。

与辐照组相比*P<0.05**P<0.01

实验结果表明，胶原蛋白衍生物在化学水平、细胞水平均具有抗衰老作用，3D皮肤模型无抗衰老作用，最终实验结论为生育酚衍生物可能有抗衰老作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。本发明虽然仅列举了部分化妆品原料。但本发明中提到的其他非单一成分体系，如可能抗衰老的护肤品原料，植物提取物(粗提取物、精提取物及其混合物)等也可以用本发明所述方法进行皮肤致敏检测。此处不再一一列举。