一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法
阅读说明：本技术 一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法 (Electrochemical sensing method for accurate detection of trace protein molecules ) 是由 李天保 张宝金 韦霜霜 孙丽丽 王进义 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及疾病标志物快速检测技术领域,具体涉及一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法。本发明基于磁性分子印迹和电信号转换策略,构建了一种能用于痕量蛋白分子灵敏检测的安培型电化学传感方法,首先,该方法通过磁性分子印迹技术保证了蛋白分子的特异性富集和分离；其次,通过生物偶联或金属配位作用,将电活性分子或离子蛋白分子结合,进行电信号转换；最后,通过电化学方法测定电活性物质的含量,进而实现非电活性蛋白分子的电化学分析检测。本发明综合利用磁性分子印迹技术和电化学传感技术,能简单、特异、准确、低成本实现复杂生物样品中多种痕量蛋白分子的高灵敏检测,适用于临床检验和重大疾病早期诊断方面。(The invention relates to the technical field of rapid detection of disease markers, in particular to an electrochemical sensing method for accurate detection of trace protein molecules. The invention constructs an ampere type electrochemical sensing method for sensitive detection of trace protein molecules based on magnetic molecular imprinting and electric signal conversion strategies, firstly, the method ensures the specific enrichment and separation of the protein molecules by a magnetic molecular imprinting technology; secondly, combining electroactive molecules or ionic protein molecules through biological coupling or metal coordination, and performing electric signal conversion; and finally, measuring the content of the electroactive substances by an electrochemical method, thereby realizing the electrochemical analysis and detection of the non-electroactive protein molecules. The invention comprehensively utilizes the magnetic molecular imprinting technology and the electrochemical sensing technology, can simply, specifically and accurately realize the high-sensitivity detection of various trace protein molecules in a complex biological sample at low cost, and is suitable for the aspects of clinical examination and early diagnosis of serious diseases.)
技术领域
本发明属于电化学分析与分离技术领域，具体涉及一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法。
背景技术
蛋白作为人体细胞和组织的重要成分，参与几乎所有生命过程，与多种疾病发生和发展密切相关。蛋白已作为疾病标志物被广泛用于癌症、心血管和传染病等重大疾病的临床诊断和病情评估。因此，开展蛋白精准检测研究，在重大疾病早期诊断、治疗和防控方面，有着非常重要的科学研究价值和临床应用价值。
现有蛋白检测方法主要依靠质谱、色谱、色谱-质谱联用、毛细管电泳、酶联免疫吸附、生物传感等。这些方法均不同程度受检测成本、效率、准确性等问题的限制，尚难以大范围推广应用于复杂生物样品中多种蛋白分子的精准联合检测，因此开发操作简单、成本低、特异性好、灵敏度高、易于推广应用的蛋白检测方法迫在眉睫。
电化学检测方法仪器便携、灵敏度高、准确性好、通量高、易于实现大批量样品的同时检测，已成为构建蛋白高效检测方法的首要选择。然而，现有电化学检测方法大都依赖于电极表面生物分子修饰，电极制备过程复杂、化学稳定性差、检测结果易受其它共存物质的干扰，进而可靠性尚难以达到实际应用的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法，其稳定性和可靠性优良，且能应用于血清样品中多种痕量蛋白标志物的精准检测，为疾病早期检测、精准诊断及疗效评估方面提供有效分析手段及数据支持。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法，其特征在于：首先制备磁性分子印迹纳米颗粒，并利用其实现目标蛋白的特异性富集；其次，将电活性分子或离子结合到纳米颗粒表面进行电信号转换；接着，通过电化学方法在磁性电极表面检测电活性物质的含量，实现目标蛋白的间接电化学检测；最后，输出并分析检测结果。
具体步骤为：
1)将蛋白分子溶解于含有磁性纳米材料及聚合单体的溶液当中，通过硅烷化反应，将蛋白分子键合到磁性纳米颗粒表面，并洗涤去除蛋白分子后制成磁性分子印迹纳米材料；
2)将磁性分子印迹纳米材料分散于待测液中，进行目标蛋白的特异性富集，待富集完成后利用磁铁简单实现分离和洗涤；
3)通过电活性分子与蛋白分子之间的生物偶联作用，将电活性分子结合到磁性分子印迹纳米材料表面，进行电信号转换，并将该材料吸附于磁性电极表面，进行电活性物质含量的电化学检测，实现蛋白分子的间接电化学检测；
4)通过金属配位作用，将电活性金属离子结合到磁性分子印迹纳米材料表面，进行蛋白分子的电信号转换，并将该纳米材料吸附于磁性电极表面，进行金属离子含量的电化学检测，进而实现蛋白分子的间接电化学检测。
进一步，步骤1)中：
磁性纳米材料为Fe3O4或Mn3O4为核心的壳核式纳米材料；
聚合单体为3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、正硅酸乙酯、3-氨基丙基三乙氧基硅烷和苯乙烯中的一种或几种；
进一步，步骤3)中：
生物偶联方法为戊二醛法、重氮法、碳二亚胺法中的一种或几种方法；
电活性分子为酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、氨基二茂铁中的一种或几种。
进一步，步骤4)中：
利用金属配位作用，将难以直接电化学检测的蛋白分子转换为能直接进行电化学检测的金属离子信号，进而实现氨基酸的间接电化学检测，所用金属离子为Cu2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ag+离子中的一种或几种，金属离子浓度为0.1～40mmol/L。
进一步，步骤3)和4)中电化学检测方法为溶出伏安、线性伏安、循环伏安、方波伏安、差分脉冲伏安或计时电流法中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明的优点为：
1)本发明综合利用磁性分子印迹技术和电化学传感技术，能简单、特异、准确、低成本实现复杂生物样品中多种痕量蛋白分子的高灵敏检测；
2)本发明利用电信号转换技术，简单实现了非电活性蛋白分子的电化学检测，且该方法具有很好的普适性；
3)磁性分子印迹技术的应用，极大地增强了电极材料的化学稳定性，降低了蛋白检测成本，提高了检测特异性；
4)电化学传感技术的应用，实现了复杂生物样品中多种痕量蛋白分子的高灵敏检测，特别是多通道电化学传感技术的进一步应用，将极大提高检测效率，保证检测准确度。因此，该方法在临床检验和重大疾病早期诊断方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1本发明基于磁性分子印迹和电信号转换策略的蛋白分子电化学传感方法原理示意图；
图2本发明实施例1中所制备磁性纳米颗粒的表征；其中：A为磁性分子印迹纳米颗粒Fe3O4@SiO2-MIP的扫描电镜和透射电镜图(右上角插图)，B为Fe3O4@SiO2-MIP施加磁场分离前后的对比图，C为Fe3O4和Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒的磁滞回线，D为Fe3O4和Fe3O4@SiO2-OVA纳米颗粒的红外光谱图；
图3本发明实施例1中卵清蛋白(OVA)分子印迹磁性纳米颗粒基于戊二醛交联酪氨酸的OVA检测数据；其中A为不同浓度下线性伏安叠加图，B为峰电流与OVA对数浓度的直线关系图，C为该方法对OVA的选择性测试结果；
图4本发明实施例2中癌胚抗原(CEA)分子印迹磁性纳米颗粒基于戊二醛交联酪氨酸的CEA检测数据；其中A为不同浓度下线性伏安叠加图，B为峰电流与CEA对数浓度的直线关系图，C为该方法对CEA的选择性测试结果；
图5本发明实施例3中甲胎蛋白(AFP)分子印迹磁性纳米颗粒基于Hg2+配位的AFP电化学检测数据；其中：A为不同浓度下溶出伏安叠加图，B为峰电流与AFP对数浓度的直线关系图，C为该方法对AFP的选择性测试结果；
图6本发明实施例4中CEA分子印迹磁性纳米颗粒基于Hg2+配位的CEA检测数据；其中：A为不同浓度下溶出伏安叠加图，B为峰电流与CEA对数浓度的直线关系图，C为该方法对CEA的选择性测试结果；
图7本发明实施实例5中C-反应蛋白(CRP)分子印迹磁性纳米颗粒基于Hg2+配位的CRP检测数据；其中：A为不同浓度下溶出伏安叠加图，B为峰电流与CRP对数浓度的直线关系图，C为该方法对CRP的选择性测试结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案并能予以实施，以下结合具体实施实例对本发明作进一步说明，但所列举实例不作为本发明的使用范围限定。
本发明工作原理如图1所示：首先制备磁性分子印迹纳米颗粒，并利用其实现目标蛋白的特异性富集；其次，将电活性分子或离子结合纳米颗粒表面进行电信号转换；接着，通过电化学方法在磁性电极表面检测电活性物质的含量，实现目标蛋白的间接电化学检测；最后，输出并分析检测结果。
本发明提供一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法的具体步骤为：
1)将一定量的蛋白分子溶解于含有磁性纳米材料及聚合单体的溶液当中，通过硅烷化反应，将蛋白分子键合到磁性纳米颗粒表面，并洗涤去除蛋白分子后制成磁性分子印迹纳米材料；
磁性纳米材料为Fe3O4或Mn3O4为核心的壳核式纳米材料；
聚合单体为3(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)、正硅酸乙酯(TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和苯乙烯(PS)中的一种或几种；
2)将磁性分子印迹纳米材料分散于待测液中，进行目标蛋白的特异性富集，待富集完成后利用磁铁简单实现分离和洗涤；
3)通过电活性分子与蛋白分子之间的生物偶联作用，将电活性分子结合到磁性分子印迹纳米材料表面，进行电信号转换，并将该材料吸附于磁性电极表面，进行电活性物质含量的电化学检测，实现蛋白分子的间接电化学检测；
利用生物偶联将电活性分子与蛋白分子结合，生物偶联方法为戊二醛法、重氮法、碳二亚胺法中的一种或几种方法；
电活性分子为酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、氨基二茂铁中的一种或几种。
4)通过金属配位作用，将电活性金属离子结合到磁性分子印迹纳米材料表面，进行蛋白分子的电信号转换，并将该纳米材料吸附于磁性电极表面，进行金属离子含量的电化学检测，进而实现蛋白分子的间接电化学检测。
利用金属配位作用，将难以直接电化学检测的蛋白分子转换为能直接进行电化学检测的金属离子信号，进而实现氨基酸的间接电化学检测，所用金属离子为Cu2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ag+离子中的一种或几种，金属离子浓度0.1～40mmol/L。
上述步骤3)和4)中电化学检测方法为溶出伏安、线性伏安、循环伏安、方波伏安、差分脉冲伏安或计时电流法中的一种或几种。
实施例1：
一种基于生物偶联和磁性分子印迹技术的卵清蛋白(OVA)电化学传感方法为：
S1 OVA蛋白磁性分子印迹纳米颗粒的制备
1.氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒的制备：首先，在烧杯中加入2.0g六水合三氯化铁，13.0g 1,6-己二胺和4.0g无水醋酸钠；其次，加入60mL乙二醇溶解，用磁力搅拌器搅拌均匀至溶液呈黄色且没有沉淀物；接着，将混合物倒入聚四氟乙烯高压反应器中，于200℃反应6h；最后，反应完成后冷却至室温，用水和乙醇分别清洗3次，并在50℃真空条件下干燥，制得氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒；
2.硼酸修饰磁性Fe3O4纳米颗粒的制备：首先，取0.40g的氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒和0.80g 2,4-二氟-3-甲酰基-苯硼酸混合于80mL甲醇中；其次，向上述溶液中加入1％W/W氰基硼氢化钠，于室温下机械搅拌12h(400rpm)；最后，将所得磁性纳米颗粒用水和乙醇分别洗涤3次后，50℃真空条件下干燥，制得硼酸修饰磁性Fe3O4纳米颗粒；
3.OVA蛋白表面定向印迹磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-OVA-MIP的制备：首先，将0.04g硼酸修饰磁性Fe3O4纳米颗粒超声分散于4.0mL缓冲溶液(PBS，pH 8.5)中；其次，加入200μLOVA储备液(1.0mg/mL)，室温震荡2h；随后，用PBS溶液(pH 8.5)洗涤磁性纳米颗粒，并将其分散于40mL PBS中；接着，加入60μL三甲基氧基苯基硅烷，室温搅拌3h后，再加入20μL正硅酸乙酯，室温搅拌反应4h；最后，将所得磁性纳米颗粒分散于0.1mol/L醋酸-十二烷基硫酸钠混合溶液中，振荡洗涤，去除模板蛋白分子，制得OVA蛋白表面定向印迹的磁性纳米颗粒，分散于PBS中保存备用；
参照图2A电镜表征结果所示，磁性分子印迹纳米颗粒具有壳核式结构，其粒径均一，直径约为100nm。参照图2B施加磁场前后照片所示，磁性纳米颗粒能在20s内实现分离。参照图2C磁滞回线测试结果所示，磁性分子印迹纳米颗粒的饱和磁化强度(Ms)值为51.0emu/g，磁化强度完全满足磁性分离的需要。参照图2D红外光谱表征结果所示，498cm-1、696cm-1和1097cm-1处的典型谱带分别对应于Si-O的弯曲振动，对称伸缩振动和反对称伸缩振动。1597cm-1处的特征峰属于糖蛋白、酪氨酸与戊二醛交联所形成的亚胺键，说明戊二醛与酪氨酸和糖蛋白发生交联反应。在1436cm-1、1515cm-1处为酪氨酸及糖蛋白上羧基基团的特征峰。以上表征结果均表明，成功制得实验所需磁性分子印迹纳米颗粒。
S2 OVA蛋白的富集：称取10mg磁性分子印迹纳米颗粒，将其加入OVA蛋白溶液中，室温振荡孵育6h，使OVA蛋白富集于磁性分子印迹纳米颗粒上的模板空腔内，并用PBS溶液磁性洗涤3次，得到富集OVA蛋白后的磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-OVA；
S3电信号转换：将富集OVA蛋白后磁性纳米颗粒分散于含有10％戊二醛和8.0mmol/L酪氨酸的混合溶液中，室温振荡2h，使戊二醛的两个醛基分别与蛋白和氨基酸上的氨基结合，制得酪氨酸修饰的磁性分子印迹纳米颗粒Fe3O4@SiO2-OVA-Tyr。
S4电化学检测：将Fe3O4@SiO2-OVA-Tyr纳米颗粒吸附于磁性玻碳电极表面，在0～1.1V范围内进行线性伏安扫描。参照图3A所示，在0.7V附近得到了酪氨酸的氧化电流，氧化电流随OVA浓度的增加而增加。参照图3B所示，在0.1～100ng/mL的浓度范围内，酪氨酸的氧化电流与OVA对数浓度呈现良好线性关系，线性公式为I＝0.109log(COVA)+0.444，线性相关性R2＝0.9970，表明该方法能用于OVA蛋白的间接电化学检测。参照图3C所示，选择性实验结果显示，该方法对癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、C-反应蛋白(CRP)、葡萄糖(Glc)等物质表现出了良好的抗干扰性能。
S5实际样品中OVA的检测：将磁性OVA分子印迹Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒分散于PBS稀释10倍后的血清样品中，重复上述S2～S4步骤，读取溶出伏安峰电流数据，通过S4步所得标准曲线计算样品中OVA的含量。参照表1所示，通过标准加入法，分别向血清样品中加入一1.0和100ng/mL OVA蛋白，重复上述S2～S4步骤，计算得其回收率分别为90.1％和111.3％，说明该方法可应用于血清样品中糖蛋白的检测。
表1实施例1采用本发明的检测方法测定血清中OVA含量的测试结果(n＝3)
实施例2
一种基于生物偶联和磁性分子印迹技术的癌胚抗原(CEA)电化学传感方法的步骤为：
S1 CEA蛋白磁性分子印迹纳米颗粒的制备
参照实施例1中S1步方法，制备氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒、硼酸修饰磁性Fe3O4纳米颗粒、CEA蛋白表面定向印迹的磁性Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒。
S2 CEA蛋白的富集：参照实施例1中S2步方法，将CEA印迹的磁性Fe3O4@SiO2-MIP加入含有CEA蛋白的溶液中，室温振荡孵育制得Fe3O4@SiO2-CEA磁性纳米颗粒；
S3电信号转换：参照实施例1中S3步方法，将电活性酪氨酸生物偶联到Fe3O4@SiO2-CEA磁性纳米颗粒表面，制得Fe3O4@SiO2-CEA-Tyr磁性纳米颗粒；
S4电化学检测：参照实施例1中S4步方法，将Fe3O4@SiO2-CEA-Tyr纳米颗粒吸附于磁性玻碳电极表面，进行线性伏安扫描。参照图4所示，氧化电流随CEA浓度的增加而增加(图4A)，且在CEA浓度10～100ng/mL范围内，氧化电流与其对数浓度呈现良好线性关系(图4B)，线性公式为I＝0.3481log(CCEA)+0.1185，线性相关性R2＝0.9969，表明该方法能用于CEA蛋白的间接电化学检测。选择性实验结果图3C显示，该方法对甲胎蛋白(AFP)、C-反应蛋白(CRP)、谷氨酸(Glu)、卵清蛋白(OVA)、尿酸(UA)、葡萄糖(Glc)等物质表现出了良好的抗干扰性能。
S5实际样品中OVA的检测：将磁性CEA分子印迹Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒分散于PBS稀释10倍后的血清样品中，重复上述S2～S4步骤，读取溶出伏安峰电流数据，通过S4步所得标准曲线计算样品中CEA的含量。参照表2所示，通过标准加入法，分别向血清样品中加入10和50ng/mL CEA蛋白，重复上述S2～S4步骤，计算得其回收率分别为98.9％和101.7％，说明该方法可应用于血清样品中糖蛋白CEA的检测。
表2实施例2采用本发明的检测方法测定血清中CEA含量的测试结果(n＝3)
实施例3
一种基于金属配位和磁性分子印迹技术的甲胎蛋白(AFP)电化学传感方法的步骤为：
S1 AFP蛋白磁性分子印迹纳米颗粒的制备
参照实施例1中S1步方法，制备氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒、硼酸修饰磁性Fe3O4纳米颗粒、AFP蛋白表面定向印迹的磁性Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒。
S2 AFP蛋白的富集：参照实施例1中S2步方法，将AFP印迹的磁性Fe3O4@SiO2-MIP加入含有AFP蛋白的溶液中，室温振荡孵育制得Fe3O4@SiO2-AFP磁性纳米颗粒；
S3电信号转换：将S2步所得Fe3O4@SiO2-AFP分散于190μL PBS中，加入10μL浓度为10mmol/L的Hg2+溶液，振荡10min，使Hg2+离子结合到磁性分子印迹纳米颗粒表面，经磁性洗涤3次，制得Fe3O4@SiO2-AFP-Hg2+磁性纳米颗粒；
S4电化学检测：参照实施例1中S4步方法，将Fe3O4@SiO2-AFP-Hg2+纳米颗粒吸附于磁性玻碳电极表面，设定沉积电位为-1.2V，沉积时间为200s，扫描范围为-0.1～0.3V，进行溶出伏安扫描。参照图5A所示，在0.1V附近得到较大的伏安电流，电流随AFP浓度的增加而增加。参照图5B所示，在0.01～10ng/mL的浓度范围内，电流值与AFP对数浓度呈现良好线性关系，线性公式为I＝0.3693log(CAFP)+1.9146，线性相关性R2＝0.9909，表明该方法能用于CEA蛋白的间接电化学检测。参照图5C选择性实验结果显示，该方法对癌胚抗原(CEA)、C-反应蛋白(CRP)、葡萄糖(Glc)、谷氨酸(Glu)、卵清蛋白(OVA)、尿酸(UA)等物质表现出了良好的抗干扰性能。
S5实际样品中AFP的检测：将磁性AFP分子印迹Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒分散于PBS稀释10倍后的血清样品中，重复上述S2～S4步骤，读取溶出伏安峰电流数据，通过S4步所得标准曲线计算样品中AFP的含量。参照表3所示，通过标准加入法，分别向血清样品中加入1.0和5.0ng/mL AFP蛋白，重复上述S2～S4步骤，计算得其回收率分别为107.4％和118.8％之间，说明该方法可应用于血清样品中糖蛋白AFP的检测。
表3实施例3采用本发明的检测方法测定血清中AFP含量的测试结果(n＝3)
实施例4
一种基于金属配位和磁性分子印迹技术的癌胚抗原(CEA)电化学传感方法的步骤为：
S1 CEA蛋白磁性分子印迹纳米颗粒的制备
参照实施例1中S1步方法，制备氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒、硼酸修饰磁性Fe3O4纳米颗粒、CEA蛋白表面定向印迹的磁性Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒。
S2 CEA蛋白的富集：参照实施例1中S2步方法，将CEA印迹的磁性Fe3O4@SiO2-MIP加入含有CEA蛋白的溶液中，室温振荡孵育制得Fe3O4@SiO2-CEA磁性纳米颗粒；
S3电信号转换：参照实施例3中S2步方法，将Fe3O4@SiO2-CEA分散于含有Hg2+的PBS溶液振荡10min，并经洗涤后，制得Fe3O4@SiO2-CEA-Hg2+磁性纳米颗粒；
S4电化学检测：参照实施例3中S4步方法，将Fe3O4@SiO2-CEA-Hg2+纳米颗粒吸附于磁性玻碳电极表面，进行溶出伏安扫描。参照图6所示，溶出伏安电流随CEA浓度的增加而增加(图6A)，在0.05～2.5ng/mL的浓度范围内，电流值与CEA对数浓度呈现良好线性关系(图6B)，线性公式为I＝2.02log(CCEA)+3.85，线性相关性R2＝0.9963，表明该方法能用于CEA蛋白的间接电化学检测。参照图6C所示，选择性实验结果显示，该方法对甲胎蛋白(AFP)、C-反应蛋白(CRP)、葡萄糖(Glc)、卵清蛋白(OVA)、尿酸(UA)、谷氨酸(Glu)等物质表现出了良好的抗干扰性能。
S5实际样品中CEA的检测：将磁性CEA分子印迹Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒分散于PBS稀释10倍后的血清样品中，重复上述S2～S4步骤，读取溶出伏安峰电流数据，通过S4步所得标准曲线计算样品中CEA的含量。参照表2所示，通过标准加入法，分别向血清样品中加入0.5和1.0ng/mL CEA蛋白，重复上述S2～S4步骤，计算得其回收率分别为102.3％和95.5％，说明该方法可应用于血清样品中糖蛋白CEA的检测。
表4实施例4采用本发明的检测方法测定血清中CEA含量的测试结果(n＝3)
实施例5
一种基于金属配位和磁性分子印迹技术的C-反应蛋白(CRP)电化学检测方法的步骤为：
S1 CRP蛋白磁性分子印迹纳米颗粒的制备
参照实施例1中S1步方法，制备氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒。CRP蛋白印迹制备Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒时，直接在氨基化Fe3O4纳米颗粒表面进行，印迹方法与S1步方法略有不同，具体实验步骤为：首先，将0.040g氨基化磁性Fe3O4纳米颗粒超声分散于40mL缓冲溶液(PBS，pH 8.5)中；其次，加入200μLCRP储备液(1.0mg/mL)，室温搅拌3h；接着，加入60μL三甲基氧基苯基硅烷，室温搅拌3h；然后，加入20μL正硅酸乙酯，室温搅拌反应4h；最后，将所得磁性纳米颗粒分散于0.1mol/L醋酸-十二烷基硫酸钠混合溶液中，振荡洗涤，去除模板蛋白分子，制得CRP蛋白表面印迹的磁性纳米颗粒，分散于PBS中保存备用。
S2 CRP蛋白的富集：参照实施例1中S2步方法，将CRP印迹的磁性Fe3O4@SiO2-MIP加入含有CEA蛋白的溶液中，室温振荡孵育制得Fe3O4@SiO2-CRP磁性纳米颗粒；
S3电信号转换：参照实施例3中S2步方法，将Fe3O4@SiO2-CRP分散于含有Hg2+的PBS溶液振荡10min，并经洗涤后，制得Fe3O4@SiO2-CRP-Hg2+磁性纳米颗粒；
S4电化学检测：参照实施例3中S4步方法，将Fe3O4@SiO2-CRP-Hg2+纳米颗粒吸附于磁性玻碳电极表面，进行溶出伏安扫描。参照图7所示，溶出伏安电流随CRP浓度的增加而增加(图7A)，在5.0～500ng/mL的浓度范围内，电流值与CRP对数浓度呈现良好线性关系(图7B)，线性公式为I＝2.70log(CCRP)-0.17，线性相关性R2＝0.9974，表明该方法能用于CRP蛋白的间接电化学检测。参照图7C所示，选择性实验结果显示，该方法对卵清蛋白(OVA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、葡萄糖(Glc)、维生素C(VC)、胰岛素(lns)等物质表现出了良好的抗干扰性能。
S5实际样品中CRP的检测：将磁性CRP分子印迹Fe3O4@SiO2-MIP纳米颗粒分散于PBS稀释10倍后的血清样品中，重复上述S2～S4步骤，读取溶出伏安峰电流数据，通过S4步所得标准曲线计算样品中CRP的含量。参照表2所示，通过标准加入法，分别向血清样品中加入100和300ng/mL CRP蛋白，重复上述S2～S4步骤，计算得其回收率分别为96.7％和90.88％，说明该方法可应用于血清样品中糖蛋白CRP的检测。
表5实施例5采用本发明的检测方法测定血清中CRP含量的测试结果(n＝3)
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。