阅读说明：本技术 一种砗磲贝壳形态与外套膜颜色性状互换品系的制备方法 (Preparation method of tridacna shell morphology and mantle color character interchange strain ) 是由 张跃环 李军 周梓华 秦艳平 喻子牛 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种砗磲贝壳形态与外套膜颜色性状互换品系的制备方法。其包括亲本选择：选择不同物种砗磲作为亲本,剔除掉天然杂交个体,确保物种的纯正性；亲本促熟：亲本采用微流水式促熟,每年的4-6月份,为砗磲性成熟季节,进入繁殖盛期；精卵分离、人工授精、遗传鉴定。本发明为了获得不同物种砗磲优良性状,建立了种间杂交育种技术,获得了理想的贝壳形态与外套膜颜色互换新品系,创造了前所未有的砗磲变异类型,为砗磲海上养殖、观赏水族市场、底播增殖提供了新的选择,为其新品种培育提供了技术保障。本发明首次实现了砗磲种间杂交,获得了贝壳形态与外套膜颜色互换品系,培育出了显著杂种优势新品系,为砗磲新品种培育提供了技术保障。(The invention discloses a preparation method of tridacna shell shape and mantle color character interchangeable strain. It comprises the following steps of parent selection: selecting different species of tridacna as parents, and removing natural hybrid individuals to ensure the pureness of the species; parent ripening: the parents are promoted to mature in a micro-flow manner, in 4-6 months per year, the sexual maturity season of tridacna enters the breeding season; separating sperms and eggs, artificial insemination and genetic identification. According to the invention, in order to obtain the excellent properties of giant clams of different species, an interspecific hybridization breeding technology is established, an ideal new strain with shell morphology and mantle color interchanged is obtained, an unprecedented giant clam variation type is created, a new selection is provided for the marine culture, the ornamental aquarium market and the bottom sowing proliferation of giant clams, and a technical support is provided for the culture of new species of giant clams. According to the method, the hybridization among giant clam species is realized for the first time, the strain with the shell form and mantle color exchanged is obtained, the new strain with remarkable heterosis is cultivated, and the technical support is provided for the cultivation of the novel giant clam variety.)

一种砗磲贝壳形态与外套膜颜色性状互换品系的制备方法

技术领域

本发明属于现代海洋农业中贝类遗传育种技术领域，具体涉及一种砗磲贝壳形态与外套膜颜色互换品系的制种方法。

背景技术

种间杂交是动植物基本育种手段之一，它可以显著的扩大动植物的基因库，促进种间交流，引入异种有利基因，创造出前所未有的变异类型，甚至会合成新的物种。对于水产动物而言，种间杂交主要集中在鱼类杂交上，培育出一些新品种及其变异类型，有效的推动了鱼类产业发展，如杂交鲟鳇鱼、杂交鲤鲫、杂交鳊鲂鱼、杂交石斑鱼等。对于海洋贝类而言，种间杂交研究集中在牡蛎、扇贝、鲍鱼等物种上，学者们培育出了“华南1号”牡蛎新品种、“青农黑贝、青农金贝”扇贝新品种、“绿盘鲍”鲍鱼新品种，为我国贝类产业良种化提供了保障。

砗磲是一类大型热带海洋珊瑚礁底栖贝类，主要分布在印度洋、西太平洋海域和南中国海等地区，包括中国海南省和台湾省南部、印度尼西亚、菲律宾、澳大利亚、马来西亚、密克罗尼西亚、巴布亚新几内亚、斐济、所罗门群岛和帕劳等国的低潮区附近的珊瑚礁间或较浅的礁内区域。砗磲最独特的生物学特征是其营养方式——通过它外套膜内共生的虫黄藻进行光合作用，获得生存所需营养和能量，可以无需摄食、只需要阳光即可生活，被称为“光合动物”。砗磲外套膜色彩缤纷、具各色花纹，艳丽如花，又被称为“海中玫瑰”。

在我国，砗磲主要分布于南海诸岛、台湾、海南等海域，包括8种砗磲，分别为砗磲属的库氏砗磲(Tridacna gigas)、无鳞砗磲(T.derasa)、鳞砗磲(T.squmosa)、长砗磲(T.maxima)、诺瓦砗磲(T.noae)、番红砗磲(T.crocea)和砗蠔属的砗蠔(Hippopushippopus)、瓷口砗蠔(H.porcellanus)。我国南海珊瑚礁的澙湖、堡礁、岛礁的礁盘都是砗磲的分布区。由于砗磲市场价值的发现及我国海域管理措施滞后，尤其是二十世纪九十年代以来，随着潜水设备和机动船的普及，砗磲资源受到严重的破坏，如库氏砗磲在我国南海几近绝迹，无鳞砗磲也极为罕见，其他砗磲大都处于濒危境地，使珊瑚礁面临资源枯竭、生态系统崩溃的危险。

中国科学院南海海洋研究所自2016年起，在国内率先突破了砗磲人工繁育、中间培育、底播增殖技术，建立了相应的技术配套体系。基于人工繁育技术的突破，学者们也开展了相应的遗传育种工作。

发明内容

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为了尝试砗磲种间杂交的可行性，获取砗磲种间杂种新品系，开辟一项砗磲育种新技术，本发明提供了一种获得砗磲贝壳形态与外套膜颜色互换品系的制种方法。

本发明的砗磲贝壳形态与外套膜颜色互换品系的制种方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、亲本选择：选择不同物种砗磲作为亲本，剔除掉天然杂交个体，确保物种的纯正性；

b、亲本促熟：采用微流水式促熟，培育密度为10-15kg/m²；光照强度为正常太阳光强度的60-80％，每年的4-6月份，为砗磲性成熟季节，进入繁殖盛期；

c、精卵分离：利用催产剂进行亲本催产，由于砗磲是雌雄同体的动物，亲本排放***后，隔一段时间，继续排放卵子；采用亲本多次转移模式单独收集每个个体排放的***、卵子，获取未污染的***和卵子；

d、人工授精：将未污染的精卵作为配子来源，开展不同物种间的配对人工授精，精：卵数量比＝30-50:1，微充气孵化受精卵；由于是种间杂交，可能存在双向受精、单向受精、不受精现象，均属于正常现象；

e、子代培养：对孵化出的D型幼虫进行选优，开展幼虫培育、植入虫黄藻、稚贝培养、幼贝中间育成、底播养殖，跟踪整个过程中杂交子代及其种内自繁子代表型性状变化，评估杂种优势，筛选有效杂交组合作为新品系；

f、遗传鉴定：由于杂交过程中可能存在***污染、幼虫污染、苗种污染等现象发生，采用分子标记对杂交子代进行遗传鉴定，确保杂交子代为真正的两性融合子代，非单一物种子代。

优选，所述的步骤(a)的选择不同物种砗磲作为亲本是选择鳞砗磲、番红砗磲作为亲本。

优选，所述的步骤(a)中的选择不同物种砗磲作为亲本是每种砗磲依据性成熟个体大小不同而定。

优选，所述的步骤(a)中的剔除掉天然杂交个体是从足丝孔获得少量样品进行分子验证。由于砗磲是雌雄同体的动物，杂交过程中很容易发生***污染，所以杂交子代需要遗传鉴定，才是科学的，否则其结果可能会到严重质疑。

优选，所述的步骤(c)中的催产剂是五羟色胺。

优选，所述的步骤(c)中的获取未污染的***和卵子，为了防止***污染，将获取的***采用20μm网孔的过滤，收集滤液即为未污染的***液，卵子和杂质在滤网上；为了观察卵子是否发生自交受精，将其放置于自然海水中90min后，弃掉已卵裂的卵子，选择尚未发生卵裂的卵液作为卵子来源；

优选，所述的步骤(d)的将未污染的精卵作为配子来源，是使用显微镜下有跳跃能力的***作为雄性来源；使用浸泡在海水90min后，弃掉已卵裂的卵子，选择尚未发生卵裂的卵子作为雌性来源。

本发明为了获得不同物种砗磲优良性状，建立了种间杂交育种技术，获得了理想的贝壳形态与外套膜颜色互换新品系，创造了前所未有的砗磲变异类型，为砗磲海上养殖、观赏水族市场、底播增殖提供了新的选择，为其新品种培育提供了技术保障。本发明首次实现了砗磲种间杂交，获得了贝壳形态与外套膜颜色互换品系，培育出了显著杂种优势新品系，为砗磲新品种培育提供了技术保障。

附图说明：

图1是鳞砗磲与番红砗磲杂交子代贝壳形态学。A，鳞砗磲；B，番红砗磲；C，鳞砗磲♀×番红砗磲♂子代；D，番红砗磲♀×鳞砗磲♂子代。

图2是鳞砗磲与番红砗磲杂交子代外套膜颜色。A，鳞砗磲；B，番红砗磲；C，鳞砗磲♀×番红砗磲♂子代；D，番红砗磲♀×鳞砗磲♂子代。

图3鳞砗磲与番红砗磲及其杂交子代遗传鉴定图。注：M是500bp DNAmarker；1-2，鳞砗磲；9-10，番红砗磲；3-5，鳞砗磲♀×番红砗磲♂子代；6-8，番红砗磲♀×鳞砗磲♂子代。

具体实施方式

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以砗磲属中的鳞砗磲与番红砗磲种间杂交为实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例1：

a、亲本选择：2018年3月5日，在海南省三亚市蜈支洲岛海域采集到鳞砗磲、番红砗磲各15个个体；对所有的个体首先进行外观测试，初选出鳞砗磲和番红砗磲物种，之后从足丝孔处取少量样品进行了分子鉴定，尚未发现天然杂交种，确保了物种的纯正性；

b、亲本促熟：将亲本放置于中国科学院海南热带海洋生物实验站养殖缸中，采用微流水饲养模式，进行亲本生态促熟；期间，温度为26.0-28.7℃，盐度为32-33ppt，光照强度为0-507.6μmol s^-1m^-2，即为正常太阳光强度的60-80％；

c、精卵分离：2018年5月6日，鳞砗磲和番红砗磲亲本同步成熟，采用五羟色胺催产剂注射至外套膜进行催产；鳞砗磲首先排放***，大约持续了十分钟，用10L塑料桶其单独收走，大概停留了10分钟，开始排放卵子，为了减少自体***污染，利用海水多次冲洗鳞砗磲，排放出一次卵子，将其转移至第二个桶中，检查卵子是否有污染，显微镜下发现有***污染，转移至第三个桶中，显微镜下发现有***污染；转移至第四个桶中，显微镜下无***污染，均为又黑又圆的卵子，将卵子放置备用；采用同样的方法获得了未受污染的番红砗磲卵子；两种砗磲的卵子放置了1.5小时，显微镜下尚未发现卵裂，证明卵子未受精，未受到污染；采集***，重新选择鳞砗磲、番红砗磲个体，进行催产，获得***，为了防止***受到卵子污染，利用20μm网孔的筛绢网进行过滤***，收集滤液，即为未污染的***，卵子和杂质在筛绢网上，获得了两种砗磲的单体***，显微镜下跳动活跃，可以使用；

d、人工授精：将鳞砗磲***加入到番红砗磲卵液中，***：卵子＝30-50:1，将番红砗磲***加入到鳞砗磲卵液中，***：卵子＝30-50:1，配对两个种间杂交组，同时微充气孵化，受精3小时后，统计卵裂率；

e、子代培养：孵化30小时，统计孵化率，选育孵化出的D型幼虫，按照一种砗磲人工繁育方法(授权号：ZL201610454619.9)进行幼虫培育、植入虫黄藻、稚贝培养，按照一种半封闭式循环水砗磲幼贝中间培育方法(申请号：201910124460.8)进行幼贝中间育成，按照一种小规格砗磲幼贝底播增殖方法(申请号：201711050534.5)进行底播养殖；跟踪整个过程中杂交子代及其种内自繁子代表型性状变化，评估杂种优势，筛选有效杂交组合作为新品系；2019年5月6日，经过一周年的培养，发现鳞砗磲♀×番红砗磲♂杂交子代生长快，贝壳形态与鳞砗磲相似，外套膜颜色与番红砗磲一致，均为蓝紫色，获得了12万个子代；番红砗磲♀×鳞砗磲♂贝壳形态与番红砗磲相似，外套膜颜色表现出二者杂交颜色，表现出紫花色，获得了2.7万个子代(图1，图2)；

f、遗传鉴定：采用微卫星引物(F:5'-TCTCGCCTGATCTGAGGTCG-3',R:5'-GCAGGACACATTGAACATCG-3')进行子代身份识别，发现双亲均表现为单一条带，而正反交子代出现两个条带，说明杂交子代为真正意义上的两性融合杂交子(图3)。

总之，我们突破了砗磲种间生殖隔离障碍，培育出具有显著杂优势的鳞砗磲♀×番红砗磲♂杂交子代，表现出鳞砗磲的贝壳形态，番红砗磲的外套膜颜色，获得了砗磲种间贝壳形态与外套膜颜色互换的新品系，为砗磲新品种培育提供了技术保障。