一种利用海湾扇贝d型幼体进行现场慢性毒理试验的方法
阅读说明：本技术 一种利用海湾扇贝d型幼体进行现场慢性毒理试验的方法 (Method for carrying out on-site chronic toxicological test by using bay scallop D-type larvae ) 是由 纪志永 李杨 武洪庆 穆迪 谭丹丹 郭小甫 李非 王士钊 袁俊生 于 2021-10-25 设计创作，主要内容包括：提供了一种利用海湾扇贝D型幼体进行现场慢性毒性试验的方法,包括：试验材料的前处理、海湾扇贝幼体的选优和喂养、慢性毒性试验及分析计算。其中,分析计算时,首先统计扇贝幼体附着率,而后对附着率与浓度进行方差分析,在确定浓度对附着率有显著影响后,绘制浓度-效应关系图,确定污染物对海湾扇贝的无效应浓度(NOEC)与低效应浓度(LOEC),最后对试验数据进行可靠性评价,结果为限制可靠及以上时为可用数据。本发明为现场试验方法,充分考虑了自然环境下污染物对水生生物的毒性效应,克服了目前国内贝类慢性试验研究方法单一、未充分考虑自然条件下水生生物对污染物的耐受能力以及试验结果未进行可靠性验证等问题。(There is provided a method for conducting on-site chronic toxicity testing using bay scallop D-larvae, comprising: pretreatment of test materials, selection and feeding of bay scallop larvae, chronic toxicity test and analysis and calculation. During analysis and calculation, firstly, the attachment rate of scallop larvae is counted, then, variance analysis is carried out on the attachment rate and the concentration, after the concentration is determined to have obvious influence on the attachment rate, a concentration-effect relation graph is drawn, the ineffective response concentration (NOEC) and the ineffective response concentration (LOEC) of pollutants on bay scallops are determined, finally, reliability evaluation is carried out on test data, and the result is available data when the limitation is reliable or above. The invention is a field test method, fully considers the toxic effect of pollutants on aquatic organisms in the natural environment, and overcomes the problems that the existing domestic shellfish chronic test research method is single, the tolerance of the aquatic organisms to the pollutants under the natural condition is not fully considered, the reliability of the test result is not verified, and the like.)
技术领域
本发明涉及环境毒理学技术领域，具体涉及一种利用海湾扇贝D型幼体进行现场慢性毒理试验的方法。
背景技术
由于日益增加的人类活动如航运、渔业、旅游业和工业，沿海水域受到了污染物的严重威胁，各类污染物的排放也使得水域中水生生物的生存也受到了严重的威胁，很多污染物甚至可以通过食物链进一步威胁人类的健康。因此，污染物的管理已成为实现资源可持续利用，生态系统可持续发展的主要目标。
水生生物的毒性试验主要是测定污染物在短期或长期内对生物所产生的毒性作用，再由试验结果为环境污染物及污染程度提供重要的评价依据。
海湾扇贝作为引进经济物种，由于其经济价值高，并具有较强的温度与盐度耐受性，现已成为我国北方近海养殖的重要物种之一，并逐渐向东海与南海部分海区扩展。海湾扇贝发育至D型幼虫后壳体发育完整，平均壳长在100微米左右，可通过显微镜观察。发育十天左右时幼体眼点由小变大，颜色越来越深，此时幼虫具有匍匐爬行与游泳双重功能，称为匍匐幼虫，幼体平均壳长也发育至180微米左右。待发育13-15天之后幼体已完全变态为稚贝，稚贝平均壳长500微米，此时附着基上以可见小米米粒大小稚贝。因此基于经济价值高、长期试验的可行性高而选用海湾扇贝作为慢性试验生物，并综合考虑试验用水的理化条件，可得出可靠的数据，作为海水水质基准值推导的数据来源之一。
本发明的目的在于针对现有试验体系中现场试验方案的不足，尽可能还原自然环境下生物的生存条件，模拟污染物在一个动态的平衡中对于生物的影响效应，提供一种适用性宽泛、简易有效的利用海湾扇贝D型幼体进行现场慢性毒理试验方法。
发明内容
针对现有试验体系中现场试验的不足，尽可能还原自然环境下生物的生存条件，模拟污染物在一个动态的平衡中对于生物的影响效应，并对于试验结果可靠性进行评估，最终提供一种适用性宽泛、简易有效的利用海湾扇贝D型幼体进行现场慢性毒理试验方法。该方法所得毒性数据经过可靠性评估，最终可以用于海水水质基准的推导。
一种利用海湾扇贝D型幼体进行现场慢性毒理试验方法，包括以下步骤：
(1)准备经预处理的海水；
(2)准备经预处理的试验容器和试验器具；
(3)准备海湾扇贝D型幼体：选取正常发育的海湾扇贝D型幼体，用所述步骤(1)中得到的经预处理的海水驯养，待扇贝D型幼体摄食基本正常后开始慢性毒性试验；
(4)进行慢性毒理试验：
(4.1)配制污染物母液：当污染物为溶于海水的污染物时，所述污染物母液包括污染物和经预处理的海水；当污染物为难溶于海水的污染物时，所述污染物母液包括污染物、用于溶解所述污染物的助溶剂和经预处理的海水；
(4.2)准备对照组和多个污染物试验组：
向多个步骤(2)中得到的经预处理的试验容器中分别注入预设的对照组和污染试验组水样，其余条件保持相同，构成所述对照组和污染物试验组；
其中，当污染物为溶于海水的污染物时，所述对照组为空白对照组；当污染物为难溶于海水的污染物时，所述对照组包括空白对照组和助溶剂对照组；
其中，
所述空白对照组的水样为所述步骤(1)中得到的经预处理的海水；
所述助溶剂对照组的水样由所述步骤(4.1)中所使用的助溶剂和所述步骤(1)中得到的经预处理的海水组成；
所述多个污染物试验组的水样分别为由所述步骤(4.1)得到的污染物母液和所述步骤(1)得到的经预处理的海水配制得到的具有不同污染物浓度的污染物试验水样；
(4.3)向各对照组和污染物试验组中均放入8-10万个步骤(3)得到的海湾扇贝D型幼体，开始慢性毒理试验，试验进行n天后向各空白对照组和污染物试验组中分别投放多片附着基，其中n为8-12范围内的正整数，优选n＝9；
(4.4)试验总天数为14-18天，试验结束后，取出附着基，并在每片附着基上随机找4-8片(优选5片)区域，每片区域取12-20个(优选15个)附着点，使用显微镜统计幼体在各附着基上的附着率；
(5)分析计算：统计并计算各污染物试验组与各对照组中扇贝幼体在附着基上的附着率，对污染物浓度与幼体附着率进行方差分析，得出污染物的无效应浓度(NOEC)与低效应浓度(LOEC)。
其中，所述步骤(1)中，所述待预处理的海水为天然海水。
其中，所述步骤(1)中，所述准备经预处理的海水包括：取海水，经由由砂滤池、200-300目与400-600目筛绢组成的三级过滤进行过滤，得到所述经预处理的海水。
其中，所述步骤(2)中，所述准备经预处理的试验容器和试验器具包括：将试验容器清理干净后加满步骤(1)中得到的准备经预处理的海水，以不超过1:300的体积比添加次氯酸钠漂白液，静置20-28h(优选24h)，静置结束后使用经预处理的海水冲洗多次并晾干，继续加满经预处理的海水静置20-28h(优选24h)，静置结束后方可使用；其中，在预处理试验容器过程中将试验器具一并置于试验容器中处理，所述试验器具包括硅胶管、气石、换水器、附着基等。
其中，所述试验容器包括深为100-120cm、底面半径在25-35cm(优选30cm)的尼龙桶或同体积下同等深度的方形玻璃缸。
其中，所述步骤(3)中，在海湾扇贝受精卵孵化22-26h(优选24h)后使用250-350目(优选300目)筛绢过滤，未孵化的单细胞透明状卵随水体排出，剩余为正常发育的D型幼体，即为所优选的正常发育的海湾扇贝D型幼体；将所优选的正常发育的海湾扇贝D型幼体放入所述经预处理的试验容器中，所述经预处理的试验容器中装有大于200L经预处理的海水，之后加入400-500mL球等边金藻作为饵料，20-26h(优选24h)后使用显微镜观察幼体摄食情况，观察到大多数扇贝幼体摄食正常后开始慢性毒性试验，试验开始3-4天后投喂饵料中加入青岛大扁藻，投喂量为200-300mL，同时适当减少球等边金藻的投喂量。
其中，所述步骤(4.2)中，所述污染物试验组数量为4-8个，优选为5个。
其中，所述步骤(4.2)中，各对照组和污染物试验组均设有2-4个平行组。
其中，在所述步骤(4.3)前，还使用250-350目(优选300目)筛绢制作的网抄对于试验容器中培养的扇贝幼体进行浓缩，将幼体浓缩至烧杯中，通过多次取样计数推算烧杯中幼体数量。
其中，所述步骤(4.3)中，在慢性毒理试验期间定时观察并记录扇贝幼体摄食与死亡情况。
其中，所述步骤(4.4)中，所述附着基为用棕绳编织而成的棕帘；每个试验容器中投放2-4片附着基，其中每片附着基带有1000-2000个(优选1500个)附着点。
其中，所述步骤(4)中，整个试验过程在养殖场育苗室中进行，采用半静态暴露试验，试验期间每天换水量为50-150L(优选100L)，并定期清理试验容器底部死亡的金藻与扁；整个试验过程中温度通过育苗室整体控温及试验容器自身大体积装水维持，试验海水的温度为23±1℃，光照12-15h(优选14h)、黑暗9-12h(优选10h)，溶解氧维持在饱和值的60％以上，光照与增氧通过共用一个光照灯与增氧泵实现。
其中，所述步骤(5)中，统计并计算各污染物试验组与空白对照组中扇贝幼体在附着基上的附着率，对污染物浓度与幼体附着率进行方差分析，当污染物浓度对幼体附着率有显著性影响后进一步绘制浓度-效应关系图，进而分析各浓度与空白对照组间关系，得出毒性物质的无效应浓度(NOEC)与低效应浓度(LOEC)。其中，将空白对照组附着率设为100％，无效应浓度(NOEC)定义为幼体附着率大于空白对照组幼体附着率的95％的所有污染物试验组中的最高污染物浓度，低效应浓度(LOEC)定义为幼体附着率大于空白对照组幼体附着率的75％的所有污染物试验组中的最高污染物浓度。对于难溶于海水的污染物，助溶剂对照组附着率大于或等于无效应浓度附着率则证明助溶剂对扇贝幼体无明显影响。最后，对于所得结果进行可靠性评估以确定数据可用性。
本发明还提供了一种检测海洋水生态毒性的方法，其通过上述现场慢性毒理试验方法来实现。
本发明具有以下有益技术效果：
1.优先选用近海养殖经济品种，海湾扇贝具有高经济效益且养殖区分布广泛，可以很好地表现经济品种的污染物耐受性。此外，本发明试验周期涵盖了从受精卵后D型幼体到匍匐幼体，再到稚贝的整个变态周期。其中，具体建立了污染物的现场试验方法与试验结果的评估手段，为后续水质基准推导的准确性提供保障。
2.所述现场慢性毒理试验设有多个污染物试验组与1个空白组，每个试验组和空白组设有多个平行组且通过使用大体积容器自身的控温与溶氧能力尽可能减少试验过程中仪器的增加对于扇贝幼体发育的干扰，而后通过加入附着基来模拟自然条件下匍匐幼体变态至稚贝过程的附着环境，因此整个试验尽可能的还原了扇贝的生长发育过程以及受到有毒污染物干扰后的情形。
3.本试验方法思维严谨，通过扩展生物学中五点计数法的统计方法得出扇贝附着率后，首先进行了浓度-附着率的方差分析来确定二者间是否有显著性影响，再根据分析浓度-效应关系得出所需数据，而后对所得数据进行可靠性评价。以此获得的结果相对于现有试验体系具有更高的可靠性，也更有利于未来水质基准准确性的提升。
附图简要说明
图1是本发明的试验流程图；
图2是本发明实施例1中各污染物试验组与空白对照组的扇贝幼体的浓度-效应折线图；
图3是本发明实施例1中浓度-效应的影响率柱状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明涉及环境毒理学技术领域且本发明结果可应用于水质基准领域，具体是涉及一种利用海湾扇贝D型幼体进行现场慢性毒理试验方法。利用本发明探究如铜、锌和镉等重金属污染物与萘、菲等有机污染物自然环境下的毒性效应。下面通过具体的实施例以铜为污染物为例对本发明进行进一步的描述。
实施例1
本实施例以铜为污染物为例，利用海湾扇贝D型幼体进行铜的慢性毒性试验。具体步骤如下：
1.海水及试验材料的预处理：
收集经过砂滤池、300目与500目筛绢三级过滤的海水作为经预处理的海水备用，将深为120cm，底面半径为30cm的尼龙桶清理干净后加满经预处理的海水，以1：600的体积比添加次氯酸钠漂白液，静置24h。静置结束后使用经预处理的海水冲洗多次并晾干，继续加满经预处理的海水静置24h，静置结束后方可使用。在预处理尼龙桶过程中将硅胶管、气石、换水器、附着基等一并置于桶中进行预处理。
2.海湾扇贝受精卵的选优与喂养：
扇贝受精卵孵化24h后使用300目筛绢过滤，依然为单细胞状透明卵随水体排出，剩余为正常发育后D型幼体。选优结束后将扇贝幼体放入经过前处理的尼龙桶中，之后加入400mL球等边金藻，24h后使用显微镜观察幼体摄食情况，观察到大多数扇贝幼体摄食正常后开始慢性毒性试验，试验开始3天后投喂饵料中加入青岛大扁藻投喂量为200mL，同时适当减少球等边金藻的投喂量。
3.慢性毒理试验：
a.使用去离子水配制五水硫酸铜母液，称取19.6460g五水硫酸铜溶解后于1L容量瓶中定容配制成5g/L梯度的Cu2+母液备用。
b.使用天然海水，使用潜水泵抽取蓄水池中经过初步沉淀的海水，通过砂滤池、300目与500目筛绢组成的三级过滤来过滤天然海水中颗粒悬浮物与浮游动物，得到经过滤的天然海水，在所有试验桶中添加250L过滤后的海水做为试验用溶液。
c.设置6个试验组，其中一个空白对照组，五个污染物试验组，空白对照组与五个浓度组均设有两个平行，污染物试验组1～5铜浓度分别为5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L的毒性物质试验组，空白对照组的水样是经过滤的天然海水，五个污染物试验组和空白对照组组除污染物铜浓度不同外，其余条件均相同。
d.使用300目筛绢制作的网抄对于桶中培养的扇贝幼体进行浓缩，将幼体浓缩于2L烧杯中，通过多次取样计数推算烧杯中幼体数量。
e.在每个容器中放入8万左右步骤2中选优结束24h后的扇贝幼体进行慢性毒理试验，试验第9天时投放附着基，附着基选用棕绳编织而成的棕帘，每个试验桶中投放两片附着基，其中每片附着基带有约1500个附着点。慢性毒理试验期间定时观察幼体摄食情况与死亡情况，试验结束后取出附着基在每片附着基上随机选取五处不同区域，每处区域取15个附着点，剪下后使用显微镜观察并记录扇贝幼体在各附着基上的附着数量。
f.整个试验过程在养殖场育苗室中进行，采用半静态暴露试验，试验期间每天换水量为100L并定期清理试验桶底死亡的金藻与扁藻。
g.整个试验过程中通过育苗室整体控温与试验桶自身装水体积维持水温在23±1℃，控制光照14h、黑暗10h，溶解氧维持在饱和值的60％以上。
4.分析计算：
a.分析扇贝幼体的附着情况，统计并计算污染物试验组1～5与空白对照组中扇贝幼体在附着基上的附着率，具体公式如下：
附着幼体总数N1＝总附着点M/计数用附着点m×五处选取区域总附着数n1；
附着率Y＝附着幼体总数N1/总幼体数N；
b.通过方差分析确定污染物浓度对幼体附着率是否有显著性影响，流程如下：
选择分析程序中一般线性模型下的单变量分析，以铜浓度为固定因子，扇贝幼体附着率对数为因变量，分析模型为全因子模型，当P值小于0.05时认为不同浓度的铜对于扇贝幼体附着率有显著性影响，表1显示了本发明实施例1中浓度-附着率的方差分析结果，全因子方差分析结果中P值为0.000，说明铜浓度对于扇贝附着率有显著影响。表2显示了各污染物试验组(其中每个试验组包括两个平行组)的浓度与幼体附着率、影响率。
表1本发明实施例1中浓度-附着率的方差分析结果
a.R2＝0.990(调整后R2＝0.981)
表2各污染物试验组与幼体附着率、影响率
c.进一步的，确定浓度对附着率有显著性影响后绘制浓度-效应折线图与各浓度相对于空白对照组的影响率图(如图2和图3所示)，得出毒性物质的无效应浓度(NOEC)与低效应浓度(LOEC)，以空白对照组附着率为100％，其中NOEC为幼体附着率大于空白对照组幼体附着率95％的所有污染物试验组中的最高污染物浓度，LOEC为幼体附着率大于空白对照组幼体附着率75％的所有污染物试验组中的最高污染物浓度。由图2与图3分析可以得出实施例1中NOEC没有结果，LOEC为5μg/L。
d.进一步的，对试验所得LOEC进行可靠性评估(如表3所示)。目前国内政府部门或相关协会尚未发布贝类慢性试验的标准，另外国家发布的其余水生生物试验标准均为试验室体系下的毒性毒理试验，本实施例由于为现场试验，因此试验所得数据不为无限制可靠数据，但试验过程详细且对试验中数据进行了统计分析，在确认数据间存在显著影响关系后分别绘制了附着率、影响率与浓度的关系图，最后分析浓度-效应关系得出LOEC。整个数据产生过程有充足证据证明，所以本试验所得LOEC为限制可靠。
表3数据可靠性评估规则
由于不同研究人员毒性试验的试验方案各有不同，以上所述仅为本发明可行性实施方式的具体说明，并非用来限定本发明的实施范围，凡是依托本发明所做的等效变更与修改均应包含在本发明的包含范围之内。
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