一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法
阅读说明：本技术 一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法 (Rapid construction method of high-density genetic linkage map based on interspecific hybridization family of crassostrea hongkongensis and crassostrea sikamea ) 是由 马海涛 喻子牛 张跃环 秦艳平 肖述 李军 于 2021-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法,包括以下步骤：(1)种间杂交作图群体构建；(2)种间杂交子代的分子鉴定；(3)简化基因组文库构建和高通量测序；(4)高密度遗传连锁图谱构建。本发明建立了高效低成本的两种牡蛎SNP标记技术体系,获得的种间通用SNP标记具有高效性、稳定性和共显性等优点,利用该套标记可以进行两种牡蛎的遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究,推动两种牡蛎的遗传学和分子育种技术的发展。(The invention discloses a rapid construction method of a high-density genetic linkage map based on a hybrid family between hong Kong oyster and sida ursinum species, which comprises the following steps: (1) constructing an interspecific hybridization mapping population; (2) molecular identification of interspecific hybrid progeny; (3) simplified genomic library construction and high throughput sequencing; (4) constructing a high-density genetic linkage map. The invention establishes an efficient and low-cost SNP marker technical system of two oysters, the obtained interspecific universal SNP marker has the advantages of high efficiency, stability, co-dominance and the like, and the set of marker can be used for researching genetic map construction, genetic diversity analysis, variety identification, molecular marker assisted breeding and the like of the two oysters, thereby promoting the development of genetics and molecular breeding technology of the two oysters.)
技术领域
本发明属于分子生物学、遗传学和基因组学技术领域，具体涉及一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法。
背景技术
香港牡蛎主要分布于我国广东、广西两省，喜好高温、低盐环境，是我国南方养殖的主要经济种，年产量在130万吨左右，具有生长快、个体肥大等优点。熊本牡蛎主产于日本、中国和韩国，在我国分布于江苏南通以南，主要包括浙江、福建、广东、广西、海南等地，浙江为核心分布区；喜好高温、中高盐环境，但个体相对较小，均为野生状态，基本无养殖；由于其味道鲜美，这种牡蛎在国外市场上深受到广大销售者青睐。针对这两种牡蛎在生长、肉质等方面的特点，本课题组进行了香港牡蛎和熊本牡蛎的种间杂交育种试验并获得成功，发现香港牡蛎×熊本牡蛎杂交子代的生长性状比熊本牡蛎对照组都有了明显提高，为下一步牡蛎新品种培育奠定了良好的基础。
高密度遗传连锁图谱是重要经济性状QTL定位和分子标记辅助育种的基础，另外可以用于辅助基因组的组装，具有重要的理论价值和实用价值。特别是以种间杂交种为材料构建的高密度遗传连锁图谱，对于研究比较基因组学、进化基因组学等都具有重要意义。因此，我们提出了一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法，通过该方法建立了高效低成本的两种牡蛎SNP标记技术体系，推动了两种牡蛎的遗传学和分子育种技术的发展。
一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法，包括以下步骤：
(1)种间杂交作图群体构建：在香港牡蛎和熊本牡蛎的繁育重叠季节，通过解剖性腺的手段获取精卵，采用单对单家系的制作模式，构建香港牡蛎与熊本牡蛎的种间杂交家系；
(2)种间杂交子代的分子鉴定：采用微卫星引物Ch513 F:5'-CTGGAATCGGTATGTCTT-3'和R:5'-GTTACGTGCACCCTAAAT-3'对香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交子代进行分子鉴定，根据PCR扩增产物电泳结果筛选出真正杂交种；
(3)简化基因组文库构建和高通量测序：将真正杂交种的基因组DNA进行酶切；酶切后的片段两端用T4连接酶加接头和barcode；使用改进的磁珠回收系统，通过调整磁珠溶液与连接产物的体积比来调节回收片段大小；对回收片段使用Taq酶进行PCR扩增；将混好的文库在Illumina Novaseq PE300平台上测序；
(4)高密度遗传连锁图谱构建：将测序所得的Raw Reads进行过滤获得CleanReads；使用bwa软件将Clean Reads比对到香港牡蛎参考基因组，使用GATK流程进行SNP检测，完成亲本间标记后，将符合群体亲本多态性位点的子代分型进行基因型编码，将获得的SNP分型结果进行过滤，然后进行连锁群划分，对每个连锁群采用回归算法进行排序，采用Kosambi函数将重组率转换为遗传距离，绘制遗传图谱，采用R中的LingageMap View软件包进行图谱结果的可视化。
优选，步骤(3)中，所述的将真正杂交种的基因组DNA进行酶切，是使用PstI-HF和MspI内切酶进行酶切，酶切片段长度为300-700bp。
优选，步骤(3)中，对回收片段使用Taq酶进行PCR扩增，扩增的上游引物为：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'，下游引物为：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA-3'。其PCR反应体系为：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分分别为：纯化后的连接产物3μL，Taq 5×Master Mix 5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，用灭菌水补足25μL；PCR反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，变性至延伸三个步骤重复16次，68℃延伸5min。
优选，步骤(3)中，所述的测序是采用简化基因组测序方法Genotyping-by-Sequencing进行测序，测序数据量平均每个子代>0.5G，亲本个体>1.5G。
优选，步骤(4)中，将测序所得的Raw Reads进行过滤获得Clean Reads，具体为：使用fastqc(v0.11.7)软件对对Raw Reads进行质控；使用stacks(v2.1)软件包中processradtage程序，剔除Raw Reads含有接头序列的Reads，并依据建库样品与barcode对应关系拆分为单样品Raw Reads；使用fastx toolkit(v0.0.14)软件包中的fasx trimmer程序，移除酶切位点序列以及3'端fastqc质控质量分数小于20的所有碱基，得到Clean Reads。
优选，步骤(4)中，所述的基因型编码是采用遗传学中的二等位编码规则进行编码。
优选，步骤(4)中，将获得的SNP分型结果进行过滤，具体为使用vcftools(v0.1.13)软件对获得SNP分型结果进行过滤，将深度低于4x的位点转化为缺失。
优选，步骤(4)中，进行连锁群划分，具体为使用Joinmap5.0软件进行连锁群划分，LOD值设为2-15。
优选，步骤(2)中，根据PCR扩增产物电泳结果筛选出真正杂交种，具体为：样品同时在260bp～290bp区间和230bp～250bp区间内各出现1条带，即为真正杂交种，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
所述的采用微卫星引物Ch513 F:5'-CTGGAATCGGTATGTCTT-3'和R:5'-GTTACGTGCACCCTAAAT-3'对香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交子代进行分子鉴定，其具体步骤参见公开号为CN 108220456 A，发明名称为“一种鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST-SSR引物和鉴定方法”的中国发明专利中。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法，通过该方法建立了高效低成本的两种牡蛎SNP标记技术体系，获得的种间通用SNP标记具有高效性、稳定性和共显性等优点，利用该套标记可以进行两种牡蛎的遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究，推动两种牡蛎的遗传学和分子育种技术的发展。
附图说明
图1为母本(香港牡蛎)的高密度遗传连锁图谱(纵坐标为连锁群长度，横坐标为连锁群)。
图2为父本(熊本牡蛎)的高密度遗传连锁图谱(纵坐标为连锁群长度，横坐标为连锁群)。
图3为母本(熊本牡蛎)的高密度遗传连锁图谱(纵坐标为连锁群长度，横坐标为连锁群)。
图4为父本(香港牡蛎)的高密度遗传连锁图谱(纵坐标为连锁群长度，横坐标为连锁群)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1
一种基于香港牡蛎和熊本牡蛎种间杂交家系的高密度遗传连锁图谱快速构建方法，包括以下步骤：
1、熊本牡蛎和香港牡蛎种间杂交作图家系构建
在香港牡蛎和熊本牡蛎的繁育重叠季节5-7月选取体型健康、发育成熟且遗传多样性较高、遗传距离较大的牡蛎个体进行人工暂养和催肥，在遗传鉴定基础上确定为亲本。通过解剖手段获取精卵，采用单对单家系的制作模式，构建熊本牡蛎和香港牡蛎的种间杂交作图家系。获得作图家系1(香港牡蛎♀×熊本牡蛎♂杂交家系)和作图家系2(熊本牡蛎♀×香港牡蛎♂杂交家系)附着苗130条，挂至广西北海的蚝排进行养殖。
2、种间杂交F1代的样品收集
待到家系子代培养4个月后，两个作图家系各取110个杂交子代，使用剪刀和镊子剪取部分闭壳肌置于1.5mL离心管内并加入无水乙醇保存，每个样品均单独存放，每份样品处理前后所用剪刀和镊子都要用酒精擦拭后火焰灼烧以防止交叉污染。
3、亲本和杂交子代基因组中DNA的提取
采用酚氯仿抽提法提取家系亲本和家系子代个体的基因组DNA。将闭壳肌充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μL裂解液和10μL蛋白酶K(10mg/mL)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚(200μL)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μL)混合液抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
4、种间杂交子代的分子鉴定
采用微卫星引物Ch513(5'-CTGGAATCGGTATGTCTT-3'和R:5'-GTTACGTGCACCCTAAAT-3')对熊本牡蛎和香港牡蛎种间杂交子代进行分子鉴定。以提取的三种牡蛎基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。PCR反应结束后，取0.5μL扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1％AgNO3溶液(AgNO3 1g，dH2O 1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液(2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL)显色，直至条带清晰为止。
香港牡蛎特异条带范围在260bp～290bp之间，熊本牡蛎特异性条带范围在230bp～250bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种牡蛎的个体。因此将电泳结果与标准图谱进行对比：若样品同时在260bp～290bp区间和230bp～250bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的香港牡蛎与熊本牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
5、简化基因组测序和高通量测序
将鉴定后的真正杂交种基因组DNA使用PstI-HF和MspI内切酶进行酶切，酶切片段长度为300-700bp的片段，酶切后的片段两端用T4连接酶加接头和barcode；使用改进的磁珠回收系统，通过调整磁珠溶液与连接产物的体积比来调节回收片段大小。对回收片段(300-700bp)使用Taq酶(厂家：New England BioLabs；货号：R0106)进行PCR扩增，扩增的上游引物为：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'，下游引物为：5'-AAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA-3'，PCR反应体系为：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分分别为：纯化后的连接产物3μL，Taq 5×Master Mix 5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，用灭菌水补足25μL；PCR反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，变性至延伸三个步骤重复16次，68℃延伸5min；将混好的文库在Illumina Novaseq PE300平台上测序，采用简化基因组测序方法，即GBS(Genotyping-by-Sequencing)；测序数据量平均每个子代>0.5G，亲本个体>1.5G。
6、高密度遗传连锁图谱构建：将测序所得的Raw Reads进行过滤获得CleanReads，具体为：使用fastqc(v0.11.7)软件对对Raw Reads进行质控；使用stacks(v2.1)软件包中process radtage程序，剔除Raw Reads含有接头序列的Reads，并依据建库样品与barcode对应关系拆分为单样品Raw Reads；使用fastx toolkit(v0.0.14)软件包中的fasxtrimmer程序，移除酶切位点序列以及3'端fastqc质控质量分数小于20的所有碱基，得到Clean Reads。
使用bwa软件将Clean Reads比对到香港牡蛎参考基因组(国家基因组科学数据中心，序列号：GWHBAZL00000000)，使用GATK流程进行SNP检测，完成亲本间标记后，将符合群体亲本多态性位点的子代分型采用遗传学中的二等位编码规则进行进行基因型编码，使用vcftools(v0.1.13)软件对获得SNP分型结果进行过滤，将深度低于4x的位点转化为缺失，然后使用Joinmap5.0软件进行连锁群划分，LOD值设为2-15，对每个连锁群采用回归算法进行排序，采用Kosambi函数将重组率转换为遗传距离，绘制遗传图谱，采用R中的LingageMapView软件包进行图谱结果的可视化。
6.1基于香港牡蛎(♀)×熊本牡蛎(♂)杂交家系的高密度遗传连锁图谱构建
6.1.1母本(香港牡蛎)的高密度遗传连锁图谱
共构建了10个连锁群，与香港牡蛎染色体数一致。上图标记数共583个，每个连锁群含有的标记数目从26到84个不等，平均每个连锁群上有58.3个标记，图谱总长度为899.37cM，标记间的平均间隔为1.5cM，图谱的覆盖率为97.30％(图1)。
6.1.2父本(熊本牡蛎)的高密度遗传连锁图谱
共构建了10个连锁群，与熊本牡蛎染色体数一致。上图标记数共670个，每个连锁群含有的标记数目从16到121个不等，平均每个连锁群上有67个标记，图谱总长度为836.94cM，标记间的平均间隔为1.22cM，图谱的覆盖率为97.40％(图2)。
6.2基于熊本牡蛎(♀)×香港牡蛎(♂)杂交家系的高密度遗传连锁图谱构建
6.2.1母本(熊本牡蛎)的高密度遗传连锁图谱
共构建了10个连锁群，与熊本牡蛎染色体数一致。上图标记数共1149个，每个连锁群含有的标记数目从57到190个不等，平均每个连锁群上有114.9个标记，图谱总长度为1096.09cM，标记间的平均间隔为0.94cM，图谱的覆盖率为98.63％(图3)。
6.2.2父本(香港牡蛎)的高密度遗传连锁图谱
共构建了10个连锁群，与香港牡蛎染色体数一致。上图标记数共514个，每个连锁群含有的标记数目从33到70个不等，平均每个连锁群上有51.4个标记，图谱总长度为653.36cM，标记间的平均间隔为1.23cM，图谱的覆盖率为97.04％(图4)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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