阅读说明：本技术 一种星孢菌素提取方法 (Method for extracting staurosporine ) 是由 付光明 戴绪霖 霍育生 张文凯 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种星孢菌素的提取方法,包含以下步骤：1)板框过滤；2)丙酮提取；3)萃取；4)结晶及真空干燥。本发明所揭示的星孢菌素提取方法生产成本低,提取周期短,操作简单,方法稳定,易于放大,在工业化生产中具有极高的实用价值。(The invention discloses a method for extracting staurosporine, which comprises the following steps: 1) filtering by a plate frame; 2) extracting with acetone; 3) extracting; 4) crystallizing and vacuum drying. The method for extracting the staurosporine disclosed by the invention has the advantages of low production cost, short extraction period, simplicity in operation, stability, easiness in amplification and extremely high practical value in industrial production.)

一种星孢菌素提取方法

技术领域

本发明属于化学品的分离纯化领域，具体涉及一种星孢菌素提取方法。

背景技术

星孢菌素(staurosporine,STA，结构式如下式(1))是一种具有较好药学和生物活性的天然产物。该化合物于1997年由Omura最早是从土壤放线菌中分离得到的吲哚咔唑类生物碱。X单晶衍射实验分析表明，其中央为吲哚咔唑环，环下方的N上连接小分子糖，上面连接的是内酰胺环。STA为强PKC抑制剂(IC50＝2.7nM)，主要作用于细胞信号转导通路中各种激酶、拓扑异构酶以及细胞周期调控因子。

结构修饰得到的星孢菌素衍生物米哚妥林(结构式如下式(2))，于2017年批准用于治疗最新确诊的FLT3突变(以一种FDA批准的检测方法进行检测)呈阳性及适合标准诱导和巩固化疗的急性髓性白血病成年患者。

星孢菌素是作为米哚妥林的关键中间体，其生产工艺直接影响米哚妥林的生产成本和质量。因此，开发星孢菌素的提取纯化方法具有重要意义。

US4107297，公开了一种星孢菌素的提取纯化方法。该方法是在发酵完成后，用氨水将培养基的pH值调整为10，在室温下加入乙酸正丁酯进行提取；加入HCl水溶液，将产品转移到水溶液中；用氨水将PH值调节到10，用乙酸乙酯萃取，浓缩得到褐色混凝剂；用***洗涤，除去脂肪；硅胶层析，洗脱剂氯仿-甲醇，采用薄层控制，浓缩，干燥得纯品。纯度达99％以上。

US 4973552，公开了一种星孢菌素提取方法，该方法先将发酵菌液过滤，再用四氢呋喃对菌渣进行搅拌提取1小时，过滤，菌丝层用丙酮冲洗，滤液浓缩成水溶液，用氯仿萃取得粗提物；粗提物用硅胶层析，洗脱剂正己烷-四氢呋喃梯度；再次用葡聚糖凝胶LH-20制备，得成品。

US7608420，公开的方法是采用甲醇、丙酮和四氢呋喃(优先四氢呋喃)将产品从发酵液中提取出来，让后用陶瓷膜、聚合物膜或金属膜等方式超滤，分子量截止值10kDa或更小；溶液调节PH值10至13，离心或过滤；再采用四氢呋喃-甲醇结晶得到星孢菌素，含量为89％，总收率达64％。

上述专利公开的方法中，US4107297和US 4973552的提取方法都采用了硅胶柱层析，因此产品质量较好，纯度达到99％以上，但生产成本高、收率低。US7608420的方法需要使用超滤技术除去生物大分子杂质，提取收率较高，达到64％，但所得的星孢菌素质量较差，含量只有89％。

星孢菌素发酵液的获得方法在CN 201810572019.1、US4107297、US4973552、US7608420、US20060194294等专利文献中均有提及。

因此，需要提供一种工艺过程简单，成本低，易于放大，生产周期短，收率较高(总达48％以上)，所得的星孢菌素质量好(含量达99.5％以上，最大单个杂质不高于0.10％)。因此，本发明所公开的星孢菌素纯化方法具有重大的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种星孢菌素的提取纯化方法。本方法包括板框过滤、提取、萃取、浓缩、结晶等工序，本方法成本低、生产周期短、效率高且产品质量好，更适于实际生产应用。具体步骤如下：

步骤1：向星孢菌素发酵液加入助滤剂，通过板框过滤，得到星孢菌素菌渣；

步骤2：将步骤1中的星孢菌素菌渣用溶剂提取，得到提取浓缩液；

步骤3：将步骤2中的提取浓缩液中加入有机溶剂A、水溶液、萃取助剂，萃取分层，有机相经干燥、过滤后，浓缩，加入有机溶剂B析晶，过滤，得到星孢菌素粗品；

步骤4：将步骤3中的星孢菌素粗品用适量的混合溶剂溶解，通过滤膜过滤，减压浓缩，加入有机溶剂B析晶，过滤得星孢菌素结晶品；

步骤5：将步骤4中的星孢菌素结晶品进行干燥，得星孢菌素成品。

而且，所述步骤1的星孢菌素发酵液为海洋链霉菌发酵液。

而且，所述步骤2的溶剂为异丙醇、乙醇、丙酮、甲醇中的一种。

而且，所述步骤3的有机溶剂A为乙酸丁酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种。

而且，所述步骤3的水溶液为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨中的一种形成的水溶液，质量百分比浓度为0.1％～3.0％。

而且，所述步骤3的萃取助剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

而且，所述步骤3和步骤4的有机溶剂B为甲醇、丙酮、***、异丙醚中的一种。

而且，所述步骤4的混合溶剂分别为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷三者之一和丙酮、甲醇、乙醇三者之一，两种溶剂的体积比为88:12～94:6，减压浓缩温度为25～35℃。

而且，所述步骤4的滤膜为0.22μm滤膜。

而且，所述步骤5的星孢菌素结晶品进行干燥条件为60±5℃真空干燥16±2h。

本发明所公开的星孢菌素提取纯化方法不需要使用硅胶柱层析，只需在发酵菌丝体尚未开始自溶时，将菌丝体过滤出来，采用适当的溶剂将星孢菌素提取出来，避免发生溶菌而导致大量胞内杂质释放出来。提取液经浓缩后进行萃取，采用碱水溶液将提取液中含有的蛋白质、核酸的生物大分子杂质去除。最后通过结晶，去除其余的有机杂质。本发明的纯化方法，工艺过程简单，易于放大，生产周期短，收率较高(总达48％以上)，所得的星孢菌素质量好(含量达99.5％以上，最大单个杂质不高于0.10％)。因此，本发明所公开的星孢菌素纯化方法具有重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明制备的星孢菌素¹H-NMR图；

图2为本发明制备的星孢菌素¹³C-NMR图；

图3为本发明制备的星孢菌素质谱图；

图4为本发明制备的星孢菌素红外光谱图；

图5为本发明所述的星孢菌素发酵液典型HPLC图；

图6为本发明制备的星孢菌素结晶品典型HPLC图；

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行说明。

实施例1

(1)向星孢菌素发酵液中加入3％珍珠岩(按发酵液体积计，Kg/L)，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，收集菌渣；

(2)将菌渣用有机溶剂提取3次，每次加入4倍体积(L/Kg菌渣)的溶剂，过滤，合并滤液；

(3)滤液在一定温度下减压浓缩至原体积的1/30，加入等体积的溶剂、等体积的水溶液，1/3体积的萃取助剂，搅拌30±10min，静置60±10min，分液，水相再用原体积溶剂萃取一次，合并有机层，加入5％(Kg/L)无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至原体积的1/20～1/16，加入2倍体积的解析溶剂，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品；

(5)将星孢菌素粗品用溶剂A与溶剂B体积比为88:12～94:6的混合溶剂溶解，混合溶剂体积(L)为星孢菌素质量(Kg)的15倍，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在一定温度下减压浓缩至原体积的1/6，加入等体积的溶剂B，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥16±2h，粉碎，得星孢菌素成品。

实施例2

(1)向300L含星孢菌素451mg/L的发酵液中加入9Kg珍珠岩，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，得菌渣62Kg；

(2)将菌渣投入500L搅拌罐中，加入无水乙醇250L，搅拌5±1h，将提取液滤出，菌渣保留在罐内，再加无水乙醇提取2次，每次250L，合并滤液；

(3)滤液在50±5℃下减压浓缩至25～30L，加入30L三氯甲烷，30L 2％氨水，10L无水甲醇，搅拌30±10min，静置60±10min，分液，水相再用30L三氯甲烷萃取一次，合并有机层，加入3Kg无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至3L，加入6L无水甲醇，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品122g；

(5)将120g星孢菌素粗品用1800ml三氯甲烷与无水乙醇体积比为92:8的混合溶剂溶解，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在40±5℃，-0.02～-0.06MPa下浓缩至300ml，加入300ml的无水乙醇，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品87.2g；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥16±2h，粉碎，得星孢菌素成品65.1g，含量99.8％，最大单个杂质0.06％，总收率48.1％。

实施例3

(1)向300L含星孢菌素408mg/L的发酵液中加入9Kg珍珠岩，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，得菌渣65Kg；

(2)将菌渣投入500L搅拌罐中，加入丙酮250L，搅拌5±1h，将提取液滤出，菌渣保留在罐内，再加丙酮提取2次，每次250L，合并滤液；

(3)滤液在50±5℃下减压浓缩至25～30L，加入30L二氯甲烷，30L 3％碳酸钠，10L无水甲醇，搅拌30±10min，静置60±10min，分液，水相再用30L二氯甲烷萃取一次，合并有机层，加入3Kg无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至3L，加入6L丙酮，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品119g；

(5)将110g星孢菌素粗品用1650ml二氯甲烷与丙酮体积比为90:10的混合溶剂溶解，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在40±5℃，-0.02～-0.06MPa下浓缩至300ml，加入300ml的丙酮，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品83.2g；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥16±2h，粉碎，得星孢菌素成品57.5g，含量99.8％，最大单个杂质0.05％，总收率47.0％。

实施例4

(1)向32m³含星孢菌素415mg/L的发酵液中加入960Kg珍珠岩，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，得菌渣6770Kg；

(2)将菌渣等分成两份，分别投入到两个20m³搅拌罐中，各加入无水乙醇13500L，搅拌5±1h，将提取液滤出，菌渣保留在罐内，再加无水乙醇提取2次，每次各加13500L，合并滤液；

(3)滤液在50±5℃下减压浓缩至2500～3000L，加入3000L二氯甲烷，3000L 2％碳酸钾，1000L无水甲醇，搅拌60±10min，静置2±0.5h，分液，水相再用3000L二氯甲烷萃取一次，合并有机层，加入300Kg无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至300L，加入600L无水甲醇，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品14.2Kg；

(5)将14.15Kg星孢菌素粗品用200L三氯甲烷与无水乙醇体积比为92:8的混合溶剂溶解，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在40±5℃，-0.02～-0.06MPa下浓缩至35L，加入35L的无水乙醇，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品8.96Kg；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥30±2h，粉碎，得星孢菌素成品6.62Kg，含量99.8％，最大单个杂质0.06％，总收率49.8％。

本发明中所述的星孢菌素发酵液，就是通过发酵方式获得的细胞内含有星孢菌素的菌液，至少包括按CN 201810572019.1、US4107297、US4973552、US7608420、US20060194294等公开方法获得的发酵液。本发明所述的菌渣，就是通过过滤、离心等方式除去发酵液中液体成分后所获得的固体成分。

对上述实施例所得到的星孢菌素成品通过以下实验进行验证，用以证实所得产品确认为星孢菌素：

图1为本发明制备的星孢菌素¹H-NMR图；

图2为本发明制备的星孢菌素¹³C-NMR图；

图3为本发明制备的星孢菌素质谱图；

图4为本发明制备的星孢菌素红外光谱图；

图5为本发明所述的星孢菌素发酵液典型HPLC图；

图6为本发明制备的星孢菌素结晶品典型HPLC图。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。