一种中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗体及其用途
阅读说明：本技术 一种中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗体及其用途 (Antibody for neutralizing human infected H7N9 influenza A virus and application thereof ) 是由 谢良志 孙春昀 张�杰 宋德勇 饶木顶 朱萍霞 李成红 于 2014-03-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及结合并中和人感染H7N9甲型流感病毒血凝素蛋白的人源化抗体及与其抗原结合的抗体片段,包括抗体重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。本发明还涉及完整抗体在CHO细胞等体系中高效表达的方法。此外本发明还涉及所述抗体、相关血凝素蛋白抗原结合片段和表位在人感染H7N9甲型流感病毒感染的诊断、治疗和预防中的用途。(The present invention relates to humanized antibodies that bind to and neutralize human hemagglutinin protein of influenza a virus infected with H7N9 and antibody fragments that bind to its antigen, including the nucleotide and amino acid sequences of the variable regions of the heavy and light chains of the antibody. The invention also relates to a method for efficiently expressing the complete antibody in a CHO cell system and the like. The invention also relates to the use of said antibodies, associated hemagglutinin protein antigen-binding fragments and epitopes in the diagnosis, treatment and prevention of influenza a virus infection in humans with H7N 9.)
本申请是申请号为201410081962.4，申请日为2014年3月7日，发明名称为“一种中和人感染H7N9甲型流感病毒的抗体及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的抗A型H7N9流感的血凝素HA蛋白的抗体系列及其人源化抗体，该类抗体可在较小的剂量下中和100TCID50的H7N9病毒到半数感染MDCK细胞，并且针对10LD50剂量下保护小鼠，达到90％的死亡保护率，因而该抗体可用于针对H7N9病毒所引发疾病的治疗和预防。本发明还涉及抗体结合的H7N9血凝素蛋白的结合表位及其抗体所结合的氨基酸。本发明还涉及采用基因重组技术在CHO细胞中生产该抗体的方法。
背景技术
流感病毒通过血凝素(HA)的类型定义为A和B两种类型，A型可细分为16种亚型，其中组I有H1，H2，H5，H6，H8，H9，H11，H12，H13和H16亚型存在，组II由H3，H4，H7，H10，H14和H15亚型组成。B型和A型中的H1，H2和H3在人类中引发较广泛的流感疾病，H5，H7和H9亚型在人类中引起散发性严重感染并可能引起新的大流行病。2013年的2月到6月，在中国爆发了高致病性和高死亡率的人感染甲型H7N9流感病毒，共132人感染，其中43人死亡【Rongbao G等人.N Engl J Med.2013,368:1888-1897】。该病毒由在人类中散发的H7和N9亚型的病毒重配而成，人体中没有建立相应的免疫反应记忆，因此该病毒感染可引发剧烈的呼吸道窘迫综合征，导致病人死亡【Kageyama T等人，Euro SUrvell.2013.18:20453】。人季节性流感疫苗由A-H1N1，A-H3N2和B型3种亚型组成，人体对该类疫苗建立的免疫应答对H7N9病毒没有保护作用。因此H7N9病人感染后，急需外源的抗病毒药物来抑制病毒在体内的扩增。尽管，目前还没有人之间H7N9感染的传播，但已有多个实验表明，在流感敏感性动物如雪貂、猪之间可以发生非接触性的空气传播【Herfst S,等人，Science.2012；336:1534-41；H.Zhu等人，Science.2013.341(6142):183-186】。秋冬季为流感的高发季节，我们需要有效的药物来控制和治疗可能发生的新的H7N9流感病例的出现。
当前，对H7N9病毒抑制药物为达菲(Oseltamivir)或其类似物(Zanamivir)，该小分子药物为流感病毒NA蛋白的酶活性抑制剂，它们的效果是避免或减少病毒的扩增，从而达到降低病毒滴度的治疗效果。该药物在临床上有一定的效果，但其病毒清除的速率还是比较慢，并且已有出现达菲耐受株的报道，因此需要有更理想的药物来快速降低病毒在体内的复制【Yunwen Hu等人，Lancet.2013.381:2273-79】。
有报道用康复病人的血清救活了流感危重病人，因此中和抗体也是正在热点研发的可用于预防和治疗的抗病毒药物。血凝素蛋白(HA)是广谱和亚型特异抗体的首要目标，该蛋白是由HA1和HA2亚基组成包含500多个氨基酸的三聚体蛋白HA0。其HA1头部是病毒与靶细胞的唾液酸受体结合的部位，可使病毒与细胞黏附，低pH值的环境可引发茎部HA2区域的构象变化可使病毒与细胞膜融合，当病毒内吞到细胞内部后，病毒的基因组被释放到细胞质中，新的病毒可以在细胞内复制。针对HA的抗体可以有效的阻止病毒感染细胞的过程，从而中断病毒复制链。在不同的亚型中，与流感受体唾液酸结合的HA1的区域差异较大，并且同一亚型在HA1区域也会不断进化出新的变体，因此，该位点虽不具有广谱性，但为最有效的中和位点【Kida H等人，Vaccine.1985,3,219-222】。目前的广谱抗体主要针对相对保守的HA2区域，该类抗体结合HA2表位后，可通过空间位阻来阻止HA蛋白的变构来阻断病毒的感染过程。M2蛋白的抗体也有报道显示具有体内的保护效果，M2为病毒表面的离子通道蛋白，在病毒或细胞表面只有24个氨基酸，当病毒感染细胞后，该细胞表面抗原表达大量的M2蛋白。抗M2的抗体可以结合病毒复制细胞，通过ADCC和CDC的机理来杀死该细胞，起到病毒抑制效果。目前已有多种不同类型的抗血凝素和抗M2的抗体在研发阶段，少量的抗体已进入临床I和II期研究，目前还没有上市的抗体药物。
尽管经过了数十年的研究，针对突发事件，比如H7N9病毒爆发事件，快速的找出最有效的应急药物仍是非常紧要和挑战的任务，因此需要通过多种渠道(化药、中药和生物药)找出最有效的药物。
发明内容
本发明主要涉及一种结合人感染甲型H7N9流感病毒血凝素蛋白的抗体及其抗原结合片段，该抗体是从H7N7A/Netherlands/219/2003和H7N9(A/Anhui/1/2013)血凝素蛋白HA免疫的兔脾和骨髓组织构建的抗体库中用H7N9(A/Anhui/1/2013)的血凝素蛋白筛选获得，该抗体的结合表位为HA1表面与唾液酸结合的区域。因此，本发明包含了中和人感染甲型H7N9和相关H7甲型流感病毒感染的抗体及其抗原结合片段。
在本发明的一个具体实例中，本发明包含一个中和人感染H7N9流感病毒的抗体和其抗原结合片段。在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个互补决定区(CDR)序列，该序列与SEQ ID NO:2,8,13,15,18和19中的任一个有至少61％的序列同源性。其中所述抗体中和人感染H7N9甲型流感病毒。
在本发明的一个具体实施例中，本发明所包含的抗体及其抗原结合片段中，包括具有SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列的轻链CDR1，具有SEQ ID NO:7-10的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:11-14的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述抗体中和甲型流感病毒。在本发明的另一个实施例中，本发明所包含的抗体及其抗原结合片段中，包括具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的重链CDR1，具有SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:19的重链CDR3，其中所述抗体中和人感染H7N9甲型流感病毒。
在本发明的一个具体实施例中，本发明所包含的抗体及其抗原结合片段中，轻链CDR1的同源性范围为61％-100％，轻链CDR2的同源性范围为62％-100％，轻链CDR3的同源性范围为80％-100％。在本发明的另一个实施例中，重链CDR1的同源性范围为100％，重链CDR2的同源性范围为87％-100％，重链CDR3的同源性范围为100％。其中所述抗体中和人感染H7N9甲型流感病毒。
在本发明的一个具体实施例中，本发明包含一种抗体及其抗原结合片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:20氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:29氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:21氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:30氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:22氨基酸序列的轻链可变区和SEQ IDNO:31氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:23氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:32氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:24氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:33氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:25氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:34氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:26氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:35氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:27氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:36氨基酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:28氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:37氨基酸序列的重链可变区；并且其中所述抗体中和人感染H7N9甲型流感病毒，是H7N9-R002和其变异体H7N9-R003,H7N9-R006,H7N9-R019,H7N9-R031,H7N9-RA401,H7N9-RA403,H7N9-RA595,H7N9-R021。
在本发明的一个具体实施例中，本发明包含一种抗体及其抗原结合片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:38核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:39核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:40核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:41核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:42核苷酸序列的轻链可变区和SEQ IDNO:43核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:44核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:45核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:46核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:47核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:48核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:49核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:50核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:51核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:52核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:53核苷酸序列的重链可变区；或所述抗体包含含SEQ ID NO:54核苷酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:55核苷酸序列的重链可变区；并且其中所述抗体中和人感染H7N9甲型流感病毒，是H7N9-R002和其变异体H7N9-R003,H7N9-R006,H7N9-R019,H7N9-R031,H7N9-RA401,H7N9-RA403,H7N9-RA595,H7N9-R021。
在本发明的另一个实施方案中，本发明包含一种抗体或其抗原结合片段，其中和人感染H7N9甲型流感病毒，其中所述抗体来源于H7N7(A/Netherlands/219/2003)血凝素蛋白的兔抗体文库，其抗体是人源化抗体，由兔抗体经人源化设计而来，其抗体采用真核细胞表达生产。
在另一个实施方案中，本发明包含一种含有本发明的抗体及其抗原结合片段的多核苷酸的核酸分子。在另一个方面，本发明包括一种含有本发明的核酸分子的载体或表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞。在又一个方面，本发明包括含有结合本发明的抗体或其抗原结合片段的血凝素蛋白及抗体结合表位，及可以获得同功能抗体的免疫原性多肽。
本发明进一步包括一种药物组合物，其包含本发明的抗体及其抗原结合片段、本发明的核苷酸分子、含有本发明的核酸分子的载体、表达本发明的抗体或抗体片段的细胞、或本发明的免疫原性多肽以及药学可接受的稀释剂或载体。
本发明的抗体及其抗原结合片段、本发明的核苷酸序列、含本发明的核苷酸序列的载体、表达本发明的载体的细胞、包含结合本发明的抗体或抗体片段的表位及其免疫原性多肽、或本发明的药物组合物(i)在制备人感染H7N9甲型流感病毒的治疗和预防药物中；(ii)在疫苗中或(iii)在人感染H7N9甲型流感病毒的诊断中使用都包括在本发明的范围内。进一步，本发明的抗体或抗原结合片段来检测人感染H7N9甲型流感病毒的血凝素抗原是否具有正确构象的特异表位来监控H7N9病毒或血凝素蛋白疫苗的质量的用途也在本发明的范围之内。
在本发明的另一发明，包括一种减少人感染H7N9甲型流感病毒感染或降低人感染H7N9甲型流感病毒感染风险的方法，其包括向有需求的个体使用治疗或预防有效量的本发明的抗体或其抗原结合抗体片段。
在另一方面，本发明包括一种特异的结合本发明的抗体或其抗原片段的表位，其用于：(i)制备治疗人感染H7N9甲型流感病毒的药物；(ii)检测治疗人感染H7N9甲型流感病毒药物的结构；(iii)作为疫苗；或(iv)筛选能中和人感染H7N9甲型流感病毒的配体。
附图说明
图1：兔源抗H7N9抗体对H7N9(A/Anhui/1/2013)流感病毒血凝素HA蛋白(2μg/mL)的血凝抑制活性。1a为血凝板的凝集照片，1b为抗体的凝集数据分析。
图2：人源化H7N9抗体H7N9-H002和原始兔抗体对4种H7N9(A/Anhui/1/2013,A/Shanghai/1/2013,A/Hangzhou/1/2013,A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013)流感病毒血凝素HA蛋白的血凝抑制活性。
图3：人源化H7N9抗体H7N9-H002和原始兔抗体对H7N9(A/Anhui/1/2013)病毒的微中和(MN)活性。
图4：人源化H7N9抗体H7N9-H002可变区序列；4a：人源化抗体的轻链可变区核苷酸和氨基酸序列，4b：人源化抗体的重链可变区核苷酸和氨基酸序列。
图5：人源化H7N9抗体H7N9-H002在流感预防组的动物保护效果；5a：小鼠的存活率，5b：小鼠的体重下降比例。预防组的抗体剂量分别为1mg/kg，3mg/kg，10mg/kg和20mg/kg，病毒为H7N9(A/Anhui/1/2013)。
图6：人源化H7N9抗体H7N9-H002在流感治疗组的动物保护效果；6a：小鼠的存活率，6b：小鼠的体重下降比例。治疗组的抗体剂量为20mg/kg，给药时间为攻毒后3小时，1天和3天，病毒为H7N9(A/Anhui/1/2013)。
图7：人源化H7N9抗体H7N9-H002在流感治疗组的动物保护效果，7a：小鼠的存活率，7b：小鼠的体重下降比例。治疗组的抗体剂量为40mg/kg，给药时间为攻毒后1天和3天，病毒为H7N9(A/Anhui/1/2013)。
图8：H7N9(A/Anhui/1/2013)流感病毒血凝素HA蛋白的结构示意图：人源化H7N9抗体H7N9-H002结合该HA蛋白的表位由蓝色表示；HA蛋白受体唾液酸结合的表位由红色显示；抗体结合表位与唾液酸结合表位交叉的部分由黄色表示。
图9：人源化H7N9抗体H7N9-H002与H7N9不同毒株HA蛋白的ELISA结合数据。
图10：人源化H7N9抗体H7N9-H002与H7类的病毒HA的ELISA结合数据。
具体实施方式
发明详述
本发明基于从H7N7(血凝素HA蛋白与H7N9病毒高度同源)或H7N9病毒血凝素蛋白免疫动物个体中发现和分离特异性中和H7N9人感染病毒的增强性免疫成熟的动物源性抗体。这些抗体对H7N9病毒的中和活性是预期的，并且该抗体识别的血凝素蛋白表位应该是H7N9病毒亚单位疫苗的一部分。
在一方面，本发明提供了中和人感染H7N9甲型流感病毒的抗体及其抗原结合片段，在一个实施例中，该抗体及其抗原结合片段可以结合多种部分变异的H7N9流感病毒。
在本发明的另一个方面，本发明提供了针对不同人感染H7N9甲型流感病毒的HA的中和抗体及其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明的抗体及其抗原结合片段特异性的结合在H7N9甲型流感病毒的唾液酸受体结合表位。在另一个具体实施例中，本发明的抗体及其抗原结合片段可以抑制H7N9甲型流感病毒HA的血凝活性。
人源化单克隆抗体，表达本发明抗体的CHO，293转染细胞系以及编码本发明的抗体的核苷酸序列都包含在本发明的范围内。
如本文所用，术语“抗原结合片段”或“抗体片段”指保持抗体的抗原结合活性的本发明的抗体的任何片段以及相似度在60％的片段。示例性的抗体片段包括但不限于单链抗体、Fab，Fab’，F(ab’)2,Fv或scFv。如本文所用，术语“抗体”包括抗体及其抗原结合片段。
如本文所用，“中和抗体”指的是抗体可以中和，即预防、抑制、减少、阻碍或干扰病毒引发和/或保持宿主抵抗感染的能力。术语“中和抗体”或“中和…的抗体”在本文中互换使用。如本文所述，这些抗体可以单独使用，或作为预防剂或治疗剂在合适的制剂中与NA抑制剂或疫苗等药物联合使用，并包括以抗体为基础的任何修饰和改良后使用。
本发明的抗体和抗原结合片段具有高亲和力和高中和效力。中和50％甲型流感病毒所需的本发明的抗体浓度可以例如为200ng/ml或更低。在一个实施例中，中和100TCID50A/Anhui/1/2013病毒的50％甲型流感病毒所需要本发明的抗体浓度约为25ng/ml，抗体的亲和力均为nM级(10-9M)。
本发明的抗体
本发明提供了一种对H7N9和H7类病毒HA的HA1球状头部中受体结合区域有特异性结合的抗体，该抗体高亲和力的与H7N9病毒结合可阻止病毒与受体的结合，因此可阻止病毒侵入细胞而抑制病毒复制和扩散。
本发明示例性抗体包括兔源抗体H7N9-R003，H7N9-R006，H7N9-R019，H7N9-R031，H7N9-RA401，H7N9-RA403，H7N9-RA595，H7N9-R021和H7N9-R002。
抗体重链的CDR分别指H-CDR1，H-CDR2，H-CDR3，同样，抗体轻链的CDR分别是L-CDR1，L-CDR2和L-CDR3。CDR氨基酸的位置根据IMGT编号系统定义为CDR1-IMGT位置27-38，CDR2-IMGT位置56-65以及CDR3-IMGT位置105-117。
表1和2分别提供了本发明示例性抗体的重链和轻链的6个CDR的氨基酸序列。
表1：H7N9兔中和抗体的轻链CDR1-3的氨基酸序列
a：所有的CDR序列同源性都以H7N9-R002为标准
表2：H7N9兔中和抗体的重链CDR1-3的氨基酸序列
a：所有的CDR序列同源性都以H7N9-R002为标准
在一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段包含至少一个CDR，该CDR的序列与SEQID NO:1-19中的任一个具有至少95％的序列同源性，其中所述抗体中和人感染H7N9甲型流感病毒。
本发明的示例性抗体包括兔源抗体H7N9-R003，H7N9-R006，H7N9-R019，H7N9-R031，H7N9-RA401，H7N9-RA403，H7N9-RA595，H7N9-R021、H7N9-R002和人源化抗体H7N9-H002，在一个实施例中，本发明的抗体及其抗体片段的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列见SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:37，其人源化抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列见SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
在一个实施例中，本发明的抗体及其抗体片段包含轻链可变区，其具有与SEQ IDNO:28中所述序列约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一实施例中，本发明的抗体及其抗体片段包含重链可变区，其具有与SEQ ID NO:37中任一所述序列约92％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明的抗体及其抗体片段包含轻链可变区，其具有与SEQ IDNO:56中所述序列约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的抗体及其抗体片段包含重链可变区，其具有与SEQ ID NO:57中任一所述序列约92％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明的抗体及其抗体片段包含轻链可变区，其具有与SEQ IDNO:20，21，22，23，24，25，26，27或28中任一所述序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一实施例中，本发明的抗体及其抗体片段包含重链可变区，其具有与SEQ ID NO:29，30，31，32，33，34，35，36或37中任一所述序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
表3：H7N9兔中和抗体的轻链和重链可变区的序列
a：所有的可变区序列同源性都以H7N9-R002为标准
本发明还包括一种抗体或其抗体片段，其与本发明的抗体或与本发明的抗体竞争即结合相同的表位的抗体。包括但不限于H7N9-R003，H7N9-R006，H7N9-R019，H7N9-R031，H7N9-RA401，H7N9-RA403，H7N9-RA595，H7N9-R021、H7N9-R002及其人源化抗体H7N9-H002的单克隆抗体。
本发明的抗体可以是任何同种型(如IgA，IgG，IgM，即α、γ或μ重链)，但主要为IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚类。本发明的抗体可以具有κ或λ轻链。
抗体的制备
本发明的抗体可以用本领域已知的任何方法来准备。例如将抗体的序列***到相应的真核表达载体中，转染进入细胞，如采用293细胞瞬时表达获得抗体的技术，采用CHO细胞稳定表达获得抗体的技术。通常采用高密度细胞培养技术来获得抗体高产量。
抗体的纯化技术，包括制备药物级抗体的技术也是本领域已知的。可以利用离心、过滤，亲和、电荷、分子量、疏水性等多种色谱法来纯化抗体。
本发明的抗体片段的制备方式也是本领域已知的，包括用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶消化，或者抗体的片段可以通过克隆或表达部分的重链或轻链的序列来获得。抗体片段可以包括scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。示例性分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双抗体。
任何合适的宿主细胞/载体系统可以用于编码本发明的抗体分子及其片段的DNA序列的表达。合适的宿主系统包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO，HEK293，PER.C6、NSO、SP2。
本发明的抗体可以通过以下步骤制备：i)在合适的宿主细胞中表达本发明的核酸序列，和ii)分离表达的抗体产物，iii)纯化抗体。
抗体表位
本发明的抗体可以用于对它们所结合的表位进行分析。本发明人已经找寻到中和H7N9甲型流感病毒感染抗体结合HA蛋白上的表位。在一实施例中，抗体针对HA的球状头部中唾液酸结合区域的结合表位已分析获得。本发明的抗体所结合的表位可以是线性连续的或构象不连续的氨基酸序列。
本发明的抗体所识别的表位可以具有多种用途。纯化或合成形式的表位及其模拟表位可以用于提高免疫应答(即，作为疫苗或用于其它用途的抗体制备)，或用于筛选与表位或其免疫表位发生免疫反应的抗体的血清。
本发明的表位还可以用于筛选结合所述表位的配体。这样的配体包括但不限于抗体(不同种属)、抗体片段、肽等其他可以阻止表位因而预防感染的类似病毒蛋白。
本发明的表位还可以用于诊断工具的研发和应用。这样的应用包括直接测试和标记后的使用。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体和/或抗体片段和/或编码这样的抗体的核酸和/或由本发明的抗体所识别的表位。药物组合物还可以含有药学可接受的载体。载体本身不应诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体的产生，且不应当有毒。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。
本发明的药物组合物一般具有5.5-8.5的pH值，在一些实施方案中，pH可以为7.4，可以通过使用缓冲液来维持pH值。组合物可以是无菌和/或不含热原的，是对于人体液呈等渗的。
药物组合物可包含有效量的本发明的一种或多种抗体和/或包含结合本发明的抗体的表位多肽，即足以治疗、改善或预防期望的疾病或疾病状况或者足以表现出可检测的疗效的量。
医学治疗和用途
本发明的抗体和抗体片段或其衍生物及变体可用于人感染H7N9甲型流感病毒感染的治疗、预防和诊断。
本发明提供了i)抗体、抗体片段或其变体及其衍生物；ii)本发明中抗体的生产方式；iii)能够结合本发明抗体的表位；或iv)配体，优选可用于治疗的能够结合表位的抗体，所述表位结合本发明的抗体。
在一个实施例中，向需要治疗和预防的受试者给予本发明的抗体、抗体片段、表位或组合物。这样的受试者包括但不限于感染H7N9甲型流感病毒的病人，面临H7N9甲型流感病毒感染风险或对H7N9甲型流感病毒易感染的受试者，例如免疫功能低下的受试者。由于本发明中提供的抗体对亚型内病毒的广谱保护效应，本发明抗体可对其他H7系列的流感抗体具有类似的质量和预防效果。
本发明的抗体或抗体片段可用于被动免疫或主动免疫。
本发明中所述抗体及其片段也可用于诊断H7N9进行流感病毒感染的试剂盒。此外，能够结合本发明的抗体的表位可以用在试剂盒中，以通过检测保护性抗H7N9甲型流感病毒抗体的存在来监测疫苗接种程序的效率。本发明所述的抗体、抗体片段或其变体及衍生物也可以用在试剂盒中，以监测具有期望的免疫原性的疫苗的生产。
本发明还提供一种制备药物的方法，该方法包括将单克隆抗体与一种或多种药学可接受的载体混合的步骤。包括获得(如通过表达和纯化)单克隆抗体，将其与药物载体混合的步骤可以在不同的时间，有不同的人员在不同的地点进行。
本发明的抗体是从HA蛋白免疫的兔抗体中筛选，通过人源化改造获得可药用的抗体。构建真核表达载体，转染CHO细胞系，细胞高密培养表达、分离纯化生产抗体。抗体的优化，包括密码子的优化和抗体亲和力成熟优化。本发明覆盖这些步骤中使用和制备的所有核酸、载体、序列、抗体等。
实施例
在以下的实施例中提供了本发明的示例性的实施方案。以下的实施例仅通过示例的方式给出，并用于帮助普通技术人员使用本发明。所述实施例并不能以任何方式来限制本发明的范围。
实施例1.兔源抗H7N9病毒中和抗体活性和序列信息分析
在H7N9病毒爆发前，已构建了H7N7(A/Netherlands/219/2003)和H7N9(A/Anhui/1/2013)血凝素蛋白的兔抗体文库，用293哺乳动物瞬时表达和昆虫系统表达获得的H7N9病毒(A/Anhui/1/2013)的血凝素蛋白对该兔抗体文库进行淘洗，筛选获得30株抗人感染H7N9病毒血凝素蛋白特异性抗体。将抗体序列构建到真核表达载体中，在293哺乳动物瞬时表达系统中生产获得毫克级量的抗体。测试抗体对多种H7N9病毒血凝素蛋白的结合能力(表4)，同时采用血凝抑制试验来检测抗体的活性，检测抗体抑制H7N9病毒血凝素蛋白的豚鼠血红细胞凝集的能力。当凝集试验中加入2μg/mL的重组H7N9(A/Anhui/1/2013)血凝素蛋白时，其中有11株有血凝抑制活性的兔单克隆抗体，并且这11株抗体都拥有高灵敏度的血凝抑制能力(图1)。
表4：11株筛选获得的血凝抑制抗体及其亚型广谱HA蛋白结合能力
对这11株有很好的血凝活性的抗体的CDR进行分析，其中有9株抗体来源于同一个胚系基因族，轻链来源于IGKV1S56*01，其CDR1-3的氨基酸序列变异见表1，重链来源于基因族IGHV1S34*01，其3个CDR1-3的氨基酸序列见表2。轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列和同源性见表3。抗体共用相同的CDR序列或少量突变的CDR序列抗体的结合区域比较类似，该结果也与这些抗体都具有血凝抑制活性相吻合。
实施例2.人源化抗体具有高效的病毒中和活性
根据抗体的表达水平和中和活性，选用了H7N9-R002这株兔抗体进行人源化设计获得H7N9-H002人源化抗体，人源化改造技术是按照最经典的CDR移植方法并针对兔源抗体进行的设计。通过全基因合成的方式获得人源化抗体基因序列，并构建到真核表达载体中，在293哺乳动物瞬时表达系统中生产出毫克级到克级蛋白量的抗体。通过与H7N9血凝素蛋白的亲和力检测筛选保留兔抗体亲和力的人源化抗体，获得亲和力最高的人源化抗体H7N9-H002，其抗体轻链的可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:56，核苷酸序列为SEQ ID NO:58，抗体重链的可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:57，核苷酸序列为SEQ ID NO:59。检测该人源化抗体与多种重组H7N9血凝素蛋白的亲和力，具体实验如下：将H7N9-H002抗体生物素化后结合固定在链亲和素芯片的表面，稀释重组血凝素蛋白到不同浓度，检测与抗体的结合和解离速率，计算获得抗体结合抗原蛋白的亲和力常数。检测结果见表5。
表5：H7N9-H002人源化抗体与不同重组H7N9血凝素蛋白的亲和力检测
病毒
kon(1/Ms)<sup>(a)</sup>
kdis(1/s)<sup>(b)</sup>
K<sub>D</sub>(M)
A/Anhui/1/2013
2.32E+04
1.72E-04
7.42E-09
A/Shanghai/1/2013
3.00E+04
1.63E-04
5.42E-09
A/Hangzhou/1/2013
3.74E+04
1.37E-04
3.68E-09
A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013
3.96E+04
1.13E-04
2.85E-09
A/Hangzhou/3/2013
4.55E+04
2.81E-04
6.16E-09
a：结合速率常数
b：解离速率常数
采用豚鼠红细胞凝集抑制试验来检测人源化H7N9-H002抗体与原兔抗体H7N9-R002的抗凝集能力。具体实验如下：将系列稀释的抗体与4个凝集单位的不同HA蛋白进行1h的温育，再加入等体积的1％豚鼠血红细胞，室温下温育30分钟，获得血凝抑制的浓度(图1和图2)。相对于原兔抗体，H7N9-H002人源化抗体拥有更高的血凝抑制效价，针对不同的重组流感血凝素蛋白，中和抗体浓度在0.031～0.25μg/mL的范围。
采用病毒微中和实验检测人源化H7N9-H002抗体与原兔抗体H7N9-R002的病毒中和能力，具体实验如下：不同浓度稀释的抗体与100×50％TICD50的H7N9(A/Anhui/1/2013)病毒在37℃温育1小时。100μL的病毒和抗体混合物加入到MDCK细胞中培养，2小时后，吸去培养上清液，并用MEM清洗细胞后，替换为100μL的含1μg/mL TPCK处理的胰酶的MEM培养基。37℃培养3天后，计数CPE(病毒斑)。50％的MDCK细胞无感染的最低抗体浓度为抗体的中和浓度。该数据见图3，人源化抗体比原兔抗体拥有明显降低的病毒中和滴度，其体外抑制H7N9病毒的抗体滴度高达0.025μg/mL。
实施例3.人源化抗H7N9抗体的重组生产
表达糖基化的抗H7N9单克隆抗体的宿主细胞可来源于多种组织，但优选为脊椎动物细胞。可用的细胞系有SV40转化的猴肾CV1细胞系(ATCC CRL 1651)，人胚胎肾细胞(293或悬浮培养的293)【Graham et al.,J.Gen Virol.197736:59】，婴幼仓鼠肾细胞(BHK-21ATCC CCL 10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-ATCC CRL 9096)，猴肾细胞(CV1ATCCCRL90)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76 ATCC CRL 1587)，人子宫癌细胞(HELA ATCC CCL 2)，犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)，人肺细胞(W138，ATCC CCL95)，人肝细胞(Hep G2,HB 8065)等。
本发明中，产生抗H7N9单克隆抗体的细胞，如CHO细胞可在多种培养基中培养。商业化的培养基如DMEM，MEM，Ham’s F12，RPMI-1640(Gibco)都可用于宿主细胞的培养。此外，Ham et al.,Meth.Enz.1979 58:44；Barnes et al.,Anal.Biochem.1980 102:255；U.S.Pat.Nos.4,767,707；4,657,866；4,927,762中的培养基均可用于培养宿主细胞。宿主细胞的培养条件，如温度，pH值等也是本领域技术人员熟知的常规条件。
人源化抗H7N9单克隆抗体转染哺乳动物宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为CHO/dhfr-细胞时，可选用如下的DNA转染方法有磷酸钙共沉淀法【Jordan et al.,Nucleic Acids Res.1996 24:4】，脂质体包装法(如lipofectamine2000)【Audouy S.et al.,Mol Membr Biol.2001 18(2):129】，电穿孔法和显微注射法【Morrison et al.,Science 1985 229:1202】。我们采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染法，按其使用说明，4种N2-1、N5-4、N6-3、N8-3完整抗体序列的表达载体pIRESneo3d-anti-H7N9各制备1.5μg质粒和4.5μL Lipofectamine 2000的混合物，共转染6孔板的一个孔中6×105个细胞，过夜转染后，将细胞平均分配到1块96孔板中。
完整抗体转染的CHO细胞在DMEM+5％dFBS+1.0mg/mL G418下进行筛选，每2-3天更换筛选培养基，培养2-3周各获得20多个筛选细胞克隆。将细胞按相同的密度传至24孔板中，在0.5mL DMEM+5％dFBS培养基中培养5天，ELISA检测培养基上清液中人源化抗H7N9单克隆抗体的表达量。
为了使G418筛选的人源化抗H7N9单克隆抗体细胞更高效的表达，选较高表达水平的细胞进行MTX扩增表达。具体操作为，重组CHO细胞在DMEM+5％dFBS培养基中培养，并在培养过程中加入逐步增加的MTX浓度，培养过程中持续监测抗体的表达水平，当MTX浓度增加到细胞生长无法耐受时停止增加MTX浓度，在T25培养瓶中培养五天后ELISA检测培养基清液中人源化抗H7N9单克隆抗体的表达量。采用高密细胞培养工艺培养抗体生产细胞，经过工艺优化获得0.8～1.4g/L产量的公斤级抗体生产工艺。将浓度高达25mg/mL的H7N9-H002抗体制备到PBS缓冲液中(Na2HPO4 10mM,KH2PO4 1.8mM,NaCl 137mM,KCl 2.7mM,pH7.4)。
实施例4.人源化抗体在攻毒模型中的体内预防和治疗效果
H7N9的攻毒模型选用4-6周龄的BALB/c母鼠，摸索半数致死剂量(LD50)所需要的病毒滴度。经过摸索，确定10倍的LD50的病毒剂量为2.5×106TCID50。
预防效果研究中，每组选用10只小鼠，静脉注射1，3，10或20mg/kg的H7N9-H002人源化抗体，24小时后，鼻腔感染10倍LD50的H7N9(A/Anhui/1/2013)病毒。观察2周内小鼠的死亡率，记录体重变化，检测1mg/kg剂量组的病毒滴度和组织病理学染色分析。结果显示，溶媒组的10只小鼠在11天时全部死亡，而所有的给药剂量组都获得了100％的死亡保护率(图5)，体重数据也与剂量具有明显的相关性(图5)，只是在1mg/kg的剂量组中出现小鼠的体重短暂明显下降。在1mg/kg的剂量组中，小鼠肺和鼻腔的病毒滴度下降约100倍(表6)，因此可以有效的降低体内病毒量，减轻免疫系统对病毒的过度反应，有效的减少了体重的下降和病毒对肺组织的损伤。
表6：肺和鼻腔组织中抗体给药组和溶媒组的病毒滴度比较(1mg/kg剂量预防组)
治疗效果研究中，10只小鼠一组，鼻腔感染10倍LD50的H7N9(A/Anhui/1/2013)病毒，第一个剂量组为感染3小时，1天和3天后静脉注射20mg/kg的抗体，第二个剂量组为感染1天和3天后静脉注射40mg/kg的抗体。观察2周内小鼠的死亡率，记录体重变化，检测20mg/kg，1天后给药剂量组的病毒滴度和组织病理学染色分析。结果显示，溶媒组的10只小鼠在10天时全部死亡，而20mg/kg剂量感染3小时后给药组和40mg/kg剂量感染1天后给药组的小鼠存活率都高达90％(图6和7)。小鼠的死亡率和体重数据(图6和7)与给药剂量和给药时间成相关性，显示该抗体具有明确的治疗效果。20mg/kg剂量组感染1天后给药的肺和鼻腔的病毒滴度下降1000倍以上，明显的降低了病灶组织的活病毒水平(表7)。相对于溶媒组，肺组织病理染色也显示有较明显的炎症减轻症状。
表7：肺和鼻腔组织中抗体给药组和溶媒组的病毒滴度比较(20mg/kg剂量治疗组)
a：低于病毒检测极限
实施例5.H7N9-H002结合HA蛋白的表位分析
人源化抗体H7N9-H002具有HA致血凝的抑制活性，该抗体的结合区域在HA蛋白的HA1亚基上，并且与HA的受体唾液酸的结合区域有很大的重叠。采用Discovery Studio 3.5蛋白结构模拟软件，我们对H7N9-H002抗体的空间结构进行模拟，获得了较为准确的抗体构象。采用Discovery Studio 3.5蛋白相互作用位点对接软件，分析了H7N9-H002在H7N7(A/Netherlands/219/2003)[PDB entry:4DJ6]晶体结构上的结合位点。由于H7N7A/Netherlands/219/2003和H7N9 A/Anhui/1/2013的血凝素蛋白氨基酸同源性高达94.6％，并且H7N9-H002可以很好的结合H7N7A/Netherlands/219/2003的血凝素蛋白，因此我们认为抗体结合H7N7A/Netherlands/219/2003的血凝素蛋白的区域同样为结合H7N9 A/Anhui/1/2013血凝素蛋白的区域。该区域主要包含3个部分：i)HA1头部最外侧的β片层(154-162aa)区域；ii)唾液酸受体结合最重要的HA1环形区域(213-218aa)；iii)一个3维的突出、由Gln53,Gln65,Arg81,Glu82和Ser84组成的区域。具体的结合氨基酸分析结果见图8和表8。
表8：H7N9-H002结合H7N9病毒血凝素蛋白的氨基酸位点
实施例6.H7N9-H002与H7N9的不同毒株及与其他类型的H7病毒的结合情况采用昆虫杆状病毒表达系统表达7株有氨基酸点突变的H7N9病毒毒株(A/Anhui/1/2013，A/Shanghai/1/2013，A/Hangzhou/1/2013，A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013，A/Hangzhou/3/2013，A/Shanghai/4664T/2013，A/Zhejiang/1/2013)和7株其他类型的H7毒株[A/turkey/Italy/4602/99(H7N1)，A/chicken/SK/HR-00011/2007(H7N3)，A/turkey/Italy/214845/2002(H7N3)，A/equine/Kentucky/1a/1975(H7N7)，A/mallard/Netherlands/33/2006(H7N8)，A/chicken/Netherlands/1/03(H7N7)，A/Netherlands/219/2003(H7N7)]共计14种HA，将HA蛋白按照0.0125μg/mL和0.025μg/mL 2种浓度包被在96孔ELISA板上(0.0125μg/ml～0.4μg/ml)，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入2μg/mL的H7N9-H002，室温作用1h。1h后洗板，加入检测抗体山羊抗人IgG Fc/HRP，室温下作用1h后，洗板，加入TMB显色，终止后测定OD450.显色反应的颜色深浅与孔内包被的HA蛋白浓度成正比。ELISA结合的结果见图9和图10，数据显示抗体都能很好的与这些病毒的HA蛋白结合。基于病毒作用的机理、抗原抗体结合能力，H7N9-H002对H7N9病毒的变异体及其他类型的H7病毒都将有很好的病毒中和效果。
序列表
<110> 神州细胞工程有限公司
<120> 一种中和人感染H7N9甲型流感病毒的抗体及其用途
<130> H7N9
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
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Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
100 105 110
<210> 27
<211> 110
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 27
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn
20 25 30
Asn Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Thr Leu
35 40 45
Leu Ile Trp Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Val Asn Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 110
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 28
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asn
20 25 30
Asn Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Thr Leu
35 40 45
Leu Ile Trp Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Val Asn Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 29
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn Glu
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asp Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
85 90 95
Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 30
<211> 111
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 30
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn Glu
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
85 90 95
Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 31
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn Glu
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
85 90 95
Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 32
<211> 111
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 32
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn Glu
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
85 90 95
Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 33
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn Glu
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
85 90 95
Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 34
<211> 112
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 34
Gln Glu Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn
20 25 30
Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Ser Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 35
Gln Gln Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn
20 25 30
Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
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Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asp Leu Asn Thr Val Thr Leu
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100 105 110
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 36
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Tyr Ser Asn Glu
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
85 90 95
Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 37
Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Arg Val Ser Gly Leu Ser Leu Phe Ser Asn
20 25 30
Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Arg Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Ser Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 38
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 38
gaccctatgc tgacccagac tgcatcgccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc aggccagtca gagtgtttat aataaaaata acttagcctg gtatcagcag 120
aaactagggc agcctcccaa actcctgatc tatgctgcat ccactctgac atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtgg tatttatgct 300
ttcggcggag gaaccaaggt ggagatcaaa 330
<210> 39
<211> 333
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 39
cagtcgttgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggatccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattgtc cctctatagc aatgaaataa attgggtccg ccaggctcca 120
gggaacgggc tggagtggat cggagccatt gctggtagtg gtagcgccga ctacgcgagc 180
tgggcgaaag gtcgatccac catcaccaga aacaccgacc tgaacacggt gactctgaaa 240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgtcatt ctgggacttg 300
tggggcccag gcaccctggt cactgtctct tca 333
<210> 40
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 40
gagctcgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcagttgcc agtccagtga gagtgtttat aagaacaaca acttagcctg gtttcagcag 120
aaactagggc agcctcccaa gctcctgatc tatgatgcat ccaaactggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcagtggcag tgggtctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtag taattatgct 300
ttcggcggag gaaccaagct ggagatcaaa 330
<210> 41
<211> 333
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 41
cagtcggtgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggatccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattgtc cctctatagc aatgaaataa attgggtccg ccaggctcca 120
gggaacgggc tggaatggat cggagccatt gctggtagtg gtagcgccga ctacgcgagc 180
tgggcgaaaa gccgatccac catcaccaga aacaccaacc tgaacacggt gactctgaaa 240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgtcatt ctgggacttg 300
tggggcccag gcaccctggt cactgtctct tca 333
<210> 42
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 42
gagcctatgc tgacccagac tgcatcgtcc gtgtctgcag ctgtgggagg ctcagtcacc 60
atcagttgcc agtccagtca gagtgttgat agtaacaacc aattatcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa actcctgatc tatgctgcat ccactctgac atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtgg tatttatgct 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 330
<210> 43
<211> 333
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 43
cagtcgttgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggatccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattgtc cctctatagc aatgaaataa attgggtccg ccaggctcca 120
gggaacgggc tggaatggat cggagccatt gctggtagtg gtagcgccga ctacgcgagc 180
tgggcgaaaa gccgttccac catcaccaga aacaccaacc tgaacacggt gactctgaaa 240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgtcatt ctgggacttg 300
tggggcccag gcaccctggt caccgtctct tca 333
<210> 44
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 44
gaccctatgc tgacccagac tgcagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcagttgcc agtccagtga gagtgtttat aagaacaaca acttagcctg gtttcagcag 120
aaactaggcc agcctcccac gctcctgatc tgggatgcat ccaaactggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcagtggcag tgggtctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtgt taattatgct 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa 330
<210> 45
<211> 333
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 45
cagtcggtgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggatccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattgtc cctctatagc aatgaaataa attgggtccg ccaggctcca 120
gggaacgggc tggaatggat cggagccatt gctggtagtg gtagcgccga ctacgcgagc 180
tgggcgaaaa gccgatccac catcaccaga aacaccaacc tgaacacggt gactctgaaa 240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgtcatt ctgggacttg 300
tggggcccag gcaccctggt cactgtctct tca 333
<210> 46
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 46
gagctcgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcagttgcc agtccagtga gagtgtttat aagaacaaca acttagcctg gtttcagcag 120
aaactagggc agcctcccaa gctcctgatc tatgatgcat ccaaactggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcagtggcag tgggtctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtag taattatgct 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa 330
<210> 47
<211> 333
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 47
cagtcgttgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggatccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattgtc cctctatagc aatgaaataa attgggtccg ccaggctcca 120
gggaacgggc tggaatggat cggagccatt gctggtagtg gtagcgccga ctacgcgagc 180
tgggcgaaaa gccgttccac catcaccaga aacaccaacc tgaacacggt gactctgaaa 240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgtcatt ctgggacttg 300
tggggcccag gcaccctggt cactgtctct tca 333
<210> 48
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 48
gaccctatgc tgacccagac tgcatcgtcc gtgtctgcaa ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcagttgcc agtccagtca gagtgttgat aataacaaag atttagcctg gtttcagcag 120
aaaccagggc actctcctaa gctcctgatc tattttgcgt ccagactggc atctggggtc 180
ccgtcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacacttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtgc taattatgct 300
ttcggcggag gaaccaagct ggagatcaaa 330
<210> 49
<211> 336
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 49
caggagcagc tgatggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctggaggatc cctgacactc 60
acctgcacag tctctggatt gtccctctat agcaatgaaa taaattgggt ccgccaggct 120
ccagggaacg ggctggaatg gatcggagcc attgctggta gtggtagcgc cgactacgcg 180
agctgggcga aaagccgttc caccatcacc agaaacacca acctgaacac ggtgactctg 240
aaaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgtc attctgggac 300
ttgtggggcc caggcaccct ggtcactgtc tcttca 336
<210> 50
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 50
gaccctatgc tgacccagac tgcatccccc gtgtctgcgg ctgttggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc agtccagtca gagtgtctat aataacaacc gcttatcctg gtttcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattctgcat ccactctggc atctggggtc 180
tcatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtgg tatttatgct 300
ttcggcggag ggaccgagct ggagatccta 330
<210> 51
<211> 336
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 51
cagcagcagc tgatggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctggaggatc cctgacactc 60
acctgcacag tctctggatt gtccctctat agcaatgaaa taaattgggt ccgccaggct 120
ccagggaacg ggctggaatg gatcggagcc attgctggta gtggtagcgc cgactacgcg 180
agctgggcga aaagtcgatc caccatcacc agaaacaccg acctgaacac ggtgactctg 240
aaaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgtc attctgggac 300
ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccgtc tcttca 336
<210> 52
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 52
gagctcgtgc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcagc 60
atcagttgcc agtccagtca gagtgtttat aagaacaaca acttagcctg gtttcagcag 120
aaactaggcc agcctcccac gctcctgatc tgggatgcat ccaaactggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcagtggcag tgggtctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtgt taattatgct 300
ttcggcggag gaaccaagct ggagatcaaa 330
<210> 53
<211> 333
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 53
cagtcgctgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggatccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattgtc cctctatagc aatgaaataa attgggtccg ccaggctcca 120
gggaacgggc tggaatggat cggagccatt gctggtagtg gtagcgccga ctacgcgagc 180
tgggcgaaaa gccgttccac catcaccaga aacaccaacc tgaacacggt gactctgaaa 240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgtcatt ctgggacttg 300
tggggcccag gcaccctggt cactgtctct tca 333
<210> 54
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 54
gagctcgatc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcagttgcc agtccagtga gagtgtttat aagaacaaca acttagcctg gtttcagcag 120
aaactaggcc agcctcccac gctcctgatc tgggatgcat ccaaactggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcagtggcag tgggtctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtggtgt taattatgct 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa 330
<210> 55
<211> 336
<212> DNA
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 55
cagcagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctggaggatc cctgacactc 60
acctgcagag tctctggatt atccctcttt agcaatgaaa taaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaacg ggctggaatg gatcggagcc attggtggtg gtggtagcgc cgactacgcg 180
agctgggcga agagccgatc caccatcacc agaaacacca acctgaacac ggtgactctg 240
agaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccgcctatt tctgtgcgtc attctgggac 300
ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccgtc tcttca 336
<210> 56
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asn
20 25 30
Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Trp Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Val Asn Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Leu Phe Ser Asn
20 25 30
Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Ser Phe Trp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 58
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gacatccaga tgacccagag cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggaga cagggtgacc 60
atcacttgtc agtcctctga gtctgtctac aagaacaaca acctggcttg gtatcaacag 120
aagcctggca agcctccaaa actgctgatt tgggatgcca gcaaactggc atctggagtg 180
ccaagcaggt tctctggctc tggctctggc acagacttca ccctgaccat ctcctccctc 240
caacctgagg atgtggctac ctactactgt gctggagact actctggagt gaactatgcc 300
tttggaggag gcacagaggt ggtggtgaag 330
<210> 59
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gaggtccaac ttgtggagtc tggaggagga ctggtgaagc ctggaggctc cctgagactg 60
tcctgtgctg cctctggact gtccctgttc agcaatgaga taaactgggt gagacaggct 120
cctggcaagg gattggagtg gattggagcc attggaggag gaggctctgc tgactatgcc 180
tcctgggcta agagcaggtt caccatcagc agggacaatg ccaagaactc cctctacctc 240
caaatgaact ccctgagggc tgaggacaca gcagtctact tctgtgcctc cttctgggac 300
ctgtggggac ctggcaccct ggtgacagtg tcctct 336