抗人cd147的单克隆抗体、表达载体、细胞株及其应用
阅读说明：本技术 抗人cd147的单克隆抗体、表达载体、细胞株及其应用 (Anti-human CD147 monoclonal antibody, expression vector, cell strain and application thereof ) 是由 陈志南 朱平 边惠洁 杨向民 张征 张阳 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗人CD147的单克隆抗体、细胞株、表达载体及其应用。本发明抗体可用于制备抗体偶联药物,也可用于制备诊断和治疗CD147表达阳性疾病药物及其生物技术产品。(The invention discloses an anti-human CD147 monoclonal antibody, a cell strain, an expression vector and application thereof. The antibody of the invention can be used for preparing antibody conjugate drugs, and can also be used for preparing drugs for diagnosing and treating CD147 expression positive diseases and biotechnological products thereof.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明提供了三株抗CD147分子的人源化抗体抗人、相关细胞株、表达载体及其应用。
背景技术
CD147曾有多种不同的命名，包括TCSF/EMMPRIN，M6，Basigin,Neurothelin,与小鼠Basing/gp42,大鼠OX-47/CE-9和鸡HT7/5A11等不同种属来源抗原有较高同源性，该基因最终被人类基因命名委员会HUGO确定为Basigin；而人类白细胞分化抗原协作组则将来自各实验室不同的命名统一为CD147，分属内皮细胞组。该分子是一种高度糖基化的、分子量为50～60kD的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。在人类， CD147共有269个氨基酸组成，可分为胞外区、跨膜区及胞内区。N端起始翻译后前21 个残基为信号肽，22～205构成胞外区，206～229为跨膜区，具有典型的亮氨酸拉链结构，C端230～269为胞内区。已证实CD147在许多类型的人实体瘤，如肺癌、肝癌、***、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、或胃癌中过度表达。
既往研究表明，CD147分子是肿瘤发展过程重要的功能性膜蛋白，参与多种与癌症有关的现象，并且，多项回顾性研究还表明CD147分子在肿瘤组织中的表达强度与肿瘤病人的预后之间，存在着紧密的相关性。在非小细胞肺癌病人中，CD147表达增高的水平与病人的预后情况密切相关。因此，CD147分子已成为肿瘤治疗的新靶点，其中抗体药物“碘[131I]美妥昔单抗注射液—利卡汀”的研制成功，证明了该靶点成药的安全性和有效性。
单克隆抗体(McAb)以其高特异性、高亲和力、毒副作用小、免疫原性低、体内作用时间长、可用体内自身免疫系统发挥疗效等优点，在许多疾病的诊疗中得到广泛应用，成为新型药物研制的一条有效途径。然而，鼠源McAb重复注入人体内会引起患者诱发人抗鼠抗体(human anti mouse antibody，HAMA)反应，出现全身过敏毒性反应并阻断抗体功效的发挥。
发明内容
基于现有技术的需求、不足和缺陷，本发明提供了抗人CD147的单克隆抗体、表达载体、细胞株及其应用。
本发明提供的抗人CD147的单克隆抗体，该抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为：
WBP247.hAb12抗体：重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:111所示序列或与SEQID NO:111所示序列同源性为90％以上的序列，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:113所示或与SEQ ID NO:113所示序列同源性为90％以上的序列；
WBP247.hAb4抗体：重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:103所示序列或与SEQID NO:103所示序列同源性为90％以上的序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:105所示序列或与SEQ ID NO:105所示序列同源性为90％以上的序列；
或者为，
WBP247.hAb6抗体：重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:107所示序列或与SEQID NO:107所示序列同源性为90％以上的序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:109所示序列或与SEQ ID NO:109所示序列同源性为90％以上的序列。
进一步，本发明的WBP247.hAb12抗体的重链可变区的氨基酸序列所包含特定的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列分别为SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，轻链可变区的氨基酸序列所包含的特定的抗原互补决定区的CDR1、CDR2和 CDR3序列分别为SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
本发明抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列为：
WBP247.hAb12抗体：重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:110所示序列或与SEQID NO:110所示序列同源性为90％以上的序列；轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:112所示序列或与SEQ ID NO:112所示序列同源性为90％以上的序列；
WBP247.hAb4抗体：重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:102所示序列或与SEQID NO:102所示序列同源性为90％以上的序列；轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:104所示序列或与SEQ ID NO:104所示序列同源性为90％以上的序列；
或者为，
WBP247.hAb6抗体：重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:106所示序列或与SEQID NO:106所示序列同源性为90％以上的序列；轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:108所示序列或与SEQ ID NO:108所示序列同源性为90％以上的序列。
另一方面，本发明提供的表达上述单克隆抗体的细胞株，该细胞株的命名和保藏编号为：
表达WBP247.hAb12抗体的细胞株：该细胞株于2019年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，命名为：重组中国仓鼠卵巢细胞247C-B4Z2-01-C-005，保藏编号为：CCTCC NO.C2019147；
表达WBP247.hAb4抗体的细胞株：该细胞株于2019年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，命名为：重组中国仓鼠卵巢细胞247A-B9Z4-02-C-T9，保藏编号为：CCTCC NO.C2019148；
或者为，
表达WBP247.hAb6抗体的细胞株：该细胞株于2019年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，命名为：重组中国仓鼠卵巢细胞247B-B9Z4-01-C-T9，保藏编号为：CCTCC NO.C2019149。
本发明还提供了上述单克隆抗体的表达载体。
进一步，本发明提供的上述单克隆抗体的制备方法。所提供的方法包括：
a)获取权利要求1、2或3所述抗体的DNA分子序列；
b)构建表达载体，该表达载体含有步骤a)中所述的DNA分子及表达该DNA分子的调控序列；
c)用步骤b)中所述的表达载体转染宿主细胞，特别是哺乳动物细胞，优选的是CHO细胞；在适合所述宿主细胞的培养条件下培养；
d)经过分离纯化步骤获得上述单克隆抗体。
本发明抗体可降低鼠源McAb重复注入人体内引起的人抗鼠抗体(human antimouse antibody，HAMA)反应，避免全身过敏毒性反应。通过ELISA分析法对所获得的抗体进行亲和力的分析，本发明人源化抗体的EC50值约为嵌合抗体WBP247.cAb1的一半，亲和力约高于嵌合抗体一倍。
优选的，本发明的人源化抗体WBP247.hAb12具有的重链可变区氨基酸序列为SEQID NO:111所示的序列，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:113所示的序列，表达制备的该抗体的EC50为0.002614ug/ml，较亲本的嵌合抗体WBP247.cAb1的EC50(0.0382nM) 提高了约一倍，该抗体可以与肺癌、肝癌等实体肿瘤特异结合。
此外，稳定筛选了人源化抗体WBP247.hAb4和WBP247.hAb6，经过检测，表达制备的这两株抗体的EC50分别为0.002864ug/ml和0.003022ug/ml，该抗体可与肝癌等实体肿瘤特异结合。
在上述实例抗体的构建中，轻链恒定区为κ，重链恒定区为IgG1组成，本发明也保护其它抗体的同种型，如IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD，IgE。本发明也保护抗体的抗原结合片段，包括Fab，Fv，ScFv和单链抗体。
本发明抗体可在制备诊断和治疗CD147表达阳性疾病的药物及其生物技术产品、检测试剂、影像学和检验诊断等方面进行应用。
本发明还提供了上述抗体在制备抗体偶联药物中的应用。所述药物为美登素衍生物 DM1、微管蛋白聚合酶抑制剂MMAE或放射性核素碘。
附图说明
图1人源化抗体克隆1～4的SDS-PAGE分析；其中：按照附图所示的左图为纯化蛋白的非还原电泳样品，而右图为纯化蛋白的还原电泳样品。从左到右依次为：M为蛋白Marker；Lane1:克隆1；Lane2:克隆2；Lane3:克隆3；Lane4:克隆3(不同批次制备)；Lane5:WBP247.hAb4；Lane6:WBP247.hAb4(不同批次制备)；
图2SPR解离图谱测定人源化抗体亲和力，其中横坐标代表样品的响应时间，纵坐标代表结合后的信号值，图中的各线条为同一样品的不同的浓度稀释的检测曲线，表明随着剂量的变化有信号的特定改变；
图3人源化抗体克隆5～12的SDS-PAGE非还原电泳分析；其中Lane1:克隆5 non-reduced；Lane2:WBP247.hAb6 non-reduced；Lane3:克隆7non-reduced；Lane4: 克隆8non-reduced；Lane5:克隆9non-reduced；Lane6:克隆10non-reduced；Lane7: 克隆11non-reduced；Lane8:克隆12non-reduced；
图4人源化抗体克隆5～12的SDS-PAGE还原电泳分析；Lane1:克隆5reduced；Lane2:WBP247.hAb6 reduced；Lane3:克隆7reduced；Lane4:克隆8reduced；Lane5: 克隆9reduced；Lane6:克隆10reduced；Lane7:克隆11reduced；Lane8:克隆 12reduced；
图5人源化抗体克隆13～16的SDS-PAGE还原及非还原电泳分析；Lane1:克隆13reduced；Lane2:克隆14reduced；Lane3:克隆15reduced；Lane4:克隆 16reduced；Lane5:克隆13non-reduced；Lane6:克隆14non-reduced；Lane7:克隆 15non-reduced；Lane8:克隆16non-reduced；
图6筛选的3株抗体与抗原结合梯度稀释曲线；
图7全长人源化抗体免疫组化筛选图；附图中所示从左到右依次为WBP247.hAb5(肝癌)，WBP247.hAb12(32270)肝癌和WBP247.hAb12(32270)肺癌染色，其中棕色的区域表示为抗体染色阳性区域；
图8表达载体pWX2.1-LC-B-247B4质粒图谱；
图9表达载体pWX2.1-LC-B-247B12质粒图谱；
图10表达载体pWX1.1-HC-Z-247B4质粒图谱；
图11表达载体pWX1.1-HC-Z-247B6质粒图；
图12CD147人源化抗体对不同组织的免疫组化染色图；图中的棕色(深色)区域为抗体染色阳性区域，白色的Bar为100μm；
图13人源化抗体抗肿瘤细胞体外杀伤实验。
具体实施方式
一、术语解释：
免疫球蛋白：指一类结构上相关的糖蛋白，该糖蛋白由两对多肽链组成，一对低分子量的轻链(L)和一对高分子量的重链(H)，所有四条链通过二硫键互相连接。每条重链典型地由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。每条轻链典型地由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区(在本文中缩写为CL)组成。轻链恒定区典型地由一个结构域CL组成。VH和VL可进一步细分成高变区域(或序列上高变的高变区和/或结构确定的环的形式)，也称为互补决定区(CDR)，中间穿插着较其保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个 FR组成，从氨基末端到羧基末端按下面顺序排布，FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4(可参见Chothia和Lesk，1987)。典型地，在此区段中氨基酸残基的编号可通过 Kabat法则进行编号。SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd， PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.(1991)(本文用于重链可变结构域或轻链可变结构域均采用这种编号系统描述方法)。
人源化抗体：如在本文中使用的，指来源于非人抗体，典型地鼠科动物的抗体，对其经过改造后，该抗体保留或基本保留亲本抗体(parent antibody)的抗原结合特性，但其在人体中的免疫源性降低。由于本发明抗体由结构和功能特征限定，因此“人源化抗体”可与“抗体”交换使用。
互补决定区(CDR)：是指抗体含多种氨基酸的特征序列，这些氨基酸序列共同限定免疫球蛋白结合位点的可变片段(Fv)区对靶抗原CD147结合亲和力和特异性。
框架区(FR)：指***在CDR之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用来将CDR保持在适当的位置(允许CDR结合抗原)。轻链可变区和重链可变区均包含框架区(FR)和典型地三个CDR。
恒定区(CR)：指赋予效应子功能的抗体分子的部分。本发明中人源化抗体的恒定区均来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可选自五种同种型：α、δ、ε、γ或μ。进一步地，各种亚类的重链(例如，重链的IgG亚类)可引起不同效应子功能，因而，通过选择期望的重链恒定区，可生产具有期望的效应子功能的抗体。优选的重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)和γ4(IgG4)，更优选γ2(IgG2)。轻链恒定区可以是κ或λ型，优选为κ型。
嵌合Fab是将功能性抗体轻、重链可变区基因分别与人抗体的κ链和重链CH1恒定区基因进行重组，克隆到表达载体中构建成鼠-人嵌合的Fab基因表达载体，再转入宿主细胞表达。美国FDA于1994批准了首个人-鼠嵌合Fab抗体ReoPro(为抗血小板受体gIIb/IIIa)，用于抗血栓治疗。
CDR移植抗体即将鼠源单抗上全部六个CDR通过PCR等方法克隆到人抗体相应的框架区(FR)上构建成新抗体。与嵌合抗体相比，CDR移植进一步减少了抗体中异源序列的含量，降低了抗体异源性。
抗体的亲和力(avidity)：指两个分子之间，例如抗体和抗原之间相互作用的总强度。亲合力表征分子对(例如，抗体-抗原)之间结合的强度。分子X对配体Y的亲和力可由解离常数(KD)表示，解离常数是占据溶液中存在的一半的X分子的结合部位所需的Y浓度。更小的Kd表示更强或更高的亲和力相互作用，和需要更低的配体浓度来占据该部位。
免疫球蛋白重链或轻链的可变区或恒定区可按照描述的通过使用标准的重组DNA技术连接，从而创建可在适宜的宿主中被表达(从而产生所述免疫球蛋白链(一种或多种))的多核苷酸，或可通过使用肽化学合成连接的可变区和恒定区。
本发明的人源化抗体保存了亲本鼠源抗体的结合性质的重要部分，该亲本抗体也就是称为抗人CD147分子的鼠源性抗体HAb18，该细胞株的建立见《单克隆抗体通讯》,1989；2:33-36，陈志南,刘彦仿,杨继震等(已有专利：1.抗人肝癌单克隆抗体HAb18轻、重链可变区基因及其应用，专利号：ZL02114471.0，公开(公告)号： CN1381461A；以及2VARIABLEREGION GENE OF HEAVY/LIGHT CHAIN OF ANTI-HUMAN HEPATOMA MONOCLONAL ANTIBODYHAb18 AND USE THEREOF，(美国)专利号：US 7 638 619)。特别地，本发明的在抗人CD147鼠源亲本抗体基础上进行人源化改造，保留了特异性结合亲本抗体识别抗原的能力。通过优化和筛选，所获得的人源化抗体展现出与亲本抗体相同或基本相同的抗体结合亲和力(affinity)或亲合力(avidity)。
“人源化抗体”或“抗体”，如本发明中使用的，包括完整分子以及能与表位决定簇结合的它们的片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。这些抗体片段保留了选择性结合到人CD147的能力，这些片段的实施例包括，但不限于下面：
(1)Fab：定义为含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，通过酶木瓜蛋白酶将全抗体(wholeantibody)降解生成完整的轻链和一个重链的一部分；
(2)Fab’：定义为含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原，从而生成完整的轻链和重链的一部分；每个抗体分子可得到两个Fab’片段；
(3)(Fab’)2：定义为通过用酶胃蛋白酶处理但没有随后还原以获得抗体片段；(Fab)2是通过两个二硫键结合在一起的两个Fab’片段的二聚体；
(4)Fv：定义为含有表示为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；
(4)Fv：同源性(homology)是比较生物学中的一个中心概念，指在分子进化研究中，同源性一般是指两种核酸分子的核苷酸序列之间或两种蛋白质分子的氨基酸序列之间的相似程度。通常，同源性须通过序列测定来检验，但是DNA-DNA或DNA-RNA杂交可提供有价值判断(5)偶联(Coupling)，也作偶连反应、耦联反应、氧化偶联，是由两个有机化学单位(moiety)进行某种化学反应而得到一个有机分子的过程。根据类型的不同，又可分为交叉偶联和自身偶联反应。这里的抗体偶联是指将特定的药物化学反应集团或者小分子药物通过特定的试剂反应使其交交联到抗体分子上，从而提高抗体或小分子药物的杀伤和治疗效果。
本发明通过生物信息学分析明确了抗人CD147分子的鼠源性抗体HAb18(ZL02114471.0)轻、重链可变区的CDR和FR区基因，用计算机辅助抗体结构进行人源化设计，采用噬菌体展示抗体文库技术等分子生物学手段，对其可变区中的框架区进行人源化改造，获得了抗人CD147分子的人源化抗体可变区基因序列，构建了含全长抗体分子基因的真核表达系统，进一步在CHO宿主细胞中表达制备了抗人CD147人源化CDR 移植抗体。免疫组化及ELISA结果表明，筛选的抗人CD147分子的人源化抗体保持了和鼠源性亲本抗体相当的亲和力，并且维持了亲本抗体识别抗原的特异性。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。应当理解，这些实施例只是为了起到说明作用，而不是用来限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业试剂公司途径得到。
二、含抗人CD147分子的鼠源性抗体HAb18轻、重链可变区的噬菌体展示载体的构建
1.材料
杂交瘤细胞株HAb18，该细胞株的建立见《单克隆抗体通讯》,1989；2:33-36，陈志南,刘彦仿,杨继震等(专利：CN1381461A)。
HAb18G的鼠源VH和VL的PCR扩增引物：其中，VH基因扩增引物：
上游引物：HAb18-F，见序列表中SEQ ID NO:1；
下游引物1：Linker-HAb18-R1，见序列表中SEQ ID NO:2。
下游引物2：HAb18-linker-R2，见序列表中SEQ ID NO:3。
其中，VL基因扩增引物：
上游引物：HAb18-Linker-F1，见序列表中SEQ ID NO:4；
下游引物：HAb18-R，见序列表中SEQ ID NO:5。
2.方法和结果
2.1总RNA提取：参照总RNA提取试剂盒(OMEGA Total RNA R6834)抽提杂交瘤细胞HAb18GC2中的总RNA，并用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。
2.2逆转录cDNA：取1μg 2.1中得到的总RNA，参照RTreagent Kit DRR037A反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，-20℃冻存备用。
2.3 PCR扩增VH基因和VL基因:
用2.2制备的cDNA为模板，用VH基因扩增引物和VL基因扩增引物分别扩增得到鼠源的VH基因片段和VL基因片段，扩增体系按
PCR反应条件：94℃，5min；94℃，15s，54℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。
其中，VH基因先用上游引物HAb18-F与下游下游引物1Linker-HAb18-R1进行扩增，产物经过纯化后，再次选用HAb18-F与下游引物2HAb18-linker-R2扩增获得 VH基因。VL基因选用上游引物HAb18-Linker-F1与下游引物HAb18-R直接扩增而得。
2.4 ScFv基因的扩增：
以相同摩尔数混合2.3中得到的VH基因片段和VL基因片段，利用Overlap-PCR 扩增ScFv基因，扩增体系如下：
PCR反应条件：95℃，5min；95℃，15s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环； 72℃，10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察并回收目的条带。
2.5ScFv基因酶切及与载体连接及转化：将上述制备的扩增的ScFv基因片段及载体质粒pGEM-T载体(Promega)分别选用Nco I(NEB:C^CATGG)和Not I (NEB:GC^GGCCGC)进行酶切消化。取2.4的回收片段产物和pGEM-T载体分别为600ng 和3μg，加入限制性内切酶(NEB)各1μL，10×CutSmart缓冲液5μL，加水到50μL， 37℃酶切1.5h。
酶切体系如下：
37℃水浴消化后，分别加入5ul 10×上样缓冲液终止反应。1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切条带，紫外定量。
用T4噬菌体DNA连接酶进行连接反应，反应体系组成如下：
16℃过夜反应。取连接产物转化TG1感受态细胞。涂布于LB琼脂平板上，37℃培养过夜。第二天，随机挑取10个单克隆，用载体通用引物进行阳性克隆菌落鉴定，记录为pGEM-ScFv，进行测序验证，测序正确的克隆保存于-40℃备用。
三、抗CD147亲本单抗HAb18的CDR和FR序列标定
用www.expasy.org在线软件将编码抗CD147的鼠源性抗体HAb18，又名HAb18G 单克隆抗体(CN021144710)的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，依据Kabat数据库原则标定,这些标志性的序列将在进一步的人源化改造中予以保留。
单抗HAb18轻链可变区序列中标定的互补决定区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，分别见序列表中SEQ ID NO：6、SEQIDNO：7和SEQ ID NO：6所示。单抗HAb18 重链可变区序列中标定的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，分别见序列表中SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
四、抗体人源化改造的框架序列FR的选择
为了挑选合适的小鼠CDR移植在其上的人抗体框架序列，本发明人借助源自Kabat蛋白质数据库提供的抗体序列构建的人源抗体序列信息数据库；利用DiscoveryStudio(VIOVIA,version 3.5),通过同源模建、力学优化技术对人源化前后的抗体分子结构进行分析及替换，确保被替换的氨基酸不会改变VH和VL的整体骨架结构，特别是不会破坏β-strand二级结构，从而保持抗体原有亲和力。FR shuffling方法最早由Dall’Acqua提出，选择与鼠抗体序列FR区同源性较高的人抗体序列的FR区对鼠抗体进行随机取代来实现人源化，这种方法减少了理论库容和无关FR重组。
根据Kabat数据库来确定抗体可变区的FR区与CDR区。在抗体数据库中，利用鼠抗体HAb18的可变区序列进行同源性的比对。对于VH的FR1、FR2、FR3的改造，本发明分别参考了12个FR1的germline,4个FR2的germline以及10个FR3的germline， VH-FR4的序列与human的IGHJ1*01序列一致，保持不变；对于VL的FR1、FR2、FR3 的改造，参考了6个germline,9个germline以及7个germline；通过JH和JK来分别确认VH和VL的FR4区。通过同源建模，对人源化前后的抗体分子结构进行分析，确保被替换的氨基酸不能改变VH和VL的整体骨架结构，特别是不能破坏β-strand 二级结构，从而保持抗体原有亲和力。设计方案见表1和表2，最终设计的人源化抗体库的理论库容为1.8×10^5。
表1 VH framework中选择更换的氨基酸
表2 VL framework中选择更换的氨基酸
五、噬菌体展示CD147人源化抗体文库的构建和筛选
根据上述(三)获得的人抗体FR序列可变区序列及其可更换的氨基酸序列，这些序列的组合保留了亲本单抗HAb18的CDR序列(二)，即轻链可变区序列含有SEQ ID NO： 6、SEQIDNO：7和SEQ ID NO：8特征序列；重链可变区序列含有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11特征序列；在FR框架区中，按照附图1，2的候选位点，设计相应的PCR引物，重叠PCR的方法获得设计的含有突变位点全长基因；同时选择在哺乳动物细胞中常用的密码子进行部分替换，将获得的全长基因全部克隆入噬菌体载体pComb3Xss进行人源化抗体文库的构建和筛选。最终获得抗CD147的轻重链配对的有效人源化序列组合克隆16个。
1.CD147人源化抗体文库的引物设计
依据抗体人源化改造的框架序列FR的选择分析结果，设计抗体库引物共计70条，所有序列均以247开头，如247-A1，247-A2等，按顺序分别为序列表中SEQ ID NO： 12至SEQID NO：81。
2.基因扩增方案
按照Overlapping-PCR的步骤，具体的人源化抗体文库扩增方案如下：
引物选取模板长度
第一步
第二步
247-A1,B1,F1,G1,A12 VH 404bp
247-A13,A24 VL 394bp
第三步
247-A1,B1,F1,G1,A24 VH+VL 774bp
扩增目的片段；反应条件为95℃，3min；95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，40sec； 30个循环，最后72℃延伸，10min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR 产物。
3噬菌体展示文库构建
3.1噬菌体载体的克隆
选用Nco I(NEB:C^CATGG)和Not I(NEB:GC^GGCCGC)进行双酶切消化回收的PCR扩增的人源化抗体文库基因片段，具体条件同条件(一)2.5，经1％琼脂糖电泳分离后，用Gel Extraction Kit(Omega bio-tek)纯化酶切片段。然后，将纯化获得的酶切片段与NcoI/Not I双酶切的噬菌体载体pComb3Xss用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)进行连接，去离子后电转化TG1感受态细胞，接种于LB培养平板上进行克隆筛选。随机挑取48个单克隆，利用M13-48和M13-47引物进行阳性克隆菌落鉴定；统计库容，保存库于-80℃备用。
3.2辅助噬菌体的制备和滴定
挑取XL-1Blue单菌落接种5m1 SB-T+(20ug/ml)液，37℃振荡培养过夜。按1:500稀释接种入10ml SB-T+(20ug/ml)液，37℃振荡一小时。挑取单个噬菌体M13K07病毒空斑接入上述10ml菌液中，37℃振荡培养2小时后加入200m1SB-T+(20ug/ml)K+(70ug /ml)液，37℃振荡培养过夜。4000rpm 4℃离心15分钟，取上清测定噬菌体的滴度、无菌分装并存放于4℃。
3.3噬菌体挽救实验
刮取3.1的电转菌6mL稀释至400mL SOB-GAT液，30℃培养至A600＝0.5左右，加入M13K07 37℃静置超感染1小时(以多重感染值达5：1为宜，加入M13K07的pfu 数量：5×108细菌/A600单位)×多重感染值(5)×A600值(0.5)×细菌的终体积(mL)， 4℃3500RPM离心10min，沉淀用2YT-AKT原体积重悬，30℃中速过夜震荡培养。挽救培养液4℃4000rpm离心20min，取上清加4％PEG8000和3％N aC1冰浴沉淀噬菌体1h， 4℃15000g离心20min，1-2mL灭菌PBS(含1％BSA，0.02mol/L，PH7.4)重悬沉淀，短暂低速离心，上清即为挽救后的原始噬菌体抗体库(分装，4℃保存备用)。
3.4噬菌体抗体库的淘选
用固相淘选方法对3.1所获的抗体噬菌体文库进行抗原特异性淘选。每一轮淘选的抗原包被浓度依次递减,并设置阳性/阴性对照。具体操作如下：复苏3.1保存的抗体噬菌体文库于60ml的2YT培养基中，于37℃摇床中培养至OD600＝0.3-0.4。加入 M13KO7辅助噬菌体(Invitrogen)；37℃静置孵育30分钟，摇床孵育60分钟。离心1500 转/10分钟，弃上清，用60ml的50ug/ml卡那霉素(无葡萄糖)的培养基重悬细胞，并于30℃摇床中过夜培养；离心12000转/10分钟沉淀噬菌体文库，转移上清至离心管中，30ml/管。向每支离心管加入7.5mlPEG/NaCl，混合均匀，置于冰上1h。离心，12000 转，5分钟，弃上清；用2.2ml含有PBS-5％BSA的溶液重悬噬菌体，离心，12000转，5 分钟，去除细胞碎片。之后，用表达的CD147分子包板进行亲和筛库，经过5轮的淘选 (吸附-洗脱-扩增)，每一轮淘选的抗原包被浓度依次递减(1ug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml、 0.001ug/ml、0.0001ug/ml)。计算每一轮筛选噬菌体投入/产出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标，计算公式为：回收率(％yield)＝(洗脱液体积×洗脱液滴度×100)/(投入抗体库体积×抗体库滴度)，淘选进行至回收率小于10时，终止淘选实验，挑取所获得的768个克隆，诱导表达，获得含有人源化基因抗体重链VH和轻链VL 的基因产物即ScFv抗体，用于进一步的Elisa检测。
六、ELISA分析及测序分析
用包被缓冲液(200mM Na2CO3/NaHCO3，pH 9.2)将CD147稀释为1μg/ml，每个反应孔中加50μl，4℃包被过夜；弃去反应孔中溶液，用1X PBS缓冲液洗涤3次，加200μl 封闭缓冲液(2％BSA/1XPBS buffer)室温下封闭1h；用200μl 1XPBS缓冲液洗涤3 次；加入(四)3.4诱导表达的含ScFv抗体的细胞培养上清768样品(8块96孔微孔板)和阴性对照(50μl/孔)，室温温育2h；用200μl 1X PBS缓冲液洗涤3次；加入用封闭缓冲液稀释(1:2500)的Anti-c-MycAb(HRP)(Abcam Cat#ab19312，50μl/ 孔)，室温温育1h；用200μl用1XPBS缓冲液洗涤6次；在各反应孔中加入TMB底物溶液(50μl/孔)反应10min；加入终止溶液(2M HCl，50μl/孔)以终止反应；用 ELISA读板仪读取A450nm的吸光值；
根据ELISA的结果，选取A450>3.0的50个克隆样品送测序(测序工作由上海博尚生物技术有限公司完成)。DNA序列分析：参照人类抗体的germline数据库和 http://www.bioinf.org.uk/abs/shab/评价序列的人源化程度，同时对人源化程度较好的分子进行亲和力排序。
七、SPR测定ScFv抗体的亲和力
7.1 SPR结合分析方法
用ProteOn XPR36(Bio-Rad,XPR36)仪器进行步骤(五)中ELISA抗体强阳性抗体的亲和力测定。用0.04M EDC+0.01M sulfo-NHS(Bio-Rad)活化GLC芯片(Bio-Rad， 1765011)。用10mM NaAc(pH 4.5)稀释CD147至10mM，并以30ul/min的速度注射到芯片上，使抗原与被活化的芯片通过氨基偶联。最后用1M ethanolamine-HCl (Bio-Rad)灭活芯片；芯片转动90度后用缓冲液(PBS/0.005％Tween 20)冲洗至基线平稳。在6个水平通道上分别注射含有(四)3.4诱导表达的含ScFv抗体的细胞培养上清。进样速度为30μl/min。样品结合时间为60s，解离时间为900s；用朗缪尔动力学(Kinetic-Langmuir)模型进行数据分析；选择亲和力高的克隆进行完整人源化抗体的构建。
7.2 SPR测定ScFv抗体的亲和力排序
使用SPR实时监测包被的CD147与(四)3.4诱导表达的含ScFv抗体的细胞培养上清结合，通过测定解离速率常数(Koff)反映CD147与人源化ScFv抗体亲和力大小。结果见表3，依据亲和力的变化情况，选择亲和力较好的多个分子进行完整人源化抗体的构建。
表3 HAb18人源化程度序列分析和Koff排序
八、全长人源化抗体构建和检测
8.1材料
根据前述亲和力排序的结果，首先挑取(六)2即SPR测定片段抗体ScFv抗体的亲和力排序靠前的4个克隆(即克隆26601,26602,27028和27044)进行第一轮的全长抗体构建和表达。
即对首先选取的4个克隆进行接种过夜培养，分别提取质粒，测序确认模板序列。
PCR引物：人源化抗体VH基因扩增引物：上游引物：247-VH_F1，如序列表中SEQ IDNO：84；下游引物：247-VH_R1，如序列表中SEQ ID NO：85，目标产物大小为392bp；人源化抗体VL基因扩增引物：第一套的上游：247-33_F1，下游引物：247-33_R1，分别为如序列表中SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83；依据测序结果，第二套的上游引物： 247-VL-2_F2；下游引物：247-vl_R1，分别对应序列表中SEQ ID NO：87和SEQ ID NO： 86。
8.2 PCR扩增过程
分别提取质粒，测序确认模板序列正确后，用上述引物和模板分别进行PCR扩增目的片段，扩增方案分别如下：
引物模板目的片段长度
8.3瞬时表达载体的制备
将步骤7.2扩增的轻链可变区基因或重链可变区基因分别加入II型限制性内切酶NgoMIV和SnaBI进行双酶切，酶切后经DNA纯化试剂盒进行纯化，并与相同限制性内切酶NgoMIV/SnaBI消化的含有hIgG1/k的哺乳动物细胞表达载体pCI-vector连接。连接产物转化到TOP10大肠杆菌，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上,获得的阳性克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，进行质粒提取和测序，获得分别含有人源化抗体VH基因全长真核表达载体克隆1-VH1～4和含有人源化抗体VL基因的全长真核表达载体克隆1-VL1～4。经过序列测定，其中克隆4其重链可变区对应的核苷酸序列如SEQID NO:102；轻链可变区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:104。
九、细胞瞬时转染及抗体表达纯化
9.1抗体的细胞瞬时转染
用Invitrogen公司的Freestyle Max Reagent转染试剂分别将(七)7.3获得的 VH基因全长真核表达载体克隆1-VH1～4与含有人源化抗体VL基因的全长真核表达载体克隆1-VL1～4分别两两配对进行共转染入HEK293细胞(1.0×106个/ml)，将转染后的细胞置于摇床37℃，置于CO2浓度5％的培养箱中震荡培养，摇床转速为120转。在转染 7天后离心收取转染后的细胞上清液，采用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的全长人源化抗体，对表达纯化的抗体进行蛋白浓度测定并用于进一步的纯化抗体(抗体分别记为克隆1～4)亲和力SPR的测定。
9.2抗体的SDS-PAGE分析
采用实验室常规的SDS-PAGE分析方法，即通过分别混合NuPAGE LDS samplebuffer， NuPAGE Reducing Agent与各样品，75℃水浴10分钟，离心。上样量为2μg/well，200V 电压运行35分钟。完成电泳后，取胶漂洗三次，每次5分钟。加入染色液SimplyBlueSafestain染色一小时，完成后弃染色液加入去离子水脱色，直至胶背景脱色完全；观察结果如附图1。
其中，左图为纯化蛋白的非还原电泳样品，而右图为纯化蛋白的还原电泳样品。左右图中的六条泳道从左到右依次为：Lane1:克隆1；Lane2:克隆2；Lane3:克隆3；Lane4: 克隆3(不同批次制备)；Lane5:克隆4；Lane6:克隆4(不同批次制备)；M为蛋白Marker。
十、人源化抗体亲和力测定
人源化抗体亲和力的SPR测定：用SPR对纯化的第一批4个人源化抗体亲和力进行测定，方法同(六)6.1，结果显示纯化抗体克隆1，克隆2，克隆3和克隆4的亲和力 (1.9E-9，2.63E-9，1.61E-9和1.83E-9)略低于亲本的嵌合抗体WBP247.cAb1 (3.94E-10)，结果如图所示，其中抗体的结合解离图谱见附图2。
表4人源化抗体SPR动力学数据
十一、免疫组化染色法对人源化抗体的特异性筛选和鉴定
虽然用SPR法对人源化抗体进行了亲和力的测定，但由于所采用的抗原为体外表达制备的纯化抗原，为了进一步观察所获得的人源化抗体的结合特异性，通过实验室保持的肿瘤组织标本对上述抗体进行了进一步的免疫组化染色。
检测表达的系列人源化抗体克隆1～4与肿瘤组织的特异性结合能力，考察该抗体的免疫组织交叉反应。
具体操作如下：常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、水化组织芯片；3％H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶；正常羊血清工作液封闭；以抗体克隆1～4为一抗，生物素标记的兔抗人Fc抗体为二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液为三抗，DAB显色，苏木精复染，脱水透明后封片、镜检。组化的筛选结果显示，仅仅有抗体克隆4即 WBP247.hAb4在肺癌、肝癌等恶性肿瘤组织中可见特异性着色，着色程度均为“++”或“+++”；而与正常组织极少结合。而其他的三个抗体均为阴性。以上结果表明，通过本轮的表达仅仅筛选1株可用的候选人源化抗体WBP247.hAb4，该抗体同鼠源性亲本抗体识别抗原的特异性类似，人源化抗体构建成功，但是可用的数目极少，未能达到数量上的要求，因此需要进行多轮的表达和筛选。
十一、反复多轮的全长人源化抗体构建和免疫组化筛选
11.1反复多轮的全长人源化抗体构建和检测
根据免疫组化提供的结果，由于人源化后可能抗体的特异性有所变化，因此，调整前期的策略，首先对前述(六)2即SPR测定片段抗体ScFv抗体的亲和力排序靠前的 16个克隆均进行全长抗体构建和表达；方法同前7.1，对选取的克隆进行全长抗体的载体构建和表达。其中，克隆6即WBP247.hAb6对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:106；轻链可变区其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:108。克隆12即WBP247.hAb12其对应的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:110；轻链可变区的对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:112。之后按照前述(八)8.1及细胞瞬时转染及抗体表达纯化对所获得的抗体进行纯化(抗体分别记为克隆5～16)，按照前述8.2的方法进行SDS-PAGE分析，结果如附图3,附图4和附图5。
十二、人源化抗体亲和力的ELISA分析
将200ng重组CD147蛋白包被到酶标板中，4℃静置过夜；用1XPBS/2％BSA室温封闭1小时。将步骤(八)及后续制备的纯化抗体产物克隆1～6从1ug/ml起始用封闭液1:3.16梯度稀释，每孔分别加入100μl，室温静置1小时。加入100μl 1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗Goat anti-human IgG Fc HRP(Bethyl Cat#A80-304P)，室温静置1小时。加入TMB显色，并用2M的H2SO4终止反应。用酶标仪在450nm下读数。ELISA结果可看出，筛选克隆1–克隆16共计16个人源化抗体的EC50值约为嵌合抗体WBP247.cAb1的一半，亲和力约高于嵌合抗体一倍。(见表5，图6)。
表5抗体与抗原CD147结合EC50测定
Sample:
EC<sub>50</sub>(ug/ml)
EC<sub>50</sub>(nM)
嵌合cAb1
0.005733
0.0382
克隆1
0.002725
0.0182
克隆2
0.002944
0.0196
克隆3
0.003076
0.0205
克隆4
0.002864
0.0191
克隆5
0.002811
0.0187
克隆6
0.003022
0.0201
克隆7
0.002507
0.0167
克隆8
0.001701
0.0113
克隆9
0.002099
0.0140
克隆10
0.002061
0.0137
克隆11
0.002362
0.0157
克隆12
0.002614
0.0174
克隆13
0.002527
0.0168
克隆14
0.002509
0.0167
克隆15
0.002432
0.0162
克隆16
0.00325
0.0217
十三、全长人源化抗体免疫组化筛选
为了进一步检测表达的系列人源化抗体克隆5～16与肿瘤组织的特异性结合能力，考察该抗体的免疫组织交叉反应，通过免疫组化染色法对人源化抗体的特异性做进一步的筛选。具体操作如步骤十：常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、水化组织芯片；3％H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶；正常羊血清工作液封闭；以抗体克隆5～16为一抗，生物素标记的兔抗人Fc抗体为二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液为三抗， DAB显色，苏木精复染，脱水透明后封片、镜检。阳性判断：以细胞膜着棕色为阳性。通过本轮的表达筛选，再次获得了两株可用的候选人源化抗体WBP247.hAb6和克隆12，其中克隆12不仅可以同肝癌标本结合，同时也可与肺癌标本结合。具体信息如下表6 所示：
表6免疫组化染色法对人源化抗体的特异性筛选
通过多次的组化染色，所获得的人源化抗体的结合特异性，初步筛选了三株人源化单抗即克隆4(WBP247.hAb4)，克隆6(WBP247.hAb6)和克隆12(WBP247.hAb12)进行下游稳定细胞株的筛选。
十四、人源化抗体高效表达载体构建及稳定表达细胞株筛选
根据前面ELISA及免疫的结果，选取亲和力和特异性最好的三个克隆即克隆4，克隆6和克隆12即“WBP247.hAb4、WBP247.hAb6和WBP247.hAb 12”的基因序列进行高效表达载体的构建及稳定细胞株的筛选。
表7 WBP247.hAb4、WBP247.hAb6和WBP247.hAb12序列组合信息
(其中，克隆12轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:113所示的序列，对应的轻链可变区(VL)核苷酸序列为SEQ ID NO:112；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:111 所示的序列，对应的重链可变区(VH)核苷酸序列为SEQ ID NO:110所示)。
14.1轻链表达载体pWX2.1-LC-B-247B4的构建
体外进行基因DNA(27989-VL)片段扩增,以该DNA为模板，用引物WX-893、WX-894、WX-895及WX-900(对应为序列表中SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ IDNO:101)扩增可变区片段WBP247B4-VL，并在WBP247B4-VL 5’端引入EcoRI限制性酶切位点，3’端引入BsiWI限制性酶切位点，对该片段及含有轻链恒定区基因的表达载体pWX2.1进行EcoRI与BsiWI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收5119bp的DNA 片段。将切胶纯化后的DNA片段与来自质粒pWX2.1片段进行连接反应，T4连接酶20μl 体系16℃下反应20min，取10μl连接液转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。进行菌落PCR鉴定、酶切鉴定以及测序后，挑一个正确的单克隆于200ml LB培养基，37℃,220rpm 过夜振荡培养，大量抽提质粒，最终得到的质粒命名为pWX2.1-LC-B-247B4(5521bp) (如图8所示)。
14.2轻链表达载体pWX2.1-LC-B-247B12的构建
体外进行基因DNA(32270-VL)片段扩增,以该DNA为模板，用引物WX-896、WX-897、WX-898及WX-900(对应为序列表中SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ IDNO:101)扩增可变区片段WBP247B12-VL，并在WBP247B12-VL 5’端引入EcoRI限制性酶切位点，3’端引入BsiWI限制性酶切位点，对该片段及含有轻链恒定区基因的表达载体pWX2.1进行EcoRI与BsiWI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收5119bp的DNA 片段。将切胶纯化后的DNA片段与来自质粒pWX2.1片段进行连接反应，转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞。进行菌落PCR鉴定、酶切鉴定以及测序后，挑一个正确的单克隆于 200ml LB培养基，37℃,220rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒，最终得到的质粒命名为 pWX2.1-LC-B-247B12(5521bp)(如图9所示)。
14.3重链表达载体pWX1.1-HC-Z-247B4的构建
体外进行基因DNA(27989-VH)片段扩增,以该DNA为模板，用引物WX-887、WX-888、WX-889及WX-899(对应为序列表中SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ IDNO:100)扩增可变区片段WBP247B4-VH，并在WBP247B4-VH 5’端引入EcoRI限制性酶切位点，3’端引入NheI限制性酶切位点，对该片段及含有轻链恒定区基因的表达载体pWX1.1进行EcoRI和NheI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收5202bp的DNA片段。将切胶纯化后的DNA片段与来自质粒pWX1.1片段进行连接反应，转化大肠杆菌TOP10 感受态细胞。进行菌落PCR鉴定、酶切鉴定以及测序后，挑一个正确的单克隆于200ml LB 培养基，37℃,220rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒，最终得到的质粒命名为 pWX1.1-HC-Z-247B4(5625bp)(如图10所示)。
14.4重链表达载体pWX1.1-HC-Z-247B6的构建
体外进行基因DNA(32338-VH)片段扩增,以该DNA为模板，用引物WX-890、WX-891、WX-892及WX-899(对应为序列表中SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ IDNO:100)扩增可变区片段WBP247B6-VH，并在WBP247B6-VH 5’端引入EcoRI限制性酶切位点，3’端引入NheI限制性酶切位点，对该片段及含有轻链恒定区基因的表达载体pWX1.1进行EcoRI和NheI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收5202bp的DNA片段。将切胶纯化后的DNA片段与来自质粒pWX1.1片段进行连接反应，转化大肠杆菌TOP10 感受态细胞。进行菌落PCR鉴定、酶切鉴定以及测序后，挑一个正确的单克隆于200ml LB 培养基，37℃,220rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒，最终得到的质粒命名为 pWX1.1-HC-Z-247B6(5625bp)(如图11所示)。
14.5CHO稳定表达细胞株的构建及筛选
在进行了载体构建后，委托药明康德进行上述人源化抗体轻链表达载体和人源化抗体重链表达载体分别按照(1)pWX2.1-LC-B-247B4、pWX1.1-HC-Z-247B4；(2) pWX2.1-LC-B-247B6、pWX1.1-HC-Z-247B4；(3)WX2.1-LC-B-247B12、pWX1.1-HC-Z-247B4 共转染入CHO/DHFR细胞，加入适当浓度的培养基筛选传代，并挑选单克隆获得CHO稳定表达细胞株。
之后，进行Minipool批次补料实验进行滴度的测量。经过四轮批次补料优化，筛选获得分别稳定表达WBP247.hAb12抗体(命名为：mehozumab单抗的细胞株 247C-B4Z2-01-C-005(CCTCC NO.C2019147)、表达WBP247.hAb4的细胞株 247A-B9Z4-02-C-T9(CCTCCNO.C2019148)和表达WBP247.hAb6的细胞株 247B-B9Z4-01-C-T9(CCTCC NO.C2019149)，上述细胞株目前均保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2019年7月16日。
十五、人源化抗CD147抗体的肿瘤细胞体外杀伤实验
方法：取处于对数生长期的人肺癌细胞NCI-H520，胰酶消化，制成单细胞悬液，调整浓度至1×104个/ml。将2000个细胞(200μl细胞悬液)接种到96孔板中，5％CO2， 37℃孵育过夜，等待细胞贴壁并且恢复对数增殖的状态。
按常规的ADC药物实验室制备方法，将三株人源化抗体进行DM1的标记，获得WBP247.hAb12-DM1、WBP247.hAb4-DM1和WBP247.hAb6-DM1。分别用无血清RPMI1640培养基稀释到如下梯度：1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/mL；分别将每个浓度取20μl加入对应孔内，每个浓度设计6个复孔。同时设计阴性抗体对照(人 IgG)和本底(无细胞仅有培养基)。5％CO2，37℃孵育48h，每孔加入10μL CCK-8显色液。37℃孵育2h，全波长酶标仪读取450nm处吸光值。结果如图13所示，筛选的人源化抗体对肿瘤细胞均有较好的杀伤效果(附图13)，表明所制备的人源抗体均具有的良好的肿瘤特异性和靶向性。根据该效果，本领域技术人员可以推知本发明的抗体可用于制备诊断和治疗CD147表达阳性疾病(的药物及其生物技术产品、检测试剂、影像学和检验诊断用试剂的用途。
核苷酸序列表电子文件
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>抗人CD147的单克隆抗体、表达载体、细胞株及其应用
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CCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTC
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<212>DNA
<213>
<220>HAb18-Linker-F1
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GGCGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTGCTAGCAGTATTGTGATGACCCAGACT
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<220>HAb18-R
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GTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTGATTTCCAGCTTTGTCC
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CACCGTACGTTTGATTTCCAGCTTTGTCC
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<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb4重链可变区（VH）核苷酸序列
<400>102
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<212>PRT
<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb4重链可变区（VH）氨基酸序列
<400>103
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHAPYYTESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDSTATHWGQGTLVTVSS
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<212>DNA
<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb4轻链可变区（VL）核苷酸序列
<400>104
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGAGCGCCTCAGTCGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGATTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGCCCCCTAAACTGCTGATATACTATGCATCCAATCGCAACACTGGAGTTCCTAGCCGCTTCAGCGGCAGTGGAAGCGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCCGAAGACATCGCAACCTATTACTGTCAGCAGGATTATAGTCCTCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACAAAGCTGGAAATCAAA
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<212>PRT
<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb4轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400>105
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVINDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRNTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSPPFTFGQGTKLEIK
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<212>DNA
<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb6重链可变区（VH）核苷酸序列
<400>106
GAAGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGAAGCCTGGAGGATCCCTGAGGCTGTCTTGTGCCGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGACTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATGCACCATACTATACTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCACGAGATGATTCCAAAAGTATTACCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCCAGGGATAGCACGGCTACCCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCA
<210>107
<211>117
<212>PRT
<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb6重链可变区（VH）氨基酸序列
<400>107
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHAPYYTESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSTATHWGQGTLVTVSS
<210>108
<211>321
<212>DNA
<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb6轻链可变区（VL）核苷酸序列
<400>108
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGAGCGCCTCAGTCGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGATTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGCCCCCTAAACTGCTGATATACTATGCATCCAATCGCAACACTGGAGTTCCTAGCCGCTTCAGCGGCAGTGGAAGCGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCCGAAGACATCGCAACCTATTACTGTCAGCAGGATTATAGTCCTCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACAAAGCTGGAAATCAAA
<210>109
<211>107
<212>PRT
<213>人源化
<220>人源化抗体WBP247.hAb6轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400>109
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVINDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRNTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSPPFTFGQGTKLEIK
<210>110
<211>351
<212>DNA
<213>人源化
<220>人源化抗体克隆12重链可变区（VH）核苷酸序列
<400>110
CAAGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGCGGCTGTCTTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGACTTGAGTGGGTTGCCGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATGCACCATACTATACTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCACGAGATGACTCCAAAAACACCCTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAAGACCGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCCAGGGATAGCACGGCTACCCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCA
<210>111
<211>117
<212>PRT
<213>人源化
<220>人源化抗体克隆12重链可变区（VH）氨基酸序列
<400>111
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHAPYYTESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDSTATHWGQGTLVTVSS
<210>112
<211>321
<212>DNA
<213>人源化
<220>人源化抗体克隆12轻链可变区（VL）核苷酸序列
<400>112
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGAGCGCCTCAGTCGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGATTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTAGGCTGCTGATATACTATGCATCCAATCGCAACACTGGAGTTCCTGATCGCTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACGGATTTCACTCTCAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAAGACGTGGGGGTTTATTACTGTCAGCAGGATTATAGTCCTCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACAAAGCTGGAAATCAAA
<210>113
<211>107
<212>PRT
<213>人源化
<220>人源化抗体克隆12轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400>113
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVINDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQDYSPPFTFGQGTKLEIK
TCCAGCTGTGGAAGCACGACCTGGAATACTTCAAGTCGCTGCCCCAG
GCTGACCAGGACAATATCATCGGCCGCCGCCTGAGCGACAACGAAAA
GCTCGGCGATGCCCCCGAGTCCGCGCACGTCAAGCGCACTGCCCAGG
AAAGCTTTGAACCCGAAGCGTTCATGGTCCGTCGCTCGGTAGCCTGG
GCCGACCAGCGCGGCGCCGGCCTGGCCTTCGTCGCCTTGGGCAAGAG
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CGGCATCATCGACGGATTGTACCGCTTTAGCCGCCCGCTGACGGGTGG
CTACTACTGGTGCCCGCCGATGGGCGAGACGGGGGTTGATCTGAGCT
CCTTGCTGCGGGCCTGA
<210>4
<211>287
<212>氨基酸
<213>B型染料-脱色过氧化物酶突变体的氨基酸序列
<220>
<223>
<400>4
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LGIGAPLVKALGREVPGLRAFPLLDTAVENPSTQHALWLWLRGDERGDLLLRAQALEQALAPALQLADSVDGFLRRGGYDLTGYEDGTENPVDEDVV
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