阅读说明：本技术 一种人源化t细胞活化的v域免疫抑制因子抗原结合片段 (Humanized T cell activated V domain immunosuppressive factor antigen binding fragment ) 是由 熊浩 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗体领域,特别地涉及一种人源化T细胞活化的V域免疫抑制因子抗原结合片段,本发明的抗原结合片段,稳定性好,具有较强的T细胞功能调控活性和良好的药代动力学特性,能够在体内显著抑制肿瘤的生长。(The invention relates to the field of antibodies, in particular to a humanized T cell activated V domain immunosuppressive factor antigen binding fragment.)

一种人源化T细胞活化的V域免疫抑制因子抗原结合片段

技术领域

本发明涉及单克隆抗体领域，特别地涉及一种人源化T细胞活化的V域免疫抑制因子抗原结合片段。

背景技术

T细胞活化的v域免疫抑制因子(VISTA)是一种新型的抑制性免疫检查点蛋白。VISTA在肿瘤细胞上的表达及其相关调控机制尚不清楚。已有研究表明VISTA在人类卵巢癌和子宫内膜癌中高度表达。VISTA在子宫内膜癌中的上调与VISTA启动子甲基化状态有关。VISTA在肿瘤细胞中抑制T细胞增殖和细胞因子的产生，并在体内减少肿瘤浸润的CD8+T细胞。抗VISTA抗体延长荷瘤小鼠的存活时间。

近年来，免疫检查点治疗(ICT)改变了癌症治疗的面貌，但并非所有肿瘤类型都对现有的免疫检查点抑制剂反应良好。但临床研究表明，现有的ICT对胰腺癌的临床益处极小。胰腺癌的治疗手段比较多样，有外科手术、化疗、放疗、介入治疗等，但治疗方法多样的背后，也残酷地说明了单一治疗方法疗效不佳。手术是至今唯一有可能治愈胰腺癌的方法，但很多患者在确诊时已经失去了根治性手术的机会。

近日，德克萨斯大学MD安德森癌症中心在PNAS期刊上发表论文“Comparison ofimmune infiltrates in melanoma and pancreatic cancer highlights VISTA as apotential target in pancreatic cancer”。研究小组发现，与黑色素瘤相比，VISTA优先在胰腺癌中高水平表达，研究人员的研究还提供了与黑色素瘤相比较的原发性和转移性胰腺癌免疫浸润的详细分析，这可能进一步有助于指导针对胰腺癌治疗的免疫治疗策略。

VISTA是肿瘤微环境中一种新的免疫抑制因子，也是肿瘤免疫治疗的新靶点，临床上亟待有效的VISTA抗体药物。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种人源化T细胞活化的V域免疫抑制因子抗原结合片段。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种人源化T细胞活化的V域免疫抑制因子抗原结合片段，所述抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR-L1，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR-L2，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR-L3；所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR-H1，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR-H2，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR-H3，所述抗原结合片段为特异性结合T细胞活化的V域免疫抑制因子的抗原结合片段。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列是与SEQ ID No.7、9、10、11所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。

进一步地，其中所述轻链可变区的氨基酸序列是与SEQ ID No.8、12、13、14所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。

进一步地，其中所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7、9、10、11任一项所示和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8、12、13、14任一项所示。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

进一步地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双功能抗体及线性抗体。

进一步地，所述抗原结合片段包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。

进一步地，所述抗原结合片段的生产步骤包括在培养基中和合适的培养条件下培养含有编码上述抗原结合片段核苷酸序列的宿主细胞。

进一步地，其中所述抗体、其抗原结合片段或其变体与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物

优选地，所述诊断剂选自金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂中的一种或多种；

优选地，所述治疗剂选自另一抗原结合片段、细胞毒素剂、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种。

本发明还提供一种人源化T细胞活化的V域免疫抑制因子抗原结合片段的用途，包括从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的上述抗体及其抗原结合片段并与药学上可接受的载体制成药物用于***的用途，所述肿瘤包括但不限于胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌。

优选地，所述肿瘤优选地为胰腺癌、卵巢癌或其他VISTA高表达的肿瘤类型。

本发明的抗VISTA单抗特异性强，稳定性好，具有较强的T细胞功能调控活性和良好的药代动力学特性，能够在体内显著抑制肿瘤的生长。而且，本发明的抗VISTA单抗对VISTA抗原的结合阻断活性很强。

具体实施方式

定义

本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。

代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。

抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。

“可变”是指在抗体间，可变域的某些区段的序列显著不同的事实，所述高度可变区为各3至12个氨基酸长度，其主要采取β折叠构型且由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由FR紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点(Kab.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))，恒定域不直接决定抗体对抗原的结合。

“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。

优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个CDR域。

抗体的抗原结合片段可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端，例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。

IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

“单克隆抗体”是指获得自大体上均质的抗体的群体的抗体，即组成该群体的抗体除了个别抗体可少量存在的可能天然生成的突变外均相同。单克隆抗体是高度特异性的，是指针对单一抗原位点。此外，相对于包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。除单克隆抗体的特异性外，单克隆抗体的有利的处在于其可经合成而不被其他抗体污染。

本发明的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、噬菌体展示系统、酵母、植物细胞、动物细胞。

术语“特异性地结合”是指，抗体或其抗原结合片段“特异性地结合”另一分子的区域，具体地，是指相对于另外的表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段以至少10^-7M的亲和力结合抗原，例如10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或更高。优选地，抗体或其抗原结合片段在生理条件下(例如，在体内)结合。因此，特异性地结合到抗原是指该抗体或其抗原结合片段以上述特异性和/或在这样的条件下结合到抗原上的能力，适合于确定所述结合的方法是本领域已知的。

术语“结合”通常是指以对应于约10^-6M或更小的KD的亲和力结合，该KD比该抗体对与除指定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原结合的亲和力低至少10倍，如低至少100倍、至少1,000倍。

如本文所用，术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，所述值又称为k_off值。

如本文所用，术语“ka”(M-1 x sec-1或1/Msec)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，所述值又称为k_on值。。

如本文所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过kd除以ka获得。

如本文所用，术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数并且通过ka除以kd获得。

“治疗”包括但不限于以下中的一项或更多项试验表征：减轻疾病引起的一或更多种症状；减弱疾病的程度；预防或延迟疾病的恶化；预防或延迟疾病的扩散；预防或延迟疾病的复发；延迟或减缓疾病的进展；改善疾病情况；提供疾病的缓解；减少治疗疾病所需的一或更多种其他药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或改善生活质量；增加体重增长及/或延长存活。在本发明中，“治疗”可以解释为癌症的病理结果(例如肿瘤体积的减小)。药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，包括但不限于稀释剂、赋形剂和水等；包括但不限于粘合剂如明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；包括但不限于促吸收剂如季铵化合物；包括但不限于表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠等。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：

用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)作为实验动物进行小鼠免疫试验。初次免疫使用50μg人VISTA蛋白(购自北京义翘神州)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按1ml/只注射量注射小鼠腹腔，每隔2周用25μg人VISTA蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液进行加强免疫，加强免疫三次，末次免疫1周后，收集小鼠静脉血并分离血清，通过ELISA方法测量抗体效价并选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。

收集对数生长的骨髓瘤细胞(SP2/0)制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5-1:10的比例混合在一起，用不完全培养液洗涤后离心8分钟弃上清，将细胞沉淀置于40℃水浴中预热，向细胞沉淀中加入预热至40℃的PEG-4000溶液1ml，出现颗粒后1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基以终止反应。静置后加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1.5×10⁷/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养并观察，待细胞表面积达到孔板面积1/2以上时，吸出上清液样品供抗体检测。

实施例2：

筛选杂交瘤培养上清液的抗人VISTA抗体。具体地，用缓冲液在96孔高吸附酶标板上包被人VISTA(购自北京义翘神州)，包被量100μL每孔，之后用缓冲液洗涤3次后；用含1％BSA的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入75μL上清液样品(S1-S85)以及阳性血清(对照，CK1-5)，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL以比例1/10000稀释于含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据OD_450nm的强弱选取能够分泌人VISTA结合抗体的阳性克隆。

实施例3：

将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。首先按照说明书使用RNA prep Pure试剂盒(Tiangen)提取细胞mRNA。之后使用Quant Script RT试剂盒(Tiangen)合成cDNA第一链。将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。

经过PCR扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源IgVH2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体TL10-11中(载体骨架pEGFP-N1，购自上海吉满生物)。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系(购自上海纪宁生物科技)。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为2×10⁸细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为45.2μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为50μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。

实施例4：

检测实施例1获得的抗人VISTA鼠源单抗(以下简称OM-anti-VISTA)与其抗原结合的动力学常数。利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离，简要地，将OM-anti-VISTA溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭，结合阶段将不同浓度的OM-anti-VISTA以25μL/min的速度注入3.0min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以25μL/min的速度注入5.0min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件进行分析计算。OM-anti-VISTA的结合动力学常数为2.14E+05(1/Ms)、解离动力学常数为3.61E-05(1/s)、解离平衡常数为1.68E-09(M)。

实施例5：检测鼠源单抗体内中和活性

测定OM-anti-VISTA的体内中和活性。简要地，选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)。随机分成五组，每组6只，静脉注射并单次给药，每组剂量水平分别为0.5nmol/kg,5nmol/kg，15nmol/kg，25nmol/kg，50nmol/kg OM-anti-VISTA。给药一小时后，给每只小鼠皮下注射人VISTA蛋白15μg，注射2小时后，对各小鼠进行眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样约40分钟左右至凝血，离心获取血清样品，采用CCK ELISA试剂盒按说明书测定血清中小鼠CCK的浓度，结果表明25nmol/kg OM-anti-VISTA能够抑制人VISTA刺激小鼠分泌的CCK的水平，基本能将小鼠CCK水平降低至未刺激状态。

实施例6：

测定OM-anti-VISTA的在大鼠体内的药代动力。简要地，选用6-8周龄雌性SD大鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)。取大鼠5只，分别给予25nmol/kg OM-anti-VISTA。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45分钟至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。ELISA测定血清中OM-anti-VISTA含量，测试结果表明，单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的OM-anti-VISTA的药代参数如下：半衰期为498小时；药时曲线下面积为43721nM.hr；估算零浓度为391nM；表观分布容积为119mL/Kg；清除率为0.178mL/hr/kg；平均驻留时间为163小时。

实施例7：

人源化形式的抗人VISTA抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，在Germline数据库中选取与OM-anti-VISTA非CDR区匹配最好的人源化模板，其中重链可变区的模板为人源IgVH4-28*03，轻链可变区的模板为人源IGKV1-16*02，将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表1所示。

表1.回复突变获得的氨基酸序列

VH	SEQ ID NO
		ORI	SEQ ID NO:7
VisLC16-H	SEQ ID NO:9
		VisLC17-H	SEQ ID NO:10
VisLC18-H	SEQ ID NO:11
		VL	SEQ ID NO
ORI	SEQ ID NO:8
		VisLC16-L	SEQ ID NO:12
VisLC17-L	SEQ ID NO:13
		VisLC18-L	SEQ ID NO:14

将人源化的抗人VISTA单抗的重链可变区(SEQ ID NO：7-11)分别与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:15)连接，分别得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人VISTA单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：8-14)分别与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQ ID NO:16)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入TL10-11(载体骨架pEGFP-N1)载体中。

实施例8：

测定三种人源化VISTA单抗(ORI：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，VisLC16：SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:12，VisLC17：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13，VisLC18：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14)与抗原VISTA蛋白的结合动力学常数，方法同实施例4，人源化VISTA单抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。

表2.人源化VISTA单抗与其抗原结合的动力学常数

测定人源化VISTA单抗在大鼠体内的药代动力，简要地，选6-8周龄雌性SD大鼠随机分成3组(编号测试组1、测试组2、测试组3、测试组4每组10只)，测试组1给予25nmol/kgORI；测试组2给予25nmol/kg VisLC16；测试组3给予25nmol/kg VisLC17；测试组4给予25nmol/kg VisLC18。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45分钟至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。

测试组1的药代参数如下：半衰期t_1/2为462小时，药时曲线下面积AUC_last为41921nM.hr，估算零浓度C0为482nM，表观分布容积Vd为102mL/Kg，清除率CL为0.199mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为167小时。

测试组2的药代参数如下：半衰期t_1/2为477小时，药时曲线下面积AUC_last为48375nM.hr，估算零浓度C0为584nM，表观分布容积Vd为157mL/Kg，清除率CL为0.193mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为162小时。

测试组3的药代参数如下：半衰期t_1/2为482小时，药时曲线下面积AUC_last为47563nM.hr，估算零浓度C0为469nM，表观分布容积Vd为118mL/Kg，清除率CL为0.164mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为194小时。

测试组4的药代参数如下：半衰期t_1/2为476小时，药时曲线下面积AUC_last为42456nM.hr，估算零浓度C0为475nM，表观分布容积Vd为194mL/Kg，清除率CL为0.169mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为185小时。

由结果可见，人源化VISTA单抗与其抗原结合能力强，人源化VISTA单抗在大鼠体内的药代动力接近鼠源抗体。

实施例9：

检测综合表现较强的抗人VISTA人源化单抗(VisLC16)对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用，实验材料选用人8周龄雌性小鼠(BALB/c-nu背景，上海加科生物科技有限公司)。取25只小鼠，每只右腋下植入胰腺癌细胞株(购自上海煊翎生物科技有限公司，货号F0677)，待小鼠明显荷瘤切片验证，模型荷瘤小鼠模型构建，观察肿瘤生长并记录肿瘤体积，每周给药2次(腹腔注射)，连续给药4周，自给药之日起每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(a x b²)/2。按体积分组每组4只小鼠：S1,S2,S3,S4(体积最大，约等于150mm³)；S5,S6,S7,S8(体积中等，约等于100mm³)；S9,S10,S11,S12(体积小，约等于50mm³)；S1,S5,S9设置为溶媒组(注射等体积生理盐水)，S2,S6,S10给药剂量为20nmol/kg，S3,S7,S11给药剂量为35nmol/kg，S4,S8,S12给药剂量为50nmol/kg，试验结果如表3所示。

表3.试验小鼠肿瘤消融比

由表3可见，抗人VISTA人源化单抗(VisLC16)具有较强的抗肿瘤活性，显著抑制了接种胰腺癌肿瘤细胞的小鼠移植瘤的生长，其中，VisLC16针对小体积肿瘤，即胰腺癌初期的抑制效果更为显著，肿瘤消融比例最高约达18.73％。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 熊浩

<120> 一种人源化T细胞活化的V域免疫抑制因子抗原结合片段

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR1-L

<400> 1

Ser Lys Asp Ser Lys Asp Glu His Asp

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR2-L

<400> 2

Asn Tyr Lys Ser Cys His Trp

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR3-L

<400> 3

Met Leu Thr Asp Arg Met Thr Tyr Ser

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR1-H

<400> 4

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Ser Asp

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR2-H

<400> 5

Asn Tyr Lys Ser Cys His Trp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR3-H

<400> 6

Lys Met Phe Pro Val Pro Val Ser Met

1 5

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> ORI VH

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asn Cys His Arg Tyr

1 5 10 15

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

20 25 30

Ser Asp Gly Glu Asp Pro Trp Asp Lys His Glu Pro Met Ile Ile Pro

35 40 45

Lys Glu Ile Met Phe Asn Cys Gly Ala Gln Pro Ile Pro Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Ser Cys His Trp Trp Cys Gly Thr Met Cys Cys Trp Phe His Pro

65 70 75 80

Phe Cys Glu Asp Gly Ser Ser Gly Phe Ile Thr Asp His Asp Lys Met

85 90 95

Phe Pro Val Pro Val Ser Met Val Gly Ile Ala Asn Leu Cys Gln Gly

100 105 110

Thr Lys Val Glu Ile Lys Trp

115

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> ORI VL

<400> 8

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Tyr Val Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Lys Asp Glu His

20 25 30

Asp Asp Ile Thr Asp Tyr Asp Arg Asp Leu Phe Ile Gln Tyr Cys Gly

35 40 45

Ser Cys Lys Cys Met Gly Arg Val Arg Val Gln Asn Ser Ile Ser Gly

50 55 60

Phe Cys Cys Val His Cys Trp Asp Thr Val Leu Phe Asn His Thr Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ala His Trp Phe Arg Gly Thr Tyr Met Leu Thr Asp Arg Met

85 90 95

Thr Tyr Ser Ser Ile Asn Ile Met Gly Val Thr His Gln Gly Leu Ser

100 105 110

Ser

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VisLC16-H

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asn Cys His Arg Asp

1 5 10 15

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

20 25 30

Ser Asp Gly Glu Asp Pro Ala Asp Lys His Glu Pro Met Ile Ile Pro

35 40 45

Lys Glu Ile Met Phe Asn Cys Gly Ala Gln Pro Ile Pro Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Ser Cys His Trp Trp Cys Gly Thr Met Cys Cys Trp Phe Gln Pro

65 70 75 80

Phe Cys Glu Asp Gly Arg Ser Gly Phe Ile Thr Asp His Asp Lys Met

85 90 95

Phe Pro Val Pro Val Ser Met Val Gly Ile Ala Asn Leu Cys Gln Gly

100 105 110

Thr Lys Val Glu Ile Lys Trp

115

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VisLC17-H

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asn Cys His Arg Tyr

1 5 10 15

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Arg Ser Asp Tyr Glu

20 25 30

Ser Asp Gly Glu Asp Pro Trp Asp Lys His Glu Pro Met Ile Ile Pro

35 40 45

Lys Glu Ile Met Phe Asn Cys Gly Ala Gln Pro Ile Pro Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Ser Cys His Trp Trp Cys Gly Thr Met Cys Cys Trp Phe His Pro

65 70 75 80

Phe Cys Glu Asp Gly Ser Ser Gly Phe Ile Thr Asp His Asp Lys Gln

85 90 95

Phe Pro Val Pro Val Ser Met Val Gly Ile Ala Asn Leu Cys Gln Gly

100 105 110

Thr Lys Val Glu Ile Lys Trp

115

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<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VisLC18-H

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu His Cys His Arg Tyr

1 5 10 15

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

20 25 30

Ser Asp Gly Glu Asp Pro Gln Asp Lys His Glu Pro Met Ile Ile Pro

35 40 45

Lys Glu Ile Met Phe Asn Cys Lys Ala Gln Pro Ile Pro Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Ser Cys His Trp Trp Cys Gly Thr Met Cys Cys Trp Phe His Pro

65 70 75 80

Phe Cys Glu Asp Gly Ser Ser Gly Phe Ile Thr Asp His Asp Lys Met

85 90 95

Phe Pro Val Pro Val Ser Met Val Gly Ile Ala Asn Leu Cys Gln Ile

100 105 110

Thr Lys Val Glu Ile Lys Trp

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

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<400> 12

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Met Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Tyr Val Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Lys Asp Glu His

20 25 30

Asp Asp Ile Thr Asp Tyr Asp Arg Asp Leu Phe Ile Gln Tyr Cys Ala

35 40 45

Ser Cys Lys Cys Met Pro Arg Val Arg Val Gln Asn Ser Ile Ser Gly

50 55 60

Phe Cys Cys Val His Cys Trp Asp Thr Val Leu Phe Asn His Thr Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ala His Phe Phe Arg Gly Thr Tyr Met Leu Thr Asp Arg Met

85 90 95

Thr Tyr Ser Ser Ile Asn Ile Met Gly Val Thr His Gln Gly Leu Ser

100 105 110

Ser

<210> 13

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VisLC17-L

<400> 13

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Tyr Val Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Tyr Asp Glu His

20 25 30

Asp Asp Ile Thr Asp Tyr Asp Arg Asp Leu Phe Ile Gln Tyr Cys Gly

35 40 45

Ser Cys Lys Cys Met Gly Arg Val Arg Val Gln Asn Ser Ile Ser Gly

50 55 60

Phe Cys Cys Val His Cys Trp Asp Thr Val Leu Phe Asn His Thr Pro

65 70 75 80

Asp Leu Ala His Trp Phe Arg Gly Thr Tyr Met Leu Thr Asp Arg Met

85 90 95

Thr Tyr Ser Ser Ile Asn Ile Gln Gly Val Thr His Gln Gly Leu Ser

100 105 110

Ser

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VisLC18-L

<400> 14

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ala

1 5 10 15

Tyr Val Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Lys Asp Glu His

20 25 30

Asp Asp Ile Thr Asp Tyr Asp Arg Asp Leu Phe Ile Gln Tyr Tyr Gly

35 40 45

Ser Cys Lys Cys Met Gly Arg Val Arg Val Gln Asn Ser Ile Ser Gly

50 55 60

Phe Cys Cys Val His Cys Trp Asp Thr Asp Leu Phe Asn His Thr Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ala His Trp Phe Arg Glu Thr Tyr Met Leu Thr Asp Arg Met

85 90 95

Thr Tyr Ser Ser Ile Asn Ile Met Gly Val Thr His Gln Gly Leu Ser

100 105 110

Ser

<210> 15

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CH

<400> 15

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

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210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 16

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CL

<400> 16

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

1 5 10 15

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

20 25 30

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

35 40 45

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

50 55 60

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

85 90 95

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105 110

<210> 17

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> TIM-3单抗重链

<400> 17

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Leu Ile Tyr Gln Ala Arg His

1 5 10 15

Thr Ala Val Thr Gln Asp Phe Trp Pro Trp Gln Cys Thr Ala Met Met

20 25 30

Trp Thr Gly Thr Trp Tyr Leu Trp Cys Phe Leu Ala Ile Asn Cys Gln

35 40 45

Pro Glu His Gly Val Thr Arg Met Gln Tyr Asp Glu Pro His Ser Cys

50 55 60

Glu Arg Ala Pro Val Ser Ile Met Cys Cys His Gln His His Trp Thr

65 70 75 80

Asp Asn Cys Phe Asp Val Thr His Ile Ile Arg Asn Val Glu Trp Val

85 90 95

Asp Ala Cys Glu Ala Val Pro Lys Arg Trp Asn Thr Ala Lys Met Leu

100 105 110

Thr Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

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355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 18

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> TIM-3单抗轻链

<400> 18

Asn Leu Met Gly Phe Lys Gln Cys Trp Asp Glu Ile Thr Leu Tyr Cys

1 5 10 15

Gly Asp Asp Asn Arg Met Phe Trp Glu Asn Glu Gln His Tyr Pro Met

20 25 30

Phe Gln Leu Met Glu Phe Glu Pro Ala Asp Asp Ala Trp Asn Asn His

35 40 45

Arg Ser Gln Asn Lys His Val Val Gln Phe Ser Ala Gln Pro Phe Trp

50 55 60

Leu Ala Gly Ser Cys Thr Trp Lys Asp Ile Arg Met Ile Ser Arg Lys

65 70 75 80

Cys Arg Cys Ser Ala Lys Ser His Gly Pro Met Glu Asp Arg Pro Cys

85 90 95

Asn Trp Phe Met Tyr Ala Thr Thr Gly Leu Ser Phe Arg Asp Gly Asn

100 105 110

Ile Tyr Phe Asn Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

115 120 125

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

130 135 140

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

145 150 155 160

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

165 170 175

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

180 185 190

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val

195 200 205

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

210 215 220

Glu Cys

225