阅读说明：本技术 一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂的制备方法 (Preparation method of modified corn straw material immobilized agricultural microbial agent ) 是由 李新宇 郭秋翠 李旭 张惠文 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物菌剂生产技术领域,具体涉及一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂的制备方法。微生物菌剂含改性玉米秸秆载体和菌悬液；其中,菌悬液有效菌数大于2×10<Sup>8</Sup>个/mL。本发明改性玉米秸秆制作工艺简单,H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>作为氧化剂,成分简单,氧化效果好；经H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>氧化后秸秆分子的活性增强,促进了秸秆的吸附能力,而且玉米秸秆成本低且易得,适合大规模生产；同时本发明改性玉米秸秆粉吸附能力强,其丰富的微孔结构为微生物吸附提供了合适的生长环境；加入的羧甲基纤维素钠可以作为粘连剂,起到包埋和连接的作用,淀粉可以满足微生物生长所需的营养物质,甘油的沸点较高,凝固点比较低,可以使微生物免受环境胁迫,大大提高了菌剂的使用寿命和效果。(The invention belongs to the technical field of microbial agent production, and particularly relates to a preparation method of a modified corn straw material immobilized agricultural microbial agent. The microbial agent contains a modified corn straw carrier and a bacterial suspension; wherein the effective bacteria number of the bacterial suspension is more than 2 multiplied by 10 8 one/mL. The modified corn straw of the invention has simple preparation process and H 2 O 2 As an oxidant, the composition is simple, and the oxidation effect is good; warp H 2 O 2 The activity of the oxidized straw molecules is enhanced, the adsorption capacity of the straw is promoted, and the corn straw is low in cost and easy to obtain and is suitable for large-scale production; meanwhile, the modified corn straw powder has strong adsorption capacity and rich microporous structureMicrobial adsorption provides a suitable growth environment; the added sodium carboxymethyl cellulose can be used as an adhesive to play a role in embedding and connection, the starch can meet the requirements of nutrient substances required by the growth of microorganisms, the boiling point of the glycerol is high, the freezing point is low, the microorganisms can be prevented from being stressed by the environment, and the service life and the effect of the microbial inoculum are greatly improved.)

一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂的制备方法

技术领域

本发明属于微生物菌剂生产技术领域，具体涉及一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂的制备方法。

背景技术

我国是农业大国，在保障农业生产的同时，也造成了农田农药的面源污染问题，未来可能会成为严重制约我国农业可持续发展和农业环境质量改善的最重要的因素之一。微生物修复菌剂能有效降解农田农药残留，改善并恢复土壤质量，还具有修复效果好，成本低，无二次污染的特点。开发高效，稳定，安全的农药残留污染修复的微生物菌剂对我国农业可持续发展具有重大意义。

为了提高微生物修复菌剂的保质期，增强其对环境的适应性，固定化技术是关键。固定化微生物技术主要是通过物理吸附、包埋法、交联法等方式将菌株固定于载体上的技术，其中选用合适的固定化材料是固定化技术的关键。在物理吸附固定化方法中，目前常用的传统载体主要有无机材料(如硅藻土、活性炭、高岭土等)，有机材料(聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等)，天然材料(海藻酸钠、壳聚糖、淀粉等)。但这些载体因为强度低、吸附能力小、传质性差、对微生物有毒害作用、容易造成二次污染等问题，未能广泛的应用于实际修复项目中。因此，获得一种吸附能力强、稳定性好、对微生物无毒害且环境友好的微生物载体，对微生物修复菌剂的广泛应用具有重要的意义。改性玉米秸秆是由玉米秸秆制得的，具有吸附能力强，绿色无毒，环境友好，不会造成二次污染等优点。使用改性玉米秸秆材料作为微生物修复菌剂的载体，不仅可以提高微生物在施用环境中的存活率和对污染物的降解能力，而且还解决了农业废弃物的归置问题，是一种经济环保、合理利用资源的技术。

发明内容

本发明的目的是为了说明一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂，微生物菌剂含改性玉米秸秆载体和菌悬液；其中，菌悬液有效菌数大于2×10⁸个/mL。

所述改性玉米秸秆载体与菌悬液混合，每20mL菌悬液中加入0.5-0.6g改性玉米秸秆载体，混合后再加入混合液混匀，静置吸附3-4h，真空冷冻干燥，制得固定化农用微生物菌剂；其中，混合液与菌悬液体积比为1:1；混合液中羧甲基纤维素钠终浓度为1-1.2wt％，淀粉终浓度为2-2.5wt％，甘油终浓度为1-1.2wt％。

所述改性玉米秸秆载体为经碱性H₂O₂溶液处理后的玉米秸秆。

所述改性玉米秸秆载体为将H₂O₂与去离子水混合均匀，配置1-1.2％H₂O₂的溶液，而后调节溶液的pH至11-12；调节后与烘干的玉米秸秆粉末混匀，22-25℃下搅拌14-16h，搅拌反应后调节体系pH至6-7，过滤烘干即得改性玉米秸秆载体。

进一步的说，将H₂O₂与去离子水混合均匀，配置1-1.2％H₂O₂的溶液，而后加入片状NaOH调节溶液的pH至11-12；调节后与过1mm筛且烘干的玉米秸秆粉末混匀，22-25℃下搅拌14-16h，搅拌后用HCl调节体系pH至6-7，过滤烘干即得改性玉米秸秆载体。

所述碱性H₂O₂溶液与玉米秸秆粉末按质量比为5-5.5：1-1.1比例混合。

所述菌悬液为将发酵培养离心后菌体用脱脂奶粉作为保护剂重悬，制成菌悬液，脱脂奶粉的加入量为2.5-3wt％；其中，菌体为农药降解菌及其它生防类、菌肥类微生物，具体可为：节杆菌属(Arthrobacter)，成刚菌属(Chenggangzhangella)，假单胞菌属(Pseudomonas)，伯克氏菌属(Burkholderia)等。

一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂的制备方法，将烘干玉米秸秆粉浸泡于碱性H₂O₂溶液中得到改性玉米秸秆载体；发酵培养后菌液离心收集菌体用保护剂脱脂奶粉重悬菌体；重悬液与改性玉米秸秆载体混合均匀，混匀后加入混合液，静置吸附3-4h，冷冻干燥，得改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂。

本发明的优点是：

1)载体制作简单：改性玉米秸秆制作工艺简单，H₂O₂作为氧化剂，成分简单，氧化效果好；经H₂O₂氧化后秸秆分子的活性增强，促进了秸秆的吸附能力，而且玉米秸秆成本低且易得，适合大规模生产；

2)固定化效率高：改性玉米秸秆粉吸附能力强，其丰富的微孔结构为微生物吸附提供了合适的生长环境；加入的羧甲基纤维素钠可以作为粘连剂，起到包埋和连接的作用，淀粉可以满足微生物生长所需的营养物质，甘油的沸点较高而凝固点较低，可以使微生物免受环境胁迫，大大提高了菌剂的使用寿命和效果。

3)固定化载体绿色环保：玉米秸秆为天然可降解物质，无毒，对环境无污染，还解决了农业废弃物的归置问题，是一种经济环保的载体。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂，包括如下步骤：

1)量取485mL去离子水和15mL H₂O₂，混合均匀，制成500mL的1％H₂O₂溶液，再加入片状NaOH，调pH至11-12，得碱性1％H₂O₂溶液；

2)称取100g烘干的玉米秸秆粉末，过1mm筛，加入至上述步骤1)所得碱性1％H₂O₂溶液中，用恒温磁力搅拌器搅拌14h；

3)用6mol/L HCl调节步骤2)混合物的pH至6-7，用尼龙网过滤；

4)用去离子水洗涤过滤物，放入电热恒温鼓风干燥箱60℃下烘干至恒重，即制得改性玉米秸秆载体。

5)将本室筛得的除草剂阿特拉津降解菌Arthrobacter keyseri ATR1，按常规方式发酵得到的20mL菌液，在4000r/min，离心10min，收集菌体，用10-13mL，3wt％脱脂奶粉水溶液重悬菌体，制成菌悬液。控制有效活菌数达到农用微生物菌剂产品的技术指标，大于2×10⁸个/mL，将步骤4)改性玉米秸秆载体0.5-0.6g加入到菌悬液中，混合均匀。

6)向步骤5)所得的混合物中加入10-13mL含1wt％羧甲基纤维素钠，2％(v/v)淀粉和1wt％甘油的混合液，静置吸附3-4h，真空冷冻干燥，制得固定后菌剂成品。

7)将上述步骤5)获得发酵液和步骤6)获得固定后菌剂成品，分别经去离子水按10倍梯度稀释的方法进行稀释涂布，发酵液有效活菌数为1.075×10¹²个/mL，将发酵液进一步冷冻干燥，检测到的有效活菌数为5.8×10⁹个/mL；步骤6)制得成品的固定化菌剂有效活菌数为8.129×10¹¹个/mL。

由上述实验结果表明经上述固定化方法固定后有效活菌数存活率高，固定化效率高。

8)取步骤5)中20mL发酵液离心收集菌体和步骤6)中制得的固定化微生物菌剂分别加入含有500mg/L阿特拉津的基础无机盐溶液(NaCl 00.5g/L，NH₄Cl 2g/L，MgSO₄·7H2O0.4g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.2)中，150r/min，振荡培养8h，检测阿特拉津的残留，计算得游离菌体对阿特拉津的降解率为62.66％，改性玉米秸秆固定化的微生物菌剂对阿特拉津的降解率为98.05％，表明改性玉米秸秆固定化微生物菌剂具有高效的降解率。

实施例2

一种改性玉米秸秆材料固定化农用微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)量取485mL去离子水和15mL H₂O₂，混合均匀，制成500mL的1％H₂O₂溶液，再加入片状NaOH，调pH至11-12，得碱性1％H₂O₂溶液；

2)称取100g烘干的玉米秸秆粉末，过1mm筛，加入至上述步骤1)所得碱性1％H₂O₂溶液中，用恒温磁力搅拌器搅拌14h；

3)用6mol/L HCl调节步骤2)混合物的pH至6-7，用尼龙网过滤；

4)用去离子水洗涤过滤物，放入电热恒温鼓风干燥箱60℃下烘干至恒重，即制得改性玉米秸秆载体。

5)将本室筛得的除草剂甲磺隆降解菌Chenggangzhangella methanolivoransCHL1，按常规方式发酵得到的20mL菌液，在4000r/min，离心10min，收集菌体，用10-13mL，3wt％脱脂奶粉水溶液重悬菌体，制成菌悬液。控制有效活菌数达到农用微生物菌剂产品的技术指标，大于2×10⁸个/mL，将步骤4)改性玉米秸秆载体0.5-0.6g加入到菌悬液中，混合均匀。

6)向步骤5)所得的混合物中加入10-13mL含1wt％羧甲基纤维素钠，2％(v/v)淀粉，1wt％甘油的混合液，静置吸附3-4h，真空冷冻干燥，制得固定后菌剂成品。

7)将上述步骤5)获得发酵液和步骤6)获得固定后菌剂成品，分别经去离子水按10倍梯度稀释的方法进行稀释涂布，发酵液有效活菌数为8.5×10¹⁰个/mL，将发酵液进一步冷冻干燥，检测到的有效活菌数为3.07×10⁸个/mL；步骤6)制得成品的固定化菌剂有效活菌数为1.7×10⁹个/mL。

由上述实验结果表明经上述固定化方法固定后有效活菌数存活率高，固定化效率高。

8)取步骤5)中20mL发酵液离心收集菌体和步骤6)中制得的固定化微生物菌剂分别加入含有100mg/L甲磺隆的基础无机盐溶液中，150r/min，振荡培养5天，检测甲磺隆的残留，计算得游离菌体对甲磺隆的降解率为78.13％，改性玉米秸秆固定化的微生物菌剂对甲磺隆的降解率为99.44％，表明改性玉米秸秆固定化微生物菌剂具有高效的降解率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含本发明的保护范围之内。