一种MOFs固载酶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种MOFs固载酶及其制备方法和应用 (MOFs immobilized enzyme and preparation method and application thereof ) 是由 任建军 倪申生 龚磊 李春雨 赵建 牛东泽 张晋 于 2021-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种MOFs固载酶及其制备方法和应用,属于材料与生物工程交叉技术领域。MOFs固载酶的制备方法,包括：将等量的红霉素降解酶与MOFs材料溶解于tris-HCl,调整溶液pH为6.0～8.0,25～35℃搅拌2～3小时,冷冻干燥得到MOFs固载酶ereB@Cu-BTC。MOFs固定化酶具有显著的稳定性和可回收性,可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体,有利于在产业化中的放大应用。(The invention relates to a MOFs immobilized enzyme, a preparation method and an application thereof, belonging to the technical field of crossing of materials and biological engineering. The preparation method of the MOFs immobilized enzyme comprises the following steps: dissolving the same amount of erythromycin degradation enzyme and MOFs material in tris-HCl, adjusting the pH of the solution to 6.0-8.0, stirring for 2-3 hours at 25-35 ℃, and freeze-drying to obtain the MOFs immobilized enzyme ereB @ Cu-BTC. The MOFs immobilized enzyme has remarkable stability and recoverability, can effectively degrade bacterium residues containing erythromycin, sewage and water in the environment, and is favorable for large-scale application in industrialization.)
技术领域
本发明涉及一种MOFs固载酶及其制备方法和应用，属于材料与生物工程交叉技术领域。
背景技术
近几年来，由于红霉素产量的不断增加，红霉素菌渣的含量也不断增加，对人类的危害也日益增加，首先就是菌渣中过剩的营养物质会使微生物过度繁殖，其次就是会导致耐药性微生物的富集，改变原有的环境的菌群结构，所以迫切需要更多安全的方法来处理抗生素菌渣。目前红霉素菌渣处理方法大致有:焚烧处理、厌氧消化技术处理、饲料化处理、肥料化处理、菌渣提纯、能源化处理，这些处理方法往往处理成本高，同时也产生另外的环境问题。而生物法处理红霉素菌渣有着处理成本低，无二次污染等优点。
目前，大多生物处理研究集中在红霉素降解菌的筛选和分离，而对红霉素降解酶的研究较少。红霉素通常由内酯环、红霉糖和氧氨基糖组成。在红霉素降解过程中，内酯环的水解是由红霉素酯酶催化的，酶催化起着关键作用，红霉素酯酶活性是直接关系到红霉素降解效率的因素。而现有红霉素降解酶ereB可以在温和的条件下有效地降解红霉素，但是由于酶的不可回收导致应用成本较高，从而限制了其推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种MOFs固载酶及其制备方法和应用，MOFs固载酶具有显著的稳定性和可回收性，可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体，有利于在产业化中的放大应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种MOFs固载酶的制备方法，包括：将等量的红霉素降解酶与MOFs材料溶解于tris-HCl，调整 pH为6.0～8.0，25～35℃搅拌2～3小时，冷冻干燥得到MOFs固载酶[email protected]。
优选地，所述MOFs为Cu-BTC。
优选地，所述红霉素降解酶为ereB酶。
优选地，所述冷冻干燥温度为-65~-45℃。
优选地，采用HCl和tris调整溶液 pH为6.0～8.0。
优选地，所述MOFs材料的具体制备方法为：
将三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺溶于乙醇中用磁力搅拌机室温搅拌1个小时；
将均苯三甲酸加入到上述溶液中，用磁力搅拌机30℃搅拌1个小时，所述三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺、均苯三甲酸的摩尔比为3：3：1：1；
加入反应釜，85℃加热24小时；
将上述产物离心回收固定，并用乙醇洗涤3次；
将上述产物用乙醇30℃处理12小时；
将上述产物-65~-45℃冷冻干燥得到最终产物。
本发明还提供上述的方法制备得到的MOFs固载酶。
本发明还提供上述的MOFs固载酶在降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体中的应用。
本发明所达到的有益效果：
金属有机框架（Metal-Organic Frameworks，MOFs）具有比表面积大、孔隙率可调、功能性可设计、稳定性好等特点，作为酶固定化的基质材料有着非常好的前景。MOFs固定化酶具有显著的稳定性和可回收性，可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体，有利于在产业化中的放大应用。
附图说明
图1是制备得到的Cu-BTC材料；
图2是[email protected]在不同温度下的酶活；
图3是[email protected]在不同pH下的酶活；
图4是[email protected]应用在红霉素发酵菌渣中的降解率；
图5是[email protected]应用在含红霉素水体中的降解率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供一种MOFs固载酶的制备方法，包括以下步骤：
1.制备Cu-BTC材料
在室温下将Cu(NO3)2·3H2O(0.435g，1.8mmol)、冰醋酸(0.62mL，10.8mmol)、三甲胺0.50mL溶于12mL乙醇中。室温搅拌1h后，将H3BTC(0.210g，1.0mmol)加入深蓝色溶液中。将混合物再搅拌2小时，形成均匀的溶液。然后将混合物转移到内衬特氟龙的高压釜中。将混合物在85℃下加热24小时。通过离心回收固体，用乙醇洗涤三次。最后，将产物用30℃的乙醇处理12h。-65~-45℃冷冻干燥，得到了Cu-BTC产物（如图1）。
2.ereB酶的固定化
等量的红霉素降解酶ereB酶与MOFs材料溶解于tris-HCl，采用HCl和tris调整溶液pH为8.0，30℃搅拌2h，-65~-45℃冷冻干燥得到最终产物[email protected]。
实施例2
MOFs固载酶酶活的测定：
1.不同温度下的酶活
向100mL的超纯水中加入1mL浓度为10g/L的红霉素甲醇溶液，配置成100mg/L的红霉素溶液；然后加入0.1g已制备的[email protected]，分别置于25、35、45、55、65℃水浴摇床中反应10分钟；测定上述不同温度下的酶活（如图2）。
由图2可知，[email protected]的最适反应温度在55℃。
2.不同pH条件下的酶活
分别向100mL的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH=7、7.5、8）、Tris-HCl（pH=8、8.5、9）、Gly-NaOH（pH=9、9.5、10）中加入1mL浓度为10g/L的红霉素甲醇溶液，配置成100mg/L的不同pH的红霉素溶液；然后加入0.1g已制备的[email protected]，置于55℃水浴摇床中反应10分钟；测定上述不同pH下的酶活（如图3）。
由图3可知，[email protected]的最适反应pH在8.0，且Tris-HCl更优。
实施例3
[email protected]在菌渣里的应用：
取100mL红霉素菌渣，经测定红霉素浓度为650mg/L左右；然后加入0.65g已制备的[email protected]，置于常温常压下反应30min。搅拌促进催化，15min降解率达到80%（如图4），离心收集[email protected]，重复以上步骤再次利用回收率达70%。
对照组为在相同体系中加入等量的未负载的ereB酶。
由图4可知，[email protected]在菌渣中15分钟左右降解率大于80%，效果较好，且与游离的酶相比降解效率与速率更优。
实施例4
[email protected]在含红霉素废水里的应用：
取100mL的药厂污水，经测定红霉素浓度为350mg/L左右；然后加入0.35g已制备的[email protected]，置于常温常压下反应30min，搅拌促进催化，20min降解率达到80%（如图5），离心收集[email protected]，回收率达85%。
对照组为在相同体系中加入等量的未负载的ereB酶，且与游离的酶相比降解效率与速率更优。
由图5可知，[email protected]在水体中降解效果不如在菌渣中，在25分钟时达到83%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。