抗细菌和疽原虫抗菌肽的制备及纯化方法
阅读说明：本技术 抗细菌和疽原虫抗菌肽的制备及纯化方法 (Preparation and purification method of antibacterial peptide of gangrene protozoa ) 是由 邓兴朝 陈欢 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明实施例公开了抗细菌和疽原虫抗菌肽的制备及纯化方法。该方法包括：通过聚合酶链式反应扩增目标抗菌肽基因；根据所述目标抗菌肽基因,构建对应的表达载体；将所述表达载体转化到宿主细菌,培养得到重组细菌；诱导所述重组细菌表达包含设定标签的重组抗菌肽；对所述包含设定标签的重组抗菌肽进行酶切,获得无标签的重组抗菌肽作为抗菌肽原料对待纯化的抗菌肽原料进行预处理,获得粗提取抗菌肽；使用设定孔径的微孔滤膜过滤所述粗提取抗菌肽,收集滤液；通过二次超滤的方式,对所述滤液进行过滤,获得目标产物；浓缩所述目标产物,制备获得纯化的抗菌肽。整个方法流程简单,耗时缩短,费用降低,可很好的应用于抗菌肽的工业化制备。(The embodiment of the invention discloses a preparation and purification method of antibacterial and gangrene protozoan antibacterial peptide. The method comprises the following steps: amplifying target antibacterial peptide genes by polymerase chain reaction; constructing a corresponding expression vector according to the target antibacterial peptide gene; transforming the expression vector into host bacteria, and culturing to obtain recombinant bacteria; inducing the recombinant bacteria to express a recombinant antibacterial peptide containing a set label; carrying out enzyme digestion on the recombinant antibacterial peptide containing the set label to obtain non-label recombinant antibacterial peptide serving as an antibacterial peptide raw material for preprocessing the antibacterial peptide raw material to be purified to obtain a crude extracted antibacterial peptide; filtering the crude extract antibacterial peptide by using a microporous filter membrane with a set pore diameter, and collecting filtrate; filtering the filtrate in a secondary ultrafiltration mode to obtain a target product; and concentrating the target product to prepare the purified antibacterial peptide. The whole method has simple flow, short time consumption and low cost, and can be well applied to the industrial preparation of the antibacterial peptide.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗细菌和疽原虫抗菌肽的制备及纯化方法。
背景技术
抗菌肽又可以被称为抗微生物肽，是自然界生物体内普遍存在的小分子多肽。其能够抵抗外界病原体的侵害，是先天免疫系统的重要组成部分，为大多数生物提供第一道防线。
抗菌肽具有广谱杀菌、抑病毒和抑杀肿瘤细胞等活性，且不易产生耐药性，热稳定性高，对多重耐药菌都有很大的杀灭能力，也不会破坏人体正常细胞，毒害小，能增强免疫功能，加速伤口愈合，在医药、食品加工、日化、农业、畜禽养殖业等方面具有很大的应用前景。
虽然抗菌肽具有广阔的应用前景和巨大的开发潜力，但是抗菌肽的产业化进程比较缓慢。目前生产抗菌肽的主要方法是基因工程技术生产抗菌肽，生产成本高，易被酶解，产业化规模有待突破。而且，生产的抗菌肽活性还不够理想，与传统抗生素比较有很大差距。
在实现本发明过程中，发明人发现相关技术存在以下问题：利用传统的基因工程法生产抗菌肽，存在容易酶解，活性产量不够，对宿主细胞有一定的毒害作用等的一系列缺陷，难以实现大规模的产业化生产。
发明内容
针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种抗细菌和疽原虫的抗菌肽抗菌肽的制备及纯化方法，以解决现有抗菌肽生产纯化方法存在多种缺陷，无法很好的实现大规模的产业化生产的问题。
本发明实施例的第一方面提供一种抗菌肽的制备方法。所述方法包括：
通过聚合酶链式反应扩增目标抗菌肽基因；根据所述目标抗菌肽基因，构建对应的表达载体；将所述表达载体转化到宿主细菌，培养得到重组细菌；诱导所述重组细菌表达包含设定标签的重组抗菌肽；对所述包含设定标签的重组抗菌肽进行酶切，获得无标签的重组抗菌肽作为抗菌肽原料。
本发明实施例的第二方面提供一种抗菌肽的纯化方法。该纯化方法包括：
对待纯化的抗菌肽原料进行预处理，获得粗提取抗菌肽；使用设定孔径的微孔滤膜过滤所述粗提取抗菌肽，收集滤液；通过二次超滤的方式，对所述滤液进行过滤，获得目标产物；浓缩所述目标产物，制备获得纯化的抗菌肽。
可选地，所述通过二次超滤的方式，对所述滤液进行过滤，获得目标产物，具体包括：
使用孔径大于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行初次超滤；对所述初次超滤后的过滤液，使用孔径小于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行二次超滤，取截留液获得所述目标产物，或者
使用孔径小于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行初次超滤；对所述初次超滤后的截留液，使用孔径大于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行二次超滤，取过滤液获得所述目标产物。
可选地，所述浓缩所述目标产物，制备获得纯化的抗菌肽，具体包括：将所述目标产物通过纳滤膜进行浓缩，制备获得纯化后的抗菌肽。
可选地，所述微孔滤膜的设定孔径为0.1至1μm。
可选地，当所述待纯化的抗菌肽原料为分泌表达的基因工程抗菌肽时，所述预处理具体包括：收集发酵液并进行离心；取离心后的上清液，获得所述粗提取抗菌肽。
可选地，当所述待纯化的抗菌肽原料为细胞内表达的基因工程抗菌肽时，所述预处理具体包括：裂解细胞并将细胞裂解液进行离心；取离心后的上清液，获得所述粗提取抗菌肽。
可选地，当所述待纯化的抗菌肽原料为细菌类抗菌肽时，所述预处理具体包括：
从培养基中收集活菌；裂解活菌并将活菌裂解液进行离心；取离心后的上清液，获得所述粗提取抗菌肽。
可选地，通过琼脂扩散法检测所述纯化的抗菌肽的活性。
本发明实施例的第三方面提供了一种抗细菌和疽原虫的抗菌肽。所述抗细菌和疽原虫的抗菌肽应用如上所述的制备方法和纯化方法制备获得。
本发明实施例提供的技术方案中，制备和纯化方法的流程简单，耗时缩短，费用降低，可很好的应用于抗菌肽的工业化制备。其抗菌肽的纯化方法可最大限度保持抗菌肽的活性和纯度，具有良好的应用前景。
另外，在生产制备抗菌肽的过程中，利用异源宿主表达含有融合蛋白抗菌肽，利用特殊的标签柱或者减化传统纯化步骤，改善了目标基因表达低的缺陷，并减少了对宿主细胞的毒害，不仅可以得到高纯度的抗菌肽，而且减少了抗菌肽的分离纯化的步骤。
附图说明
图1为本发明实施例的抗菌肽的制备及纯化方法的一个实施例示意图；
图2为本发明实施例的二次超滤的一个实施例示意图；
图3为本发明实施例的表达载体的一个实施例示意图；
图4为本发明实施例的电泳结果的一个实施例示意图；
图5为本发明实施例的抑菌实验的一个实施例示意图。
SEQ ID No.1为上游引物序列；
SEQ ID No.2为下游引物序列。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”、“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
图1为本发明实施例提供一种抗菌肽的制备方法。该制备方法可以如图1所示，所述制备方法可以包括如下步骤：
S110、通过聚合酶链式反应扩增目标抗菌肽基因。
S120、根据所述目标抗菌肽基因，构建对应的表达载体。
S130、将所述表达载体转化到宿主细菌，培养得到重组细菌。
S140、诱导所述重组细菌表达包含设定标签的重组抗菌肽。
S150、对所述包含设定标签的重组抗菌肽进行酶切，获得无标签的重组抗菌肽作为抗菌肽原料。
该方法中利用异源宿主表达含有融合蛋白抗菌肽，并结合了特殊的标签柱。该制备方法改善了目标基因表达低的缺陷，并减少了对宿主细胞的毒害，不仅可以得到高纯度的抗菌肽，而且减少了抗菌肽的分离纯化的步骤。
请继续参阅图1，本发明实施例提供还提供了一种抗菌肽的纯化方法的流程图。与制备方法配合使用以实现对抗菌肽的大规模生产。该纯化方法可以包括如下步骤：
S210、对待纯化的抗菌肽原料进行预处理，获得粗提取抗菌肽。
具体的，根据获得抗菌肽原料的基因工程的方法的不同，可以采用相应的预处理方式来获得粗提取抗菌提。在一些实施例中，当所述待纯化的抗菌肽原料为分泌表达的基因工程抗菌肽时，所述预处理可以是：首先收集发酵液并进行离心。然后，取离心后的上清液即为所述粗提取抗菌肽。
而当所述待纯化的抗菌肽原料为细胞内表达的基因工程抗菌肽时，所述预处理的步骤可以包括：首先，裂解细胞并将细胞裂解液进行离心。然后，取离心后的上清液即为获得所述粗提取抗菌肽。
若所述待纯化的抗菌肽原料为细菌类抗菌肽时，所述预处理的步骤则可以包括：首先，从培养基中收集活菌。然后，裂解活菌并将活菌裂解液进行离心。最后，取离心后的上清液，获得所述粗提取抗菌肽。
S220、使用设定孔径的微孔滤膜过滤所述粗提取抗菌肽，收集滤液。
在步骤220中，进一步的使用微滤的方式对粗提取抗菌肽进行初步的纯化。具体可以使用任何合适孔径的微孔滤膜来实现该微滤的步骤。较佳的是，可以选择使用孔径为0.1至1μm的微孔滤膜。
S230、通过二次超滤的方式，对所述滤液进行过滤，获得目标产物。
“二次超滤”是指通过两次不同孔径的超滤，形成具有分子量上限和分子量下限的过滤空间以获得最终的目标产物。
在一些实施例中，如图2所示，所述二次超滤的过程可以包括如下步骤：
S231、使用孔径小于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行初次超滤。
S232、对所述初次超滤后的截留液，使用孔径大于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行二次超滤。
S233取过滤液获得所述目标产物。
当然，在另一些实施例中，也可以改变两次超滤的先后顺序，而不限于使用图2所示的步骤。例如，首先使用孔径大于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行初次超滤。然后，对所述初次超滤后的过滤液，使用孔径小于抗菌肽分子量的超滤膜对所述滤液进行二次超滤，取截留液获得所述目标产物。
这两种方式都可以取得相同的效果，将超出分子量上限和分子量下限的杂质去除而保留目标产物以达到纯化的效果。
S240、浓缩所述目标产物，制备获得纯化的抗菌肽。
通过对目标产物的进一步浓缩和富集后，即可获得浓度较高的抗菌肽。具体可以采用任何合适的方式来实现浓缩和富集的过程。在一些实施例中，可以使用纳滤的方式，将所述目标产物通过纳滤膜进行浓缩，制备获得纯化后的抗菌肽。
对于纯化后的抗菌肽，具体可以使用琼脂扩散法来进行抗菌肽的活性检测。该琼脂扩散法具体包括如下步骤：
首先，固体检测培养基冷却到50℃左右时，加入2％指示菌悬液，充分摇匀，取10ml该培养基加到无菌培养皿中，待凝固后用2.7mm的中空打孔器在每个平板上打若干孔，向其中加入6μl待测的已纯化抗菌肽，静置20min后，放入37℃恒温培养箱中温育18h，测量抑菌圈直径。若出现了明显的抑制圈(直径大于设定阈值)时，表明纯化后的抗菌肽具有活性。
基于本发明实施例揭露的制备和纯化方法，可以用于制备多种不同的类型的抗菌肽。在一些实施例中，本发明实施例还提供了一种具有抗细菌和抗疽原虫活性的抗菌肽。所述抗细菌和抗疽原虫的抗菌肽应用如上所述的制备方法和纯化方法制备获得。
以下结合具体实例，详细描述上述抗菌肽的制备和纯化方法的具体流程。应当说明的是，该具体实例仅用于解释说明而不用于对本申请的保护范围构成限制。该具体实例中的数值或者数值范围都一定特指绝对值，可以在误差允许的范围内浮动。
1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目标基因：
按照试剂盒说明书，提取非洲帝王蝎毒液中总RNA。使用反转录试剂盒进行反转录，得到总cDNA。以总cDNA为模板，用上游引物和下游引物扩增抗菌肽Scorpine基因。
上游引物序列如SEQ ID No.1所示：
5’-CTGCGATCCGGCTGGATTAACGAGGAGAAG-3’
下游引物序列为如SEQ ID No.2所示：
5’-ATTACTCGAGTTAGTAGGAGAGAGGGGTGCC-3’
其中，PCR扩增过程为：94℃、4min；94℃、30s；50℃、30s；72℃、1min,共30个循坏；72℃、7min；4℃、12min。反应结束后PCR扩增产物送测序公司进行测序，测序鉴定正确扩增出抗菌肽Scorpine基因。
2)构建pSUMO/scorpine表达载体：
2.1)使用PCR产物纯化试剂盒提纯PCR扩增产物后，以限制性内切酶BamH I和XhoI酶切提纯PCR扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳后，用Agaose Gel Extraction Kit提纯得到抗菌肽Scorpine基因DNA。
2.2)将pSUM0质粒采用BamH I和Xho I酶切、提纯得到线性化的pSUMO质粒载体。
2.3)以连接试剂盒将线性化的pSUM0质粒载体和抗菌肽Scorpine基因DNA，在16℃连接过夜，得到连接产物。
3)重组基因的验证：
将连接产物利用热激法(42℃、90s)转化到DH5α-感受态细菌上，连接产物与DH5α-感受态细菌上的体积比为1：100。然后，将其涂布于固体LB(含有50mg/ml卡那霉素)培养基上，37℃培养箱过夜培养，挑取生长出的细菌菌落，送测序公司进行测序鉴定，测序证实目的基因***位点***大小正确。
构建得到pSUM0/scorpine表达载体示意图如图3所示。其中，f1 origin指基因复制子，kanr指卡那霉素抗性基因，ori指基因复制起始点，T7 promoter指原核基因启动子T7,lacl指乳糖基因，6xHis指六个组氨基酸标签,SUM0为小的类泛素标签。
4)重组抗菌肽Scorpine蛋白表达和纯化：
将pSUM0/scorpine表达载体(即连接产物)利用热激法(42℃、90s)转化到BL-21(DH3)pLys感受态细菌上，pSUM0/scorpine表达载体与BL-21(DH3)pLys感受态细菌的体积比为1:100。然后，涂布于固体LB培养基(含有50mg/ml卡那霉素)上，37℃培养箱过夜培养。
挑取单一菌落入液体LB培养基(含有50mg/ml卡那霉素)中，于37℃、220rpm摇床中培养，然后按1:1000比例转接入新的液体LB培养基(含有50mg/ml卡那霉素)中，于37℃、220rpm摇床中培养。
在培养至0D600值约为0.4时，加入0.5mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于28℃、摇床诱导6h。然后，于4℃、10000rpm，离心10min，弃上清，收集细菌沉淀。
然后，将部分细菌沉淀进行超声破碎(功率为400W,每次超声10秒，间隙10秒，超声99次)后，于12000rpm、4℃离心10min。
最后，分别将超声前的细菌沉淀、超声后的细菌上清及超声后的细菌沉淀保存于-20℃备用或者立即纯化。
将上述三种样本经12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。图4为所述SDS-PAGE的电泳结果示意图。如图4所示，重组Scorpine蛋白分子量大约为18kDa(包括标签His-SUM0分子量(10KDa)，以可溶形式存在细菌内。
5)对待纯化抗菌肽原料的预处理：
从液体或固体培养基中收集在步骤4中已经成功表达目标抗菌肽的活菌，裂解细胞，然后离心取上清，得到粗提抗菌肽。
6)对粗提取抗菌肽的微滤：
采用0.2μm孔径的无机陶瓷微滤实验用装置对步骤5获得的上清液进行微滤。微滤的操作参数为40℃、0.3MPa、pH7.5。
为减缓膜的污染程度，在本实施例中，每运行20min通过管路阀门改变连接，利用透过液进行反向冲洗2min。每运行20min向料液中补充去离子水至体积浓缩因子达到5时停止运行。
7)二次超滤：
其中，第一次使用milipore超滤膜时，光面向下置于烧杯中，在灭菌水中漂洗1小时以上，换水三次以完成超滤膜的准备。
另外，将超滤膜光面向上安装在小型超滤器上，装入经过微滤的原料液3ml，连接胶管，充入氮气，压力在2.5-4.0个大气压范围内，置于磁力搅拌器上，4℃条件下进行。
在本实施例中，先用10000截留分子量的超滤膜，取滤过液；再用1000截留分子量的超滤膜超滤，取截留液。
8)纳滤：
采用实验室小型纳滤设备，选用截留分子质量为160D的聚醚砜卷式膜(有效膜面积0.25m)，将经过上述超滤的原料液通过纳滤设备浓缩，使其体积浓缩倍数为5，得到纯化后的抗菌肽。其中，纳滤压力为2bar，料液温度为室温。
9)纯化后抗菌肽的活性检测：
用琼脂扩散法鉴定纯化后的抗菌肽的生物学活性。其中，具体的方法步骤包括：
在内径为8.65cm Petri平皿中，将标准菌株E.coli K12D31均匀混入10ml 45-50℃LB琼脂培养基，使活菌数最终达106/ml，凝固后打出2.7mm直径孔穴。
然后，将纯化后的抗菌肽原液以及将原液进行四次倍比稀释后形成的5个浓度抗菌肽液，按6μl/孔加入孔穴，培养18h后观察结果，观察有无抑菌圈。
结果如图5所示，抗菌肽原液、原液的1/2、1/4稀释液都出现了明显的抑制圈，即说明纯化后的抗菌肽有活性，纯化成功。
综上所述，本发明实施例提供的抗菌肽制备及纯化方法，解决了抗菌肽表达后对宿主的毒性，还可以有效的分离纯化抗菌肽。而且使用“微滤”“超滤”及“纳滤”等早已实现工业生产化，且在医药产业中应用广泛的技术，有利于大规模生产推广。
本发明实施例提供的纯化方法中，分离纯化的方法费用明显降低，可用于药品制备，也可最大限度保持抗菌肽的活性和纯度，具有良好的应用前景。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳容金科技有限公司
<120> 抗细菌和疽原虫抗菌肽的制备及纯化方法
<141> 2019-09-17
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctgcgatccg gctggattaa cgaggagaag 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
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