阅读说明：本技术 一种超声辅助驴皮蛋白酶解制备抗氧化肽的方法 (Method for preparing antioxidant peptide by donkey hide protease hydrolysis under assistance of ultrasound ) 是由 黄雅钦 杜博玮 李承明 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：一种超声辅助驴皮蛋白酶解制备抗氧化肽的方法,涉及生物技术领域。通过在酶解开始前对酶解体系采用脉冲超声波处理,与经过同样酶解过程但不施加超声的对照试验相比,可以使产物的肽得率提高,清除DPPH的IC<Sub>50</Sub>值降低,大大提高了酶解效率和产物的活性。(A method for preparing antioxidant peptide by donkey hide protease hydrolysis assisted by ultrasound relates to the field of biotechnology. By treating the enzymolysis system with pulsed ultrasonic waves before the start of enzymolysis, the method can improve the peptide yield of the product and eliminate the IC of DPPH compared with a control test in which the same enzymolysis process is carried out but no ultrasonic wave is applied 50 The value is reduced, and the enzymolysis efficiency and the activity of the product are greatly improved.)

一种超声辅助驴皮蛋白酶解制备抗氧化肽的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种超声辅助驴皮蛋白酶解制备抗氧化肽的方法。

背景技术

在生物体内，活性氧不断通过非酶与酶反应产生，同时在抗氧化酶系和内源性抗氧化剂的协同作用下不断被清除。正常人体中，活性氧在氧化与还原的平衡下维持有利无害的极低水平。但是当机体处于衰老、生病或疲劳状态时，体内自由基的平衡可能被破坏，过量的自由基会对机体造成一系列氧化性损伤。

天然抗氧化剂是指从天然动、植物体或其代谢物中提取出来的具有抗氧化活性的物质。因其良好的生物相容性被广泛的研究。驴的干燥皮或鲜皮胶原经煎煮、浓缩而水解制成的阿胶早在《本草纲目》中就有各种药效的记载。为了提高阿胶的抗氧化性，中国专利申请CN108741100A公开了一种螯合铁阿胶糖肽的制备方法。所述制备过程包括蛋白酶酶解阿胶溶液后超滤分级，进行Maillard反应和螯合铁反应，最终纳滤纯化。通过以上制备过程得到抗氧化的阿胶糖肽。中国专利申请CN107519217A公开了一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物，通过将阿胶进行酶解并于银杏叶提取物复配，得到具有高抗氧化性的组合物。然而，阿胶的制备工艺复杂，耗时久，如果能够将驴皮直接水解成抗氧化活性肽将会很大程度上节约成本、加快生产。活性肽的制备主要采用蛋白酶水解的方法，但是常规酶解存在水解效率低、水解速度慢、酶利用率低、生产成本高等缺点。利用一些物理手段对底物或参与反应的其它物质进行预处理往往能够加快水解进程。近年来，超声波技术在食品加工领域的应用越来越广泛，尤其在有效成分的提取方面应用较多。用超声辅助酶解驴皮提高驴皮酶解物的抗氧化性显得尤为重要。

发明内容

本发明的技术方案是：

一种超声辅助驴皮蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成0.5—5cm的小块；

(2)20-40℃下加入0.1-1mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.1-5％的脂肪酶，料液比1：1-1：20(g/mL)，搅拌10-60min；

(3)将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴20-60min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理10-60min，处理条件为：温度40-70℃，频率20-40kHz，功率100W-600W，工作/间歇比为5s/5s～0s；超声处理停止后，进行酶解；

(4)加入占原料驴皮质量0.5％～6％的蛋白酶，通过滴加用NaOH溶液(优选浓度0.5mol/L)调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；

(5)酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10～20min后，取取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。

进一步的，步骤(4)中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。

本发明的有益效果：

本发明在酶解开始后对酶解体系采用脉冲超声波处理，与经过同样酶解过程但不施加超声的对照试验相比，可以使酶解产物的肽得率提高，清除DPPH的IC₅₀值降低，大大提高了酶解效率和产物的活性。

具体实施方式

下面通过非限制性实施例，进一步阐述本发明，理解本发明。

抗氧化(活性)肽能够清除自由基，抑制或消除以及减缓氧化反应。其抗氧化机理包括：给抗氧化酶提供氢、缓冲生理pH值、螯合金属离子和捕捉自由基等。本发明中通过测定酶解产物对DPPH自由基的清除能力评价驴皮蛋白酶解产物的抗氧化活性。驴皮蛋白水解肽产品配制成梯度浓度溶液，测定对DPPH自由基的清除率，进而计算IC₅₀值。

DPPH自由基清除率的测定方法：将驴皮蛋白水解肽配制成不同浓度的溶液，取不同浓度溶液各0.1mL，加入0.1mL浓度为0.2mM的DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，避光反应60min，于517nm处测定吸光值A_i；分别取上述各浓度溶液0.1mL，加入0.1mL无水乙醇，反应后测得吸光值A_j；以0.1mL浓度为0.2mM的DPPH溶液和0.1mL无水乙醇反应测得吸光值A₀作为参比。清除率计算公式为：

EDPPH＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100

式中：EDPPH为对DPPH自由基的清除率，％；A_i为0.1mL样品溶液加入0.1mL的DPPH溶液的吸光值；A_j为0.1mL样品溶液加入0.1mL无水乙醇的吸光值；A₀为0.1mL的DPPH溶液加入0.1mL无水乙醇的吸光值。

IC₅₀的计算：IC₅₀是驴皮蛋白水解肽对DPPH清除率达到50％时的浓度。首先把样品稀释成一系列浓度，测定各浓度样品对DPPH的清除率，绘制清除率和浓度的关系曲线，在曲线上查出样品的IC₅₀值。

试验中所用碱性蛋白酶作用范围广，酶活力20万U/g，生产厂家为上海源叶生物技术有限公司。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成2cm的小块；30℃下加入0.4mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.9％脂肪酶，料液比1：8(g/mL)，搅拌30min；将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴30min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理20min，处理条件为：温度40℃，频率20kHz，功率100W，工作/间歇比为5s/5s；超声处理停止后，进行酶解；加入占原料驴皮质量2.6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10min后，取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。利用DPPH自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

实施例2

将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成2cm的小块；30℃下加入0.4mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.9％脂肪酶，料液比1：8(g/mL)，搅拌30min；将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴30min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理20min，处理条件为：温度40℃，频率20kHz，功率200W，工作/间歇比为5s/5s；超声处理停止后，进行酶解；加入占原料驴皮质量2.6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10min后，取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。利用DPPH自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

实施例3

将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成2cm的小块；30℃下加入0.4mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.9％脂肪酶，料液比1：8(g/mL)，搅拌30min；将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴30min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理20min，处理条件为：温度40℃，频率20kHz，功率300W，工作/间歇比为5s/5s；超声处理停止后，进行酶解；加入占原料驴皮质量2.6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10min后，取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。利用DPPH自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

实施例4

将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成2cm的小块；30℃下加入0.4mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.9％脂肪酶，料液比1：8(g/mL)，搅拌30min；将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴30min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理20min，处理条件为：温度40℃，频率20kHz，功率500W，工作/间歇比为5s/5s；超声处理停止后，进行酶解；加入占原料驴皮质量2.6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10min后，取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。利用DPPH自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

实施例5

将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成2cm的小块；30℃下加入0.4mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.9％脂肪酶，料液比1：8(g/mL)，搅拌30min；将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴30min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理30min，处理条件为：温度40℃，频率40kHz，功率140W；超声处理停止后，进行酶解；加入占原料驴皮质量2.6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10min后，取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。利用DPPH自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

实施例6

将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成2cm的小块；30℃下加入0.4mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.9％脂肪酶，料液比1：8(g/mL)，搅拌30min；将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴30min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理60min，处理条件为：温度40℃，频率40kHz，功率140W；超声处理停止后，进行酶解；加入占原料驴皮质量2.6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10min后，取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。利用DPPH自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

实施例7

将驴皮去除驴毛及附肉，清洗后切割成2cm的小块；30℃下加入0.4mol/LNa₂CO₃、加入占原料驴皮质量0.9％脂肪酶，料液比1：8(g/mL)，搅拌30min；将用去离子水洗净的皮块打碎后沸水浴30min，料液比1：20(g/mL)，对体系采用进行脉冲超声处理90min，处理条件为：温度40℃，频率40kHz，功率140W；超声处理停止后，进行酶解；加入占原料驴皮质量2.6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值到8.2，调节温度至40℃，酶解总时间150min；酶解结束后，将酶解液加热至95℃并保持10min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，6500rpm离心10min后，取上清液过滤进行旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得驴皮蛋白水解肽粉。利用DPPH自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

对比例1

操作步骤与实施例1相同，但在酶解开始前不施加超声波处理，测定多肽产品的得率和对DPPH的清除率。

对比例2

使用同样为驴皮水解物的商业阿胶，测定产品的DPPH的清除率。

表1实施例与对照试验的多肽得率及清除DPPH自由基的IC₅₀值比较

以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。