一种重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条及其制备方法和应用 (Fluorescent quantitative rapid detection test strip for heavy metal mercury ions and preparation method and application thereof ) 是由 胥传来 李少珍 匡华 徐丽广 马伟 朱建平 刘丽强 吴晓玲 宋珊珊 胡拥明 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：一种重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条及其制备方法和应用,属于食品检测技术领域。本发明PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；在PVC底板中部设有硝酸纤维素膜检测层,在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设有荧光微球标记垫；所述荧光微球标记垫一端与样品垫互相叠加,另一端与硝酸纤维素膜检测层互相叠加；所述硝酸纤维素膜检测层上依次设有质控线和检测线。本发明检测速度快,全过程只需要5min即可,可以实施大批量样品的快速检测；本发明灵敏度高,大米样本检测限为10ng/mL；本发明过程简单,直接上样检测,样品前处理简单,无需经过专业培训,易于推广,不需要仪器,适合现场检测。(A fluorescent quantitative rapid detection test strip for heavy metal mercury ions and a preparation method and application thereof belong to the technical field of food detection. The two ends of the PVC base plate are respectively provided with a sample pad and a water absorption pad; a nitrocellulose membrane detection layer is arranged in the middle of the PVC base plate, and a fluorescent microsphere marking pad is arranged between the nitrocellulose membrane detection layer and the sample pad; one end of the fluorescent microsphere marking pad is mutually overlapped with the sample pad, and the other end of the fluorescent microsphere marking pad is mutually overlapped with the nitrocellulose membrane detection layer; and the nitrocellulose membrane detection layer is sequentially provided with a quality control line and a detection line. The invention has fast detection speed, the whole process only needs 5min, and the rapid detection of a large batch of samples can be implemented; the invention has high sensitivity, and the detection limit of the rice sample is 10 ng/mL; the method has the advantages of simple process, direct sample loading detection, simple sample pretreatment, no need of professional training, easy popularization, no need of instruments and suitability for field detection.)
技术领域
本发明涉及一种重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条及其制备方法和应用，属于食品检测技术领域。
背景技术
汞是一种常见的化学物质，是毒性较强的重金属离子之一，对水生生物和人类健康有很大的危害。汞中毒主要损坏人及动物的神经系统，破坏脑组织，此外对人的消化系统、听力和皮肤等都有巨大影响，可对婴儿正在发育的大脑和神经系统产生不利的影响。
重金属离子的检测方法有很多，常用的方法有电感耦合等离子体发射法、原子荧光光谱法、原子吸收光谱法和氢化物发生原子荧光光谱法等。近年来又出现了很多检测汞离子的新方法，如以各种生物化学物质：荧光物质、金纳米粒子、有机分子、DNA酶和电化学等为基础的传感器方法，这些方法灵敏度较高，但有些方法存在样品预处理复杂、仪器昂贵、费时等。荧光定量快速检测试纸条具有方便快捷，可以用于现场临时检测、成本较低、操作简单等优点。本研究利用汞离子单克隆抗体，建立了一种快速直接检测汞离子的荧光定量检测试纸条方法，该方法快速准确，不需要繁琐的样品预处理过程，能满足不同样品的快速检测要求。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种重金属汞离子荧光定量检测试纸条及其制备方法与应用，可大规模地对粮食及其加工产品残留重金属汞进行快速、方便、准确的检测。
本发明的技术方案，一种重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条，包括样品垫、荧光微球标记垫、检测线、质控线、吸水垫、硝酸纤维素膜检测层和PVC底板；
所述PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；在PVC底板中部设有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设有荧光微球标记垫；所述荧光微球标记垫一端与样品垫互相叠加，另一端与硝酸纤维素膜检测层互相叠加；所述硝酸纤维素膜检测层上依次设有质控线和检测线。
一株高分泌重金属汞离子特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株ABA，巳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为CGMCCNo.17388，保藏日期为2019年3月7日。
所述重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条的制备方法，具体步骤如下：
（1）汞抗原的制备：首先，将10mg ITCBE溶于1mL无水DMSO中，震荡混匀，-20℃保存。称取BSA 20mg，加入5mLHBS（0.01M PH=9）溶液溶解，滴加34μL ITCBE溶液，室温搅拌反应8h，然后滴加187μL（1mg/mL）的汞标准品溶液，用0.5M NaOH调节PH，使溶液的PH维持在8-9，反应1h即可。反应完毕用截留量3000的Amicon Ultra-4 Ultracel-3K 超滤离心管离心6500rpm，时间20min，每次超滤完毕后用3mL HBS溶液重悬。反复超滤三次，加入10mL HBS溶液使蛋白的终浓度为2mg/mL，-20℃冻存保存。
（2）抗汞离子单抗的制备：用双功能螯合剂ITCBE与KLH偶联之后加入重金属汞离子进行螯合，以此作为完全免疫原。此完全免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫采用重金属汞离子的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，剂量为100μg/只；多次加强免疫采用重金属汞离子的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，剂量为50μg/只；最后一次用重金属汞离子完全抗原与生理盐水混合冲刺免疫。采用腹腔注射，剂量为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得重金属汞离子的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株ABA。
（4）重金属汞离子抗体纯化：将高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株ABA扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取1mL腹水，加入相当于腹水体积1mL的醋酸钠缓冲液，于室温搅拌下逐滴加入辛酸33.3μL，震荡30min，8000rpm离心5min，得到上清液；加入饱和硫酸铵1mL，静置1-2h；8000rpm离心5min，弃上清液，将沉淀溶于PBS溶液中进行透析3天，得到抗汞离子单克隆抗体；
（5）重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条的制备：
a、荧光微球储备液的制备：取0.05M pH为8的硼酸缓冲液400μL于2mL离心管中，加入100μL-120μL荧光微球，漩涡震荡，混匀备用；
b、荧光微球标记抗体的制备：取10mg/mL的EDC溶液 20μL，室温震荡活化15min，10℃2000rpm离心10min，弃上清，用0.5mL 0.05M pH=8 硼酸缓冲液复溶，超声分散；加入重金属汞离子抗体，使蛋白终浓度为30μg/mL-50μg/mL，置于250r摇床上2h；加入封闭液，即最终浓度为1% -2%BSA，置于摇床封闭1-2h，2000rpm离心10min，弃上清，用0.5mL硼酸缓冲液复溶，洗涤离心后用硼酸缓冲液复溶，超声分散后得到荧光标记的重金属汞离子抗体，4℃保存；
c、荧光微球标记垫的制备：将0.2mg/mL步骤b制备所得标记好荧光的重金属汞离子抗体均匀喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.5-1μL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用；
d、硝酸纤维素膜检测层的制备：将稀释好的0.2mg/mL的重金属汞离子抗原均匀喷在硝酸纤维素膜检测层上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃烘干过夜，封袋备用；
e、组合：将PVC底板、样品垫、荧光微球标记垫、涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜检测层和吸水垫组合，即得产品重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条。
将其应用于食品中重金属汞离子的快速检测，适用于海关、企业、检验检疫单位等，可实现大米样本中重金属汞离子的快速检测。
本发明的有益效果：本发明检测速度快，全过程只需要5min即可，可以实施大批量样品的快速检测；本发明灵敏度高，大米样本检测线为10ng/mL；
本发明过程简单，直接上样检测，样品前处理简单，无需经过专业培训，易于推广，不需要仪器，适合现场检测。
生物材料样品保藏：一株高分泌重金属汞离子特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株ABA，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为CGMCCNo.17388，保藏日期为2019年3月7日。
附图说明
图1是本发明检测试纸条结构示意图。
图2是大米样本汞离子检测标准曲线。
附图标记说明：1、样品垫；2、荧光微球标记垫；3、检测线；4、质控线；5、吸水垫；6、硝酸纤维素膜检测层；7、PVC底板。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，一种重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条，包括样品垫1、荧光微球标记垫2、检测线3、质控线4、吸水垫5、硝酸纤维素膜检测层6和PVC底板7；
所述PVC底板7两端分别设有样品垫1和吸水垫5；在PVC底板7中部设有硝酸纤维素膜检测层6，在硝酸纤维素膜检测层6与样品垫1之间设有荧光微球标记垫2；所述荧光微球标记垫2一端与样品垫1互相叠加，另一端与硝酸纤维素膜检测层6互相叠加；所述硝酸纤维素膜检测层6上依次设有质控线4和检测线3。
所述重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条的制备方法，具体步骤如下：
（1）汞抗原的制备：首先，将10mg ITCBE溶于1mL无水DMSO中，震荡混匀，-20℃保存。称取BSA 20mg，加入5mLHBS（0.01M PH=9）溶液溶解，滴加34μL ITCBE溶液，室温搅拌反应8h，然后滴加187μL（1mg/mL）的汞标准品溶液，用0.5M NaOH调节PH，使溶液的PH维持在8-9，反应1h即可。反应完毕用截留量3000的Amicon Ultra-4 Ultracel-3K 超滤离心管离心6500rpm，时间20min，每次超滤完毕后用3mL HBS溶液重悬。反复超滤三次，加入10mL HBS溶液使蛋白的终浓度为2mg/mL，-20℃冻存保存。
（2）抗汞离子单抗的制备：用双功能螯合剂ITCBE与KLH偶联之后加入重金属汞离子进行螯合，以此作为完全免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫采用重金属汞离子的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，剂量为100μg/只；多次加强免疫采用重金属汞离子的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，剂量为50μg/只；最后一次用重金属汞离子完全抗原与生理盐水混合冲刺免疫。采用腹腔注射，剂量为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得重金属汞离子的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株ABA。
（4）重金属汞离子抗体纯化：将高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株ABA扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取1mL腹水，加入相当于腹水体积1mL的醋酸钠缓冲液，于室温搅拌下逐滴加入辛酸33.3μL，震荡30min，8000rpm离心5min，得到上清液；加入饱和硫酸铵1mL，静置1-2h；8000rpm离心5min，弃上清液，将沉淀溶于PBS溶液中进行透析3天，得到抗汞离子单克隆抗体；
（5）重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条的制备：
a、荧光微球储备液的制备：取0.05M pH为8的硼酸缓冲液400μL于2mL离心管中，加入100μL荧光微球，漩涡震荡，混匀备用；
b、荧光微球标记抗体的制备：取10mg/mL的EDC溶液 20μL，室温震荡活化15min，20000rpm 10℃离心10min，弃上清，用0.5ml 0.05M PH=8 硼酸缓冲液复溶，超声分散；加入重金属汞离子抗体，使蛋白终浓度为30μg/mL，置于250r摇床上2h；加入封闭液，即最终浓度为1% BSA，置于摇床封闭2h，2000rpm离心10min，弃上清，用0.5mL硼酸缓冲液复溶，洗涤离心后用硼酸缓冲液复溶，超声分散后得到荧光标记的重金属汞离子抗体，4℃保存；
c、荧光微球标记垫的制备：将0.2mg/mL步骤b制备所得标记好荧光的重金属汞离子抗体均匀喷在玻璃纤维膜检测层上，喷液量1μL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用；
d、硝酸纤维素膜检测层的制备：将稀释好的0.2mg/mL的重金属汞离子抗原均匀喷在硝酸纤维素膜检测层上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃烘干过夜，封袋备用；
e、组合：将PVC底板7、样品垫1、荧光微球标记垫2、涂有检测线3和质控线4的硝酸纤维素膜检测层6和吸水垫5组合，即得产品重金属汞离子的荧光定量快速检测试纸条。
实施例2
检测时按如下步骤处理样品：准确称量粉碎至合适粒径的大米样品3g于50mL离心管中，加入9mL 0.5M稀盐酸溶液和6mL 二氯甲烷，于振荡器上震荡3min，8000rpm离心3min，取上清液500μL加1mL的正己烷，取下层溶液200μL用1M NaHCO3稀释4倍备用，同时做试剂空白。
取20μL稀释好的样本溶液滴加在样品垫上，5min之后将试纸条放入荧光定量检测仪，即可检测出重金属汞离子浓度，图2为大米样本汞离子检测标准曲线；如果试纸条质控线4不显色，则说明试纸条质量有问题。