阅读说明：本技术 一种高效低毒四霉素b衍生物及其制备和应用 (High-efficiency low-toxicity tetramycin B derivative and preparation and application thereof ) 是由 康前进 盛勇 白林泉 于 2019-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用；所述四霉素B衍生物,分子式为C<Sub>35</Sub>H<Sub>55</Sub>NO<Sub>12</Sub>,化学结构式为：<Image he="517" wi="678" file="DDA0002168804510000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>该四霉素B衍生物是以基因工程改造菌株刺孢吸水链霉菌(Streptomyces hygrospinocus var.beijingensis)SY02为原料,经发酵液萃取、菌体浸泡、MCI胶柱层析及高效液相色谱制备分离获得。本发明化合物经体外抗真菌活性及溶血毒性测定,发现其抗真菌活性较好,溶血毒性较低,可作为抗真菌药物和食品防腐剂,具有良好的临床应用前景与经济价值。(The invention discloses a high-efficiency low-toxicity tetramycin B derivative, a preparation method and an application thereof, wherein the molecular formula of the tetramycin B derivative is C 35 H 55 NO 12 , the chemical structural formula of the tetramycin B derivative is , and the tetramycin B derivative is obtained by taking a genetically engineered strain Streptomyces hygroscopicus var. beijingensis SY02 as a raw material and performing fermentation liquor extraction, thallus soaking, MCI (cellulose-activated silica gel) column chromatography and high performance liquid chromatography preparation and separation.)

一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用

技术领域

本研究涉及的是一种微生物天然次级代谢产物分离制备技术，具体涉及一种高效低毒 四霉素B衍生物及其制备和应用。

背景技术

临床上广谱抗菌素、免疫抑制剂及器官移植等所造成的真菌感染使得深度真菌病及其死亡 率逐年上升。由于真菌病原体耐药性的迅速发展，使得临床上可用于治疗系统性真菌感染 的抗真菌药物十分有限。多烯大环内酯抗生素由于其特殊的化学结构及其良好的抗真菌活 性，目前被公认为最有效的抗真菌药物。虽然历经半个多世纪的临床应用，多烯大环内酯 抗生素几乎很少出现抗药性，然而由于该类药物水溶性较低、易于哺乳动物细胞膜上的胆 固醇发生反应，造成严重的溶血毒性，严重影响其临床应用。

四霉素B是一种常用的多烯大环内酯抗生素，据相关文献报道，其对农林植物真菌性感染 具有良好的防治效果。但由于其抗真菌活性相比其他抗真菌类药物较低，且溶血毒性偏高。 这一药理学性质的弊端，严重限制了四霉素B的广泛应用。因此采用基因工程的手段及生 物合成策略有效生成新的生物活性较高，溶血毒性更低的天然抗真菌药物迫在眉睫。

发明内容

本发明目的在于提供一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种高效低毒四霉素B衍生物，分子式为C₃₅H₅₅NO₁₂，化学结构式为：

第二方面，本发明涉及一种上述的高效低毒四霉素B衍生物的制备方法，所述方法包 括如下步骤：

S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中 聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；

S2、在所述同框缺失突变菌株中对四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG 进行失活，获得基因tetrG失活突变菌株；

S3、发酵培养所述基因tetrG失活突变菌株，经发酵液萃取、菌体浸泡、MCI胶柱层析及高效液相色谱制备分离获得所述高效低毒四霉素B衍生物。

作为本发明的一个实施方案，所述基因nysI同框缺失突变菌株为基因工程改造菌株刺 孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinocus var.beijingensis)SY02。

作为本发明的一个实施方案，所述基因tetrG失活突变菌株为基因工程改造菌株刺孢 吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinocus var.beijingensis)SY04。

本发明中，步骤S1具体包括步骤如下：

S11、构建用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒 pJQK503；

S12、将所述质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水 链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；

S13、通过对步骤S12获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失突变菌株。

所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII双酶切位点间，分别插 入经测序正确的左右同源臂片段ΔNys-L与ΔNys-R；且同源臂片段ΔNys-L是***XbaI/BspTI酶切位点之间，同源臂片段ΔNys-R是***BspTI/HindIII酶切位点之间。

同源臂片段ΔNys-L的序列如SEQ ID NO.5所示；同源臂片段ΔNys-R的序列如SEQID NO.6所示。

本发明中，步骤S2具体包括如下步骤：

S21、构建用于四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活质粒pJQK513；

S22、将所述质粒pJQK513通过链霉菌与大肠杆菌属间接合转移失活所述基因nysI同 框缺失突变菌株中P450单加氧酶基因tetrG；

S23、通过对步骤S22获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活突变菌株。

步骤S21中，所述四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活是通过将基 因tetrG的活性位点氨基酸Cys340突变为Ala实现的。

所述四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG序列如SEQ ID NO.15所示。

所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的EcoRI/XbaI双酶切位点间，分别***经测序正确的左右同源臂片段C340A-tetrG-L与C340A-tetrG-R；且同源臂片段C340A-tetrG-L是***EcoRI/HindIII酶切位点之间，同源臂片段C340A-tetrG-R是*** HindIII/XbaI酶切位点之间。

同源臂片段C340A-tetrG-L的序列如SEQ ID NO.10所示；同源臂片段C340A-tetrG-R 的序列如SEQ ID NO.11所示。

步骤S3中，所述发酵培养是将所述基因tetrG失活突变菌株的孢子悬浮液接种于TBSY种子培养基中，220rpm，30℃培养24h后以5％的比例转接至发酵培养基，继续以220rpm，30℃条件培养120h，得发酵培养液。

上述制备方法，所述TSBY种子培养基配方为Oxoid胰胨豆汤粉30g、蔗糖103g、Difco酵母膏5g、加蒸馏水定容至1L，pH7.2。

发酵培养基配方为玉米粉10g、可溶性淀粉20g、黄豆饼粉10g、KH₂PO₄0.2g、 NaCl3g、NH₄Cl 3g、CaCO₃ 4g、加蒸馏水定容至1L，并用1M氢氧化钠溶液调节pH 值为7.0。

步骤S3中，所述酵液萃取、菌体浸泡具体为：将所得发酵培养液离心分别收集菌体及发酵上清液；用甲醇对发酵菌体进行超声处理并充分浸泡，并用等体积的乙酸乙酯对发酵上清液进行萃取，将提取液合并后在真空旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到粗样A。

所述MCI胶柱层析分离具体为：将所述粗样A用重量比2-4倍量的甲醇少量多次进行溶解，过滤分离，然后将分离后的浓缩液上样于MCI胶柱层析，依次用体积比梯度为 0∶1、2∶8、4∶6与1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集由1∶0的甲醇水溶液洗脱得到的洗 脱液，减压浓缩，得到粗样B。

所述高效液相色谱制备分离是将所述粗样B溶于少量甲醇溶液中，经过高效液相色谱 制备分离，得到所述高效低毒四霉素B衍生物；所述高效液相色谱制备分离条件是以乙腈 与0.1％甲酸水溶液为流动相，乙腈与0.1％甲酸水溶液的比例为4∶6，以流速为5 mL/min，250mm X 10mm的BDS HYPERSIL C18反向半制备柱为固定相，紫外检测器检 测波长为304nm，每次进样量为100μl，通过确定目标峰的馏分时间，从而对样品的特定馏 分进行定向累加后蒸干。

第三方面，本发明涉及一种上述高效低毒四霉素B衍生物的产生菌株，所述菌株为刺 孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingnsis)SY04，保藏编号为 CGMCC NO18369。

第四方面，本发明涉及一种上述高效低毒四霉素B衍生物在制备抗真菌药物或食品防 腐剂中的应用。

本发明高效低毒四霉素B衍生物的应用是这样实现的：对四霉素B及其衍生物分别进行体外抗真菌活性及溶血毒性检测。其中抗真菌活性检测是以啤酒酵母与红酵母作为指示菌株，当以啤酒酵母作为指示菌株所得到的四霉素B的MIC₅₀/MIC₉₀分别为：2.74± 0.19μg/mL/6.01±0.04μg/mL，四霉素B衍生物的MIC₅₀/MIC₉₀分别为：1.89±0.11μg/mL /3.11±0.02μg/mL；当以红酵母作为指示菌株所得到的四霉素B的MIC₅₀/MIC₉₀分别为： 3.95±0.21μg/mL/8.38±0.03μg/mL，四霉素B衍生物的MIC₅₀/MIC₉₀分别为：2.26±0.14 μg/mL/5.51±0.02μg/mL。其中体外溶血毒性检测是以抗生素造成去纤维马全血中红细胞 溶解的能力表征抗生素的溶血毒性，得到的四霉素B及其衍生物的HC₅₀值分别是98.39± 6.97μg/mL与167.0±4.20μg/mL。由此可得上述四霉素B衍生物的溶血毒性相比四霉素 B降低了70％，不仅如此，其对啤酒酵母和红酵母的抗真菌活性分别提高了约1.5倍与1.8 倍。

本发明中的突变菌株SY02是刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinosus var.beijingnsis)，已经于2019年7月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为 CGMCC NO.18241。

本发明中的突变菌株SY04是刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinosus var.beijingnsis)，已经于2019年8月6日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为 CGMCC NO18369。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所述的高效低毒四霉素B衍生物结构稳定，抗真菌活性明显提高而溶血毒性明 显降低，这使得制备的高效低毒四霉素B衍生物极具临床应用前景，并且可以广泛应用于 食品防腐剂及植物杀虫剂。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的 和优点将会变得更明显：

图1为用于nysI基因同框缺失重组质粒pJQK503构建示意图；

图2为同框缺失突变菌株SY02PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；

图3为用于四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活质粒pJQK513的构建示意图；

图4为tetrG失活突变株SY04PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；

图5为四霉素B衍生物高效液相色谱HPLC紫外吸收图；

图6为四霉素B衍生物质谱检测图；

图7为菌株SY02与SY04发酵产物高效液相色谱分析图；

图8为四霉素B及其衍生物体外溶血毒性及抗真菌活性测定；其中，a为四霉素B及其衍生物对啤酒酵母体外抗真菌活性测定；b为四霉素B及其衍生物对红酵母体外抗真菌活性测定；c为四霉素B及其衍生物体外溶血毒性测定。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一 步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保 护范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条 件。

实施例1、刺孢吸水链霉菌北京变种SY02的构建

步骤1：用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒 pJQK503的构建；

如图1所示，以刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123(购买自中国普通微生物菌种保 藏管理中心)基因组总DNA为模板，分别以ΔNys-L-F/R与ΔNys-R-F/R为引物，利用高保真DNA聚合酶扩增得到用于基因缺失的左右同源臂片段，并标记为ΔNys-L与ΔNys-R(序列如SEQ ID NO.5、6所示)，其中同源臂片段ΔNys-L两端分别引入XbaI与BspTI 酶切位点，同源臂ΔNys-R两端分别引入BspTI与HindIII酶切位点，以便于质粒 pJQK503的构建。经胶回收后的左右同源臂PCR产物连接于EcoRV处理的pBluescript SK(+)载体，经过蓝白斑筛选及测序正确后，分别经XbaI/BspTI与BspTl/HindIII双酶切， 回收目标片段。回收的左右同源臂片段同时连接于经XbaI与HindIII双酶切处理的载体 pJTU1278，获得质粒pJQK503。为了验证质粒pJQK503构建的正确性，则采用 XbaI/HindIII双酶切质粒，获得大小为3.2kbp的酶切片段，说明质粒pJQK503构建正确。

步骤1中所用到的引物序列如下表1所示：

表1

引物名称	碱基序列
		ΔNys-L-F	5'-<u>TCTAGA</u>GGGTGGTGGCGAGGGAGT-3’(XbaI酶切位点)SEQ ID NO.1
ΔNys-L-R	5'-<u>CTTAAG</u>GCGGCGGGTCAGCGAGCTG-3’(BspTI酶切位点)SEQ ID NO.2
		ΔNys-R-F	5'-<u>CTTAAG</u>GTCGGCGTATTGGTTTTC-3’(BspTI酶切位点)SEQ ID NO.3
ΔNys-R-R	5'-<u>AAGCTT</u>ACCTGTTGCACGTCGTTC-3’(HindIII酶切位点)SEQ ID NO.4

步骤2：将第一步构建的质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体 菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；

将步骤1己构建完成的质粒pJQK503通过钙转化法将其导入宿主ET12567/pUZ8002中。取该转化子于含有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100 μg/mL)三种抗生素的LB培养液中37℃过夜培养，将过夜培养物按10％的比例转接至含 有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素 的LB培养液培养3小时，然后用新鲜不含抗生素的LB培养液洗涤菌体2次以充分除去 培养物中的抗生素。同时制备刺孢吸水链霉菌北京变种的新鲜孢子约10⁸个，用TES溶液 漂洗2～3次后再用0.5mLTES溶液悬浮孢子，在50℃水浴中热激10min，快速冷却至室温 后，加入等体积2×孢子预萌发培养液(配方为：Difco酵母膏1％，Difco酪蛋白氨基酸 1％，CaCl₂0.1M(需配制5M的原液，分开高温灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去) 及0.5uM氯化钙溶液，然后在37℃培养2.5小时进行孢子的预萌发过程。离心收集孢子， 并用新鲜的LB培养液漂洗孢子2次，然后将孢子重悬于适量的不含抗生素的LB培养液 中，在混合器上充分震荡并打散孢子，按照10⁷∶10⁸的供受体比与大肠杆菌细胞混合后均 匀涂布于不含有抗生素的MS平板上，待平板吹干后转移至30℃培养箱中培养17小时后 取出平板，并用含有硫链丝菌素(0.5mg)与萘啶酮酸(1mg)的1.5mL无菌水覆盖于 MS平板上，将平板吹干后转移至30℃培养箱中培养。一般4～5天后可见平板上有单菌落 结合子长出。经无抗松弛2-3轮后，收集孢子在不含有任何抗生素的MS平板上以10^-4、 10^-5、10^-6进行梯度稀释涂板，最后采用V-ΔNys-F/R为PCR引物验证结合子正确性，即 得到突变菌株SY02。

图2为同框缺失突变菌株SY02 PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，由图2可知，以野生型菌株基因组DNA为模板进行PCR验证时，条带为664bp；而以nysI基因同框缺失突变菌株 基因组DNA为模板进行PCR验证时，条带为403bp。这一实验结果证明突变菌株SY02 构建成功。

步骤2中所用到的引物序列如表2所示：

表2

引物名称	碱基序列
		V-ΔNys-F	5′-CGTTCGAACGCCTCCCAG-3′SEQ ID NO.7
V-ΔNys-R	5′-CGATTTCCCCGCCCTCAT-3′SEQ ID NO.8

实施例2、刺孢吸水链霉菌北京变种SY04的构建

步骤1：四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活质粒pJQK513的构建 如图3所示，以刺孢吸水链霉菌北京变种SY02基因组总DNA为模板，分别以C340A-tetrG-L-F/R与C340A-tetrG-R-F/R为引物，利用高保真DNA聚合酶扩增得到用于 基因突变的左右同源臂片段，并标记为C340A-tetrG-L与C340A-tetrG-R(序列如SEQ ID NO.9、10所示)，其中同源臂片段C340A-tetrG-L两端分别引入EcoRI与HindIII酶切位 点，同源臂C340A-tetrG-R两端分别引入HindIII与XbaI酶切位点，另外同源臂C340A- tetrG-L的3’端与同源臂C340A-tetrG-R的5’端所引入的HindIII酶切位点可以将基因tetrG 中第340位的半胱氨酸Cys突变为丙氨酸Ala(即tetrG定点突变C340A)，tetrG中突变 位点中引入了的限制性内切酶HindIII酶切位点便于后期突变株的验证。经胶回收后的左 右同源臂PCR产物连接于EcoRV处理的pBluescript SK(+)载体，经过蓝白斑筛选及测序 正确后，分别经EcoRI/HindIII与HindIII/XbaI双酶切，回收目标片段。回收的左右同源臂 片段同时连接于经EcoRI与XbaI双酶切处理的载体pJTU1278，获得质粒pJQK513。为了 验证质粒pJQK513构建的正确性，则采用EcoRI/XbaI双酶切质粒，获得大小为3.0-kbp的 酶切片段，说明质粒pJQK513构建正确。

步骤1中所用到的引物序列如下表3所示：

表3

引物名称	碱基序列
		C340A-tetrG-L-F	5'-<u>GAATTC</u>ACACCACGACCAGTTCGCAG-3’(EcoRI酶切位点)SEQ ID NO.11
C340A-tetrG-L-R	5'-<u>AAGCTT</u>TGGGGCAGAACCTGGTGCGG-3’(HindIII酶切位点)SEQ ID NO.12
		C340A-tetrG-R-F	5'-<u>AAGCTT</u>GGTGGATCCCGTAGCCGAAC-3’(HindIII酶切位点)SEQ ID NO.13
C340A-tetrG-R-R	5'-<u>TCTAGA</u>AGAAGTTGGCGTACAACTAC-3’(XbaI酶切位点)SEQ ID NO.14

四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG序列如SEQ ID NO.15所示：

步骤2：将步骤1构建的质粒pJQK513通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体 菌刺孢吸水链霉菌北京变种SY02中。

将第一步已构建完成的质粒pJQK513通过钙转化法将其导入宿主ET12567/pUZ8002 中。取该转化子于含有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素的LB培养液中37℃过夜培养，将过夜培养物按10％的比例转接至含 有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素 的LB培养液培养3小时，然后用新鲜的不含抗生素LB培养液洗涤菌体2次以充分除去 培养物中的抗生素。同时制备刺孢吸水链霉菌北京变种的新鲜孢子约10⁸个，用TES溶液 漂洗2～3次后再用0.5mLTES溶液悬浮孢子，在50℃水浴中热激10min，快速冷却至室温 后，加入等体积2×孢子预萌发培养液(配方为：Difco酵母膏1％，Difco酪蛋白氨基酸 1％，CaCl₂ 0.1M(需配制5M的原液，分开高温灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去) 及0.5uM氯化钙溶液，然后在37℃培养2.5小时进行孢子的预萌发过程。离心收集孢子， 并用新鲜的LB培养液漂洗孢子2次，然后将孢子重悬于适量的不含抗生素的LB培养液 中，在混合器上充分震荡并打散孢子，按照10⁷∶10⁸的供受体比与大肠杆菌细胞混合后均 匀涂布于不含有抗生素的MS平板上，待平板吹干后转移至30℃培养箱中培养17小时后 取出平板，并用含有硫链丝菌素(0.5mg)与萘啶酮酸(1mg)的1.5mL无菌水覆盖于 MS平板上，将平板吹干后转移至30℃培养箱中培养。一般4～5天后可见平板上有单菌落 结合子长出。经无抗松弛2-3轮后，收集孢子在不含任何抗生素的MS平板上以10^-4、10^-5、 10^-6进行梯度稀释涂板，最后采用V-C340A-tetrG-F/R为PCR引物验证结合子正确性。

图4为tetrG失活突变株SY04PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，由图4可得，以菌株 SY02与SY04基因组DNA为模板PCR均可以得到大小为1425bp的DNA片段，然后用 HindIII限制性内切酶对以上PCR产物进行酶切验证，发现以SY02为模板所得PCR产物 经HindIII酶切后大小无变化，而以SY04为模板所得PCR产物经HindIII酶切后得到大小 分别为1091bp与334bp的DNA片段，这一实验结果证明突变菌株SY04构建成功。

步骤2中所用到的引物序列如下表4示：

表4

引物名称	碱基序列
		V-C340A-tetrG-F	5′-GACCAGGACGAACGGAAGGT-3′SEQ ID NO.16
V-C340A-tetrG-R	5′-GTGCTGATGCTGCTGCTCAT-3′SEQ ID NO.17

实施例3、四霉素B衍生物的发酵及其制备纯化

TBSY种子培养基配方为：Oxoid胰胨豆汤粉30g、蔗糖103g、Difco酵母膏5g、加 蒸馏水定容至1L，pH7.2。

发酵培养基配方为：玉米粉10g、可溶性淀粉20g、黄豆饼粉10g、KH₂PO₄ 0.2g、 NaCl3g、NH₄Cl 3g、CaCO₃ 4g、加蒸馏水定容至1L，并用1M氢氧化钠溶液调节pH 值为7.0。

按照上述种子培养基及发酵培养基配方，分别配置400mL种子培养基及8L发酵培养 基。将配置好的种子培养基及发酵培养基按照100mL/瓶分装于500mL带弹簧的三角瓶中，121℃高压灭菌20min。待培养基冷却后，将制备好的孢子悬浮液分装于种子培养基 中，以220rpm在30℃摇床中培养24h后按照5％的比例转接于发酵培养基中，以220 rpm在30℃摇床中培养120h得到SY04突变菌株发酵培养液。将所得发酵培养液5000 rpm离心15min后分别收集菌体及发酵上清液，加入3L甲醇对发酵菌体进行充分浸泡， 并适当进行超声破碎处理；用等体积的乙酸乙酯(8L)对发酵上清液进行反复萃取(3 次)，最后将提取液合并，并在真空旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到约9g粗样A；将 所得粗样A用27mL的甲醇少量多次进行溶解，之后用棉花和漏斗对溶解后的粗样进行 过滤分离，然后将分离后的浓缩液上样于反向色谱MCI柱层析，依次用体积比为0∶1、2∶8、4∶6与1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，经高效液相色谱HPLC 检测分析，目标化合物粗样由1∶0的甲醇水溶液洗脱得到，对该梯度洗脱液进行减压浓缩， 得到约4g粗样B；将约4g粗样B溶于少量甲醇溶液中，经过高效液相色谱制备分离，以 乙腈与0.1％甲酸水溶液为流动相，乙腈与0.1％甲酸水溶液的比例为4∶6，以流速为5 mL/min，250mm×10mm的BDS HYPERSIL C18反向半制备柱为固定相，紫外检测器检 测波长为304nm，每次进样量为100μL，通过确定目标峰的馏分时间，从而对样品的特 定馏分进行定向累加后蒸干，得到目标化合物四霉素B衍生物。

图7为菌株SY02与SY04发酵产物高效液相色谱分析图，由图7可得，菌株SY02的 发酵产物中含有四霉素A/B两种组分，而菌株SY04的发酵产物中不含四霉素A/B组分， 但含四霉素B衍生物。(结构经核磁共振分析及质谱检测鉴定)

本发明高效低毒四霉素B衍生物是首次被分离并报道的，通过核磁共振分析及质谱检 测(见图5、6)确定为四霉素B衍生物，其核磁共振数据如表5所示：

表5

实施例4、体外测定四霍素B及其衍生物的抗真菌活性及溶血毒性

四霉素B及其衍生物的体外抗真菌活性测定实验中，分别选取啤酒酵母及红酵母作为 指示菌。通过测定指示菌在不同浓度抗生素下的生长情况，从而确定相应浓度抗生素抑菌 的MIC₅₀及MIC₉₀值。首先，将过夜培养的啤酒酵母与红酵母菌液按照1/100的比例转接于PDB培养基中，并用排枪按照200μL/孔分装于96孔板中，配置不同浓度的四霉素B 及其衍生物的DMSO溶液，按照每管2％(4μL)分装于含有PDB培养基和指示菌的96 孔板中，并将其置于34℃培养箱中静置培养。培养5小时后，每隔1h用酶标仪测定不同 抗生素浓度下的OD₆₆₀。根据酶标仪所得数据并结合抗生素浓度绘制抑菌曲线，并根据抑 菌曲线计算出MIC₅₀及MIC₉₀值。四霉素B及其衍生物的溶血毒性是以抗生素造成红细胞 裂解能力的强弱来衡量的。首先将去纤维马全血按照2.5％的比例稀释于无菌的PBS缓冲 溶液中，然后将100μL含有不同浓度抗生素的DMSO储存液与900μL上述2.5％的去纤维 马全血PBS缓冲液轻柔混合，并放置于37℃中水浴60min，5000rpm离心5min后，取上 清，使用酶标仪测定OD₅₄₅。其中，将100μL DMSO与900μL 2.5％去纤维马血水溶液混 合液按照上述条件所测OD₅₄₅值定义为100％溶血，将100μL DMSO与900μL 2.5％去纤 维马血PBS溶液按照上述条件所测OD₅₄₅值设定为空白对照。将上述结果对不同抗生素浓 度绘制其溶血毒性曲线，从而根据曲线计算出HC₅₀值。

上述体外抗真菌活性及溶血毒性测定均进行3组平行实验。

其中四霉素B及其衍生物体外抗真菌活性数据如表6所示：

表6

四霉素B及其衍生物溶血毒性数据如表7所示：

表7

图8a为四霉素B及其衍生物对啤酒酵母体外抗真菌活性测定；图8b为四霉素B及其衍生 物对红酵母体外抗真菌活性测定；图8c为四霉素B及其衍生物体外溶血毒性测定；由表 6、7及图8与可知，四霉素B衍生物的溶血毒性相比四霉素B降低了70％，不仅如此，其 对啤酒酵母和红酵母的抗真菌活性分别提高了约1.5倍与1.8倍。这一较好地药理学性质 使得四霉素B衍生物可作为抗真菌药物和食品防腐剂，具有良好的临床应用前景与经济价值。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定 实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本 发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用

<130> DAG41390

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列△Nys-L-F(Artificial Sequence)

<400> 1

tctagagggt ggtggcgagg gagt 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列△Nys-L-R(Artificial Sequence)

<400> 2

cttaaggcgg cgggtcagcg agctg 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列△Nys-R-F(Artificial Sequence)

<400> 3

cttaaggtcg gcgtattggt tttc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列△Nys-R-R(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttacct gttgcacgtc gttc 24

<210> 5

<211> 1511

<212> DNA

<213> 人工序列△Nys-L(Artificial Sequence)

<400> 5

tctagagggt ggtggcgagg gagtgggcga cgtcgagcag gtcggcgtgc ggggcgtcgt 60

cgagggcggc gcgcagggcc gcggcctggc cgcgcagggc gtcgggggtg cggccggaga 120

gcaggaccgg gacggtgccc ggcgtcacgg gggcggtggt cggcgtggtg tcggtgccgg 180

ccggggcgtg gggcgtcccg ggctcctcgg gcggtgcctc gggggcctgc tcgatgatgg 240

tgtgggcgtt ggtgccgctg atgccgaagg aggagacggc ggcgcggcgc ggggcgccgg 300

tggcgggcca gtcggtgggg tcggtgagca ggcgcaccgc gccctgcgac cagtcgacgt 360

gccgggtggg ttcctcggcg tgcagggtgc ggggcagcac gccgtgccgc atcgccagca 420

ccatcttgat gacgccggcg acgccggcgg cggcctgggt gtggctgagg ttggacttga 480

ccgagccgag cagcagcggc cggtccgcgg ggcggttctg gccgtaggtg gcgagcagtg 540

cctgggcctc gacggggtcg cccagggtgg tgccggtgcc gtgtgcctcg acgacgtcga 600

cgtccccggc ggtcagtcgg gcgttgacca gggcctgttg gatgacctgc tgctgggagg 660

ggccgttggg ggcggtcagg ccgttggagg cgccgtcctg gttgacggcg gtgccgcgga 720

cgacggcgag gacctcgtgg ccgttgcgga cggcgtcgga gaggcgttcc aggacgagga 780

tgccgacgcc ctcggcccag ccggtgccgt cggcggtgtc gccgaaggag cggcagcgac 840

cgtccgcgga cagtccgccc tggcggccca tctcgatgaa ggtgccgggg ccggacatga 900

tggtgacgcc gccggccagg gcgagggtgc actcgccggc ccgcagtgcc tgggtggcca 960

ggtggacggc gacgagcgag gaggagcagg cggtgtcgac ggtgacggcg gggccgaccg 1020

tgccgaaggt gtaggagatg cggccggaca gcacgctgcc ggtgttgccg gtgagttgga 1080

agccctcggc gccgtcggcg gggccgaccc ggtagtcctg cgccatggcg ccgatgaaga 1140

cgccggtgcg gctgcccttc acggacgtcg ggtcgatgcc ggcgcgttcg aacgcctccc 1200

aggcggattc caggacgacg cgctgctgcg ggtccatggc gaccgcctcg cgcggcgaga 1260

tgccgaagaa ctccgcgtcg aagtcggggg cgtcgtgcag gaatccgccg gctgcggtcg 1320

gtgcggtggc gagtgcctcc aggtcccagc cgcggtcggt ggggaacggg ctgacgccgt 1380

gttcgccggc cgcgaccagt cgccagaggt cttcggggct gcggacgcct ccggggtagc 1440

ggcaggtcat gccgatgatg gccaccggtt cctgggccgc cgattccagc tcgctgaccc 1500

gccgccttaa g 1511

<210> 6

<211> 1698

<212> DNA

<213> 人工序列Nys-R(Artificial Sequence)

<400> 6

cttaaggtcg gcgtattggt tttcgcggga aacctgcgcc aggtcggaat cgaccatcat 60

gcgcatgagg gcggggaaat cgacgtccgg tttccagccg aggcggtcgc gggccttggc 120

gctgtcggcg cacagcacct cgacctcggc gggccgcacc aggtcggggt cgatgacgac 180

gtggtcctgc cagttcaggc cgacgtgttc gaaggcgagc cggaccgcgt cgcgcaccga 240

gtgcatctgg ccggtgccga tgacgtagtc gtcgccggcg tcctgctgga gcatcaggtg 300

catggcgcgg acgtagtcgc cggcgtagcc ccagtcgcgg accgcgtcga ggttgcccag 360

ggagagcttg tcctggaggc cgtgcttgat gcgggcgacc gcgagggaga tcttgcgggt 420

gacgaactcc tggccgcggc gcggggactc gtggttgaag agcatcccgg agaccgcgta 480

catgccgaag gactcgcggt agttgcgggt gatgtagtgg ccgtacgcct tggccgcgcc 540

gtacgggctg cgcggatgga agagcgtggt ctcgcgctgc ggggtctccg ccgccttgcc 600

gaacatctcc gaggaggacg cctggtagaa gcggatctga ccgcgcgggt tggcggtgcg 660

ggaggtggac aggccgctga ccatgcggat ggcctccagc atccgcagca cgcccatgcc 720

gttgacctcg gtgacgagtt ccgcctgctg ccaggacatc gggacgaacg agatcgcgcc 780

gaggttgtag acctcgtcgg gctgcacgcc gtcgaccgcg gagaccaggc tcccctggtc 840

catcaggtcg ccgtcgatga agttcagttc ggtggcgagc cggctgacgc gggacttgcg 900

ggggttcgcc tggccgcgga tcagacccca cacctggtag ccccgcgaca gcaggtgctc 960

cgcgagatag gagccgtcct ggccggtgat tccggtgatc agcgctcgtt tggacatggc 1020

caacccttct cgatcacgaa agagaccgtc caaaccctgg agctcggcca cgacctggcg 1080

tcgaatacgc agtccggacg atagataccg gcacgctcgc aagccgcgga agacgctgtc 1140

aacgcatccc ggagttttta gggaattccc gagttccgga ccgtcaggag tgcgccgtcg 1200

tcgccaacac tagtgagatt tcggtgcgga atgcggtgca atgacgtggg tcggcggaac 1260

ggccgaccgc gtccaccacc gagcggcccg gcgccgccgt caaccggggt gttcctccgt 1320

gctgctgaga ctcctgcggg cgcagttgcg cccctacgcg ggggccacct ccgccctcgt 1380

cgccctccaa ctcgtccaga tcctcggcac gttgctgctg ccgacgctgg gtgccgcgct 1440

catcgaccag ggcgtggtgc gcgccgaccg cgatcgggtg gccgagctgg gggcggtgat 1500

ggtggcggtg gccgtggtgc agatcgcggc ggcgctcggg gcggcggcgt tggcggcgcg 1560

gacctcgacg gcgatgggcc gcgacctgcg gtccgcggtg ttccgccgca tcctggactt 1620

ctccgcccgc gaggtcgggc ggttcggcac gccgtcgctg ctcacccgtg ccgtgaacga 1680

cgtgcaacag gtaagctt 1698

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列V-△Nys-F(Artificial Sequence)

<400> 7

cgttcgaacg cctcccag 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列V-△Nys-R(Artificial Sequence)

<400> 8

cgatttcccc gccctcat 18

<210> 9

<211> 1526

<212> DNA

<213> 人工序列C340A-tetrG-L(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattcacac cacgaccagt tcgcaggcga gcgccgcccg cacccgctcg gcgagcgcgg 60

gcgcgaccgc ggcgcccgcc gtccgcacct ggtggggggc gaaccccgcc gacccctccg 120

acgactccaa ccggcccatg acgtcccaca gttgcgtggg gacggcgaag acgacgcgcg 180

ggtcgtgctc ccgggccagg gcgaggaaac ggtccgcgtc ccagtcggtg agcacgacct 240

ggcggcaggc ggtggacagc gccgcgtgca cggcctggag gccgaacaga tgggtcatcg 300

ggcaggccgt gaggaccgtg cccgcgaagg cgtcggcggc ctcggcggtc acggccgcgg 360

tgttcgacag caggccgtcg tggctgtgca gacacagcct gggccgcggt gaggccgtcc 420

cggacgacgg gaccaggacg aacggaaggt cgggggtgac ctccaccggc cggggcccgc 480

tgcccgccca ggccgccagc agcccgtcca acgaaccgat ccccggctcc gcaccgccgg 540

tcgccggccc gccggccagc aacaccccgc gcagcgacgg cacgccgtcc aacagcgcac 600

gggccgtcgc cggatcctcg ccctcggcgc ccgacaggac gaggaggacg ggctccgcgc 660

ggtccagcag tgcgcgcacc tcgcccaccg cggtgccctg gtgcaggggc agcagcaccg 720

ccccgacggc cgcgaccgcc aggtgcaggg tctgcaactc ccagctgttc ggcagccgca 780

ccgccaccac gtcgccgggc gcgacgtgcg actcctggag gccgcgggcc agcgcgtcga 840

cgtccgcccg ccactcggcc cacgtccacg agcggtcccc gtcgacgagg gccaccgcat 900

cgggcgcgga cgccacggcg gacgcgaaca cctcggggag cgtgcggccc cccggtgtgc 960

cggtgccgtc ggacggcggg tcgatcacat agtcatcggt gtggacgggc accatcactc 1020

ccggatgtcg agcgcttgcg tcggttgggg ggatccggca ggtggatcgc ccggtgcggg 1080

cgtcagccct cgtgtgcggt gatcgccccg gaggggcaca gcgccgccgc gatgcggacc 1140

ttggccgcct cgtcggggcc gggcgcggcg agcagggtga cgatcccgtc ctcgtcctgg 1200

tcgaagacct gtggcgcgga cagcacgcac tggccggcgc ccacgcagcg ctccgaatcg 1260

atggtgatac gcatgccgat gtctctcctg caaggggatc ggggtccacc ggcggctact 1320

ggcgcaccgg gcggacggga ctggccttcc gctggcggga cggtgcctac cagcggacgg 1380

gaagctgctc caggccgtag agcacgccgt cgtacttgat gctcaaaccc tcatcgggaa 1440

cggcgagttg gatgtcggga atgcgctcga agagcttgcg gtaggcgatc tccatctcga 1500

cccgcaccag gttctgcccc aaagct 1526

<210> 10

<211> 1477

<212> DNA

<213> 人工序列C340A-tetrG-R(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcttggtg gatcccgtag ccgaacgcca cgtgatgacg ggcgctccgg gaggggtcga 60

acatgtgcgg gcactcgaag gcgctcgtgt cgtggttggc cgcggcgatc aacggcacga 120

tgccgtcgcc cgccttgatg agctgcccgc cgatctcgac gtcctcgacg gccacccgca 180

gggacacgat gtcggcgacc gagtggaagc gcagggtctc ctccaccgcc cggtcgtcac 240

cgatccactg ggggttccgc agcagcgtga cgacgcccag cgcgatgttg ttggccgtgg 300

tctcgtggcc ggcgatgagc agcagcatca gcacgcccga cagctcgtgc ggtgcgatcg 360

aaccggcggc cagcagccgg ctgatgaggt cgtcgccggg ccacttcgcc ttgatgccca 420

ccagccgctt gatgtagcgc agcagctcct tgacggcggt ctcgcgctgc gcgtcggtcg 480

aggcgcggag cgagaccagg gtgcgggtcc gggactcgaa gaagtcgcgg tcggagggcg 540

gcacgccgag cagtgtcgag atcaccaggg acggcacggg cagtgcgtag tccgcgacga 600

ggtcggcgga gttgcccgcg gccagcatcg cgtcgaggcg ctcctccacc gtgcgctcga 660

tcgccgggcg caacccccgg atgcgccgca cggtgaattc ggggatgagg gccttgcgga 720

accggtcgtg ttcgggggag tccaacccca cgaaccagcc ggggatctgc tcctgcgtgg 780

gcacgcccac cgtcccgacg ttggggaagc ccttgtgcga ggggttggag ctgatcctgg 840

agtcggtcag cacggcgcgc acgtcctcgt gccgggtgac cagccacgcc cgggcgccgt 900

tgggcaggcg cgagaggacc agcccctcgt ggtcgcggta cccgtcgtag tcgggcggcg 960

ggaagggcac gccgggtttg cgggtgggga agtccaccac caccgggtcc gagtgcgtca 1020

tgaacggaat ttcctctctc cgacggggtc gatcaacgga cgccgtagaa ggcccggatc 1080

ttgctgacga tgaagtcctg gtcggcgggg gacaggtcgg tgtgcgtggg caggtagagc 1140

ccgtcctcgg cgaactcgct ggccttgagc gacggccagt cggggtcgaa gtacatgggc 1200

tgccggctca tcggcttgaa gaagagccgg gtctcgatgg agtggtcggc caggaacgcc 1260

tggagctccg cccggcgttc cgcccggagg tcgtacatcc acagcacgtc ccgcgggggc 1320

atcagcgtga tgccggggac gtcggccagc ccctcgtcgt agtgcttctc gatcctgcgg 1380

cgcacttcga ggatctcgtc gaggcgttcg gtctgcgcca gggccacggc ggcctgcatg 1440

gccgtgatgc ggtagttgta cgccaacttc ttctaga 1477

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列C340A-tetrG-L-F(Artificial Sequence)

<400> 11

gaattcacac cacgaccagt tcgcag 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列C340A-tetrG-L-R(Artificial Sequence)

<400> 12

aagctttggg gcagaacctg gtgcgg 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列C340A-tetrG-R-F(Artificial Sequence)

<400> 13

aagcttggtg gatcccgtag ccgaac 26

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列C340A-tetrG-R-R(Artificial Sequence)

<400> 14

tctagaagaa gttggcgtac aactac 26

<210> 15

<211> 1176

<212> DNA

<213> 刺孢吸水链霉菌北京变种tetrG基因(Streptomyces hygrospinosusvar.beijingensis tetrG)

<400> 15

atgacgcact cggacccggt ggtggtggac ttccccaccc gcaaacccgg cgtgcccttc 60

ccgccgcccg actacgacgg gtaccgcgac cacgaggggc tggtcctctc gcgcctgccc 120

aacggcgccc gggcgtggct ggtcacccgg cacgaggacg tgcgcgccgt gctgaccgac 180

tccaggatca gctccaaccc ctcgcacaag ggcttcccca acgtcgggac ggtgggcgtg 240

cccacgcagg agcagatccc cggctggttc gtggggttgg actcccccga acacgaccgg 300

ttccgcaagg ccctcatccc cgaattcacc gtgcggcgca tccgggggtt gcgcccggcg 360

atcgagcgca cggtggagga gcgcctcgac gcgatgctgg ccgcgggcaa ctccgccgac 420

ctcgtcgcgg actacgcact gcccgtgccg tccctggtga tctcgacact gctcggcgtg 480

ccgccctccg accgcgactt cttcgagtcc cggacccgca ccctggtctc gctccgcgcc 540

tcgaccgacg cgcagcgcga gaccgccgtc aaggagctgc tgcgctacat caagcggctg 600

gtgggcatca aggcgaagtg gcccggcgac gacctcatca gccggctgct ggccgccggt 660

tcgatcgcac cgcacgagct gtcgggcgtg ctgatgctgc tgctcatcgc cggccacgag 720

accacggcca acaacatcgc gctgggcgtc gtcacgctgc tgcggaaccc ccagtggatc 780

ggtgacgacc gggcggtgga ggagaccctg cgcttccact cggtcgccga catcgtgtcc 840

ctgcgggtgg ccgtcgagga cgtcgagatc ggcgggcagc tcatcaaggc gggcgacggc 900

atcgtgccgt tgatcgccgc ggccaaccac gacacgagcg ccttcgagtg cccgcacatg 960

ttcgacccct cccggagcgc ccgtcatcac gtggcgttcg gctacgggat ccaccagtgc 1020

ctggggcaga acctggtgcg ggtcgagatg gagatcgcct accgcaagct cttcgagcgc 1080

attcccgaca tccaactcgc cgttcccgat gagggtttga gcatcaagta cgacggcgtg 1140

ctctacggcc tggagcagct tcccgtccgc tggtag 1176

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列V-C340A-tetrG-F(Artificial Sequence)

<400> 16

gaccaggacg aacggaaggt 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列V-C340A-tetrG-R(Artificial Sequence)

<400> 17

gtgctgatgc tgctgctcat 20