阅读说明：本技术 特异性识别md-2的紫杉醇结合域的dna适配子及其应用 (DNA aptamer for specifically recognizing MD-2 paclitaxel binding domain and application thereof ) 是由 徐发良 郑晓东 李卫 蒋又新 魏珂 于 2019-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了特异性识别MD-2的紫杉醇结合域的DNA适配子及其应用。为解决现有技术中存在的问题,本发明确定一种紫杉醇结合域,即髓样分化蛋白-2(myeloid differential protein,MD-2)中的一段特殊氨基酸序列。通过人工合成的模板肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。上述SEQ ID NO.1作为提高紫杉醇抗肿瘤敏感性的靶点。通过实验证明,本发明中的适配子具有潜在的促进紫杉醇导致乳腺癌细胞生长抑制的抗癌作用,得到的适配子在药物中得到应用后,可有效的增强紫杉醇敏感性的潜在作用。(The invention discloses a DNA aptamer specifically recognizing a paclitaxel binding domain of MD-2 and application thereof. In order to solve the problems in the prior art, the invention determines a paclitaxel binding domain, namely a section of special amino acid sequence in myeloid differentiation protein-2 (MD-2). The amino acid sequence of the artificially synthesized template peptide is SEQ ID NO. 1. The SEQ ID NO.1 is used as a target for improving the antitumor sensitivity of the paclitaxel. Experiments prove that the aptamer has a potential anticancer effect of promoting growth inhibition of breast cancer cells caused by paclitaxel, and the potential effect of effectively enhancing paclitaxel sensitivity can be achieved after the obtained aptamer is applied to a medicament.)

特异性识别MD-2的紫杉醇结合域的DNA适配子及其应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体是靶向识别MD-2蛋白的试剂在 制备提高抗肿瘤药物敏感性的制剂中应用。

背景技术

美国的“国家癌症研究中心”从太平洋紫衫的树皮中萃取出紫杉 醇，发现它具有抗癌效果，经过一连串的临床试验，已经制成制剂用 来治疗卵巢癌与乳癌，且治疗效果甚佳。

据来自美国的最新统计数字，2006年，包括天然原料加工的紫 杉醇注射剂和半合成紫杉醇注射剂在内的紫杉醇制剂的国际市场总 销售额已达37亿美元，高居世界抗癌药物之首。

至今为止，紫杉醇在世界各国均为医院首选的抗肿瘤药物。近几 年来世界各国的肿瘤发病率比10年前已提高近一倍，肺癌、乳腺癌 和卵巢癌等恶性肿瘤也呈多发趋势，这些癌症病人均为紫杉醇的主要 使用者。从总体上看，在没有一种植物抗癌新药能取代其位置之前， 紫杉醇的销量只会上升，不会下降。

紫杉醇在肿瘤化疗中具有重要作用，但紫杉醇耐药会导致化疗失 败、肿瘤进展。紫杉醇耐药性造成的极大后果成为了一个癌症治疗的 极大的难题，而此问题至今为止尚未解决。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，公开以下技术方案：

确定一种紫杉醇结合域，即髓样分化蛋白-2(myeloid differential protein,MD-2)中的一段特殊氨基酸序列。通过人工 合成的模板肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

上述SEQ ID NO.1作为提高紫杉醇抗肿瘤敏感性的靶点。

以SEQ ID NO.1序列为模板，获取多种DNA适配子。获取方法可 以采用现有的SELEX技术。其中的三种适配子核酸序列为核酸序列为 SEQ ID NO.2(M-42)、SEQ ID NO.3(M-427)、SEQ ID NO.4(M-430)。

上述适配子可以应用于在药物的制备。所述药物是提高紫杉醇抗 肿瘤敏感性、延缓或逆转紫杉醇耐药的药物(增敏剂)。

本发明的技术效果是毋庸置疑的，本发明具有以下优点：通过实 验证明，本发明中的适配子具有潜在的促进紫杉醇导致乳腺癌细胞生 长抑制的抗癌作用，得到的适配子在药物中得到应用后，可有效的增 强紫杉醇敏感性的潜在作用。

附图说明

图1.倍比稀释的适配子与模板肽的结合(荧光比色)

图2.适配子与乳腺癌细胞的结合情况(激光共聚焦)

图3.倍比稀释的适配子联合紫杉醇对乳腺癌细胞生长抑制的影 响(MTT)

图4.倍比稀释的适配子M42联合紫杉醇对乳腺癌细胞生长抑制 的影响(MTT)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本 发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想 的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变 更，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1：

适配子与MD-2模板肽结合实验

选择编号为SEQ ID NO.M42、SEQ ID NO.M427、SEQ ID NO.M430 的3个适配子进行荧光比色实验，观察它们对MD-2模板肽的识别和 结合力(见图1)。

对照组(control group)采用的是与胃癌细胞结合的一个DNA适配 子，其结构模式与实验组M-42、M-427、M-430相似，编号为SEQ ID NO.5(GCA5)。

5'-ATACCAGCTTATTCAATTGCACCCATAACAAGGCACACGTGGAAGGTCTTTTG TACTTCTTTTCAAATGGAGATAGTAAGTGCAATCT-3‘’

将MD-2模板肽配制成20ug/ml溶液，包被于96孔板(为避免可 见光的影响，采用黑色96孔板)；再以FITC标记的适配子与之结合、 PBS洗涤；送至荧光酶标仪上度数，根据荧光强度判断适配子对MD-2 模板肽的识别与结合能力。

图1显示，M427对靶标肽的结合力可能较其他几个适配子高。

需要注意的是，需用黑色酶标板(不透光)进行荧光比色，实验 结果与预期情况相符。

实施例2：

适配子与乳腺癌细胞的MD-2结合实验

乳腺癌细胞6孔板培养爬片至细胞融合度为80％，4％多聚甲醛室 温固定10min、PBS漂洗，0.2％Triton X-100通透15min，PBS漂洗；

100nmol浓度的FITC标记的适配子在4℃避光孵育1h，洗去未结 合的适配子、DAPI复染5min，及时送激光共聚焦显微镜检、留图。

对照组(control group)采用的是与胃癌细胞结合的一个DNA适配 子，其结构模式与实验组M-42、M-427、M-430相似，编号为SEQ ID NO.GCA5。

激光共聚焦显微分析结果显示，本项目获得的适配子M42、M427 和M430均能结合表达MD-2的乳腺癌细胞(图2)，结合部位主要在 细胞表面(详见图2 200X)。提示适配子能结合活细胞MD-2，其中 M427对乳腺癌细胞的结合可能更明显。

实施例3：

适配子对乳腺癌细胞紫杉醇药物效应的影响

选择适配子M42、M427和M430进行生长抑制实验(MTT法)。乳 腺癌细胞分为紫杉醇作用组(T)、紫杉醇+对照核酸组(T+Control)、 紫杉醇+适配子组。

对照核酸组(T+Control)采用的是与胃癌细胞结合的一个DNA适 配子，其结构模式与实验组M-42、M-427、M-430相似，编号为SEQ ID NO.GCA5

乳腺癌细胞培养至70％融合，加入经0.22um滤器过滤除菌的适 配子及对照核酸；待细胞融合度为80％时加入倍比稀释的紫杉醇。继 续培养24、36、48h，吸去上清后加入新鲜培养液(90ul)及MTT溶 液(10ul)，继续培养4h；洗掉上清、加入110ul DMSO，低速振荡10min使结晶物充分溶解。

测定490nm处各孔吸光度。采用MTT实验数据，计算并比较相 应组别的半数抑制浓度IC50。

结果表明(T+M42)对乳腺癌细胞的生长抑制作用较单用T的时候 更强。这提示，M42具有增加紫杉醇药物敏感性的潜在作用(图3、 图4)。

采用MTT实验数据，用SPSS19.0计算各处理组的紫杉醇IC50(见 表1)，结果表明T+M42组IC50最低，提示编号为M42的适配子具有 促进紫杉醇药效的潜在作用。

表1.DNA适配子对紫杉醇(T)IC50的影响(乳腺癌细胞)

<110>重庆市肿瘤研究所

<120>特异性识别MD-2的紫杉醇结合域的DNA适配子及其应用

<160>5

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列(ordo artificialis)

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<211>86

<212>DNA

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