阅读说明：本技术 一种提高酵母mRNA表达效率的方法 (Method for improving expression efficiency of yeast mRNA ) 是由 王海勇 杨柳 谭永水 刘新利 于 2018-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种提高酵母mRNA表达效率的方法,所述方法利用定向进化手段获得核糖体蛋白合成步骤中关键因子RLI1突变体,对野生型RLI1基因进行相同修饰,加速核糖体再利用速率,进而增加了异源蛋白表达效率。本发明针对酵母表达酶制剂或重组蛋白时,异源mRNA含量受胞内游离核糖体浓度限制而开发,本方法可显著提高酵母宿主的异源表达水平。(The invention relates to a method for improving yeast mRNA expression efficiency, which utilizes a directional evolution means to obtain a key factor RLI1 mutant in a ribosomal protein synthesis step, and modifies a wild RLI1 gene in the same way to accelerate the ribosome reuse rate and further increase the heterologous protein expression efficiency. The invention is developed aiming at that when yeast expresses enzyme preparation or recombinant protein, the content of heterologous mRNA is limited by the concentration of intracellular free ribosomes, and the method can obviously improve the heterologous expression level of a yeast host.)

一种提高酵母mRNA表达效率的方法

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及提高酵母酶制剂或重组蛋白的表达效率，尤其是一种涉及核糖体蛋白合成过程的关键因子编码基因RLI1的修饰而提高酵母mRNA表达效率的方法，特别是一种提高酵母mRNA表达效率的方法。

背景技术

随着后基因组时代的到来，重组蛋白的异源表达备受关注。国内外关于提高真核细胞异源表达效率的研究报导很多。总体策略上可以概括为以下几个方面：

1、增加基因的拷贝数

通过运用高拷贝数质粒或直接在基因组上增加基因的拷贝数进行异源基因的克隆表达，如利用pYES2载体及pPIC9k载体高整合拷贝数工程菌筛选等；

2、将异源基因置于强启动子控制下，带来高峰度的mRNA，进而为翻译提供足量的模板，提高异源基因的表达水平，如GAL1、PGK1及AOX1等启动子的应用；

3、优化异源基因的编码序列，使其与宿主的密码子使用偏好一致，如通过；

4、改变mRNA非编码区的序列，使其更适合宿主翻译系统；

5、与宿主内源性肽段进行融合或共表达，增加异源基因表达水平，如与分子伴侣共表达提高蛋白折叠效率，进而提高表达水平；

6、对宿主信号转导途径进行调控，如对未折叠蛋白质反应信号通路进行改造等；

7、对分泌及降解途径进行工程改造，主要针对酿酒酵母种分泌特性较差的宿主。

但无论是那种策略，在宿主细胞内大量合成某种蛋白质的时候，mRNA代谢活跃，总含量到达远高于一般生理水平的高峰值，尤其是异源mRNA的丰度都将超过总mRNA的50％以上。

mRNA介导的蛋白质合成机器就是核糖体。一段mRNA翻译周期包括起始、延伸、终止及核糖体再循环四个基本步骤。进化的经济性原则导致核糖体维持在适应一般生理水平的浓度，而通过四步循环利用的方式节约资源供应。核糖体不同阶段需要有不同因子参与其动作功能的实现。因核糖体机器的复杂性，各阶段的具体机制研究一直在持续。目前，已有众多结构生物学及分子生物学证据表明，真核细胞中ABCE1(或Rli1)参与了包括蛋白合成的起始、终止及核糖体再循环等重要阶段。在不同阶段，ABCE1通过与不同其他因子互作、构象变化，推动某一相应过程的进行。

酵母中ABCE1同系物Rli1(RNase L inhibitor 1)由RLI1基因编码，具有两个核酸结合结构域(NBDs)及N端铁硫簇结构域(FeS)。免疫共沉淀及删除研究表明，Rli1通过与多个因子互作参与起始复合体的形成，并Dom34一道在核糖体熄火拯救中也起类似核糖体翻译终止及再循环的作用。当前，对Rli1NBDs如协作与ATP的结合、ATP水解以参与终止、再循环及再起始等过程的精细机制仍旧未知，这也是对Rli1进行人工进化的一个出发点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有策略的不足之处，提供一种提高酵母核mRNA翻译效率的方法，该方法提高了核糖体循环利用，缓解了过表达异源基因时导致的宿主内自由核糖体浓度受限问题；同时，考虑到Rli1所属ABCE1内各同系物在真核生物中进化相当保守，核糖体工作机制类似，因此，本发明提供的方法也适用于其他真核表达系统。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种提高酵母mRNA表达效率的方法，所述方法分子定向进化手段，在活体内通过对核糖体翻译基本过程关键基因RLI1进行修饰，加速核糖体再利用，提高细胞内mRNA表达效率。

而且，具体步骤如下：

(1)构建RLI1表达盒将GAL1启动子、RLI1基因的开放阅读框及CYC1终止子串联序列(SEQ1)克隆在YCplac111质粒的多克隆位点；

(2)利用易错PCR方法构建RLI1随机突变文库；

(3)将增强型绿色荧光蛋白编码基因克隆在pYD1载体上，构建建立由流式细胞术和酵母细胞表面展示技术为核心的筛选技术；

(4)通过文库筛选，获得可加速核糖体再循环的RLI1突变体；

(5)用此突变体置换酵母染色体基因组上的野生型拷贝，获得基因修饰酵母菌株。

而且，RLI1突变体编码的肽链中氨基酸序列与SEQ2同源性至少在70％以上。

而且，所述酵母包括酿酒酵母、毕赤酵母，但不限于此两种酵母。

本发明取得的创新及优点：

1、针对核糖体工作过程相关重要因子进行酵母宿主的基因修饰。与以往公开的提高mRNA表达效率的研究方法策略不同，本发明基于酵母进行异源过表达时mRNA相对于可利用的核糖体而言严重过剩，即游离核糖体浓度处于限制状态的压力基本事实，RLI1基因产物既促进核糖体的生成，也是核糖体蛋白质合成起始、终止及再循环的必需因子。对其进行修饰可同时调节众多蛋白质合成过程。通过有针对性地对核糖体工作重要因子Rli1进行改造，加速了核糖体再利用速率，缓解上述压力。

2、通过文库筛选获得提升核糖体再循环速率的RLI1突变体，相当于机器效率的增加，不会带来简单的RLI1基因过表达为宿主代谢增加负担。

3、因真核生物Rli1进化上的保守性强，核糖体再循环机制类似，因此，这种提高mRNA翻译效率的方法适用性好，可拓展至丝状真菌、哺乳动物细胞等真核宿主。

4、本发明方法利用定向进化手段获得核糖体蛋白合成步骤中关键因子RLI1突变体，对野生型RLI1基因进行相同修饰，加速核糖体再利用速率，进而增加了异源蛋白表达效率。本发明针对酵母表达酶制剂或重组蛋白时，异源mRNA含量受胞内游离核糖体浓度限制而开发，本方法可显著提高酵母宿主的异源表达水平。

附图说明

图1为本发明中涉及的表达载体示意图；

图2为本发明方法的操作流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是作为实例进行的描述，并非本发明的限定使用实施范围，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

一种提酵母mRNA表达效率的方法，所述方法利用酵母细胞表面展示技术配合流式细胞术，通过文库筛选获得提高核糖体再循环速率的RLI1突变体，用这个突变体置换酵母基因组上相应的野生型基因。

具体步骤如下：

(1)构建RLI1表达盒将GAL1启动子、RLI1基因的开放阅读框及CYC1终止子串联序列克隆在YCplac111质粒合适位点；

(2)利用易错PCR方法构建RLI1随机突变文库；

(3)将增强型绿色荧光蛋白作为报告基因克隆在pYD1载体上，构建建立由流式细胞术和酵母细胞表面展示技术为核心的筛选技术；

(4)通过文库筛选，获得可加速核糖体再循环的RLI1突变体；

(5)用此突变体置换酵母染色体基因组上的野生型拷贝，获得RLI1基因修饰酵母菌株；

(6)利用上述RLI1基因修饰酵母菌株表达异源蛋白，获得较野生型宿主更高的表达效率。

实施例2

RLI1突变文库制备及RLI1突变体获得，步骤如下：

1、合成GAL1启动子、RLI1开放阅读框及CYC1终止子串联序列(SEQ1)；

2、将上述序列克隆到低拷贝载体YCplac111(GenBank:X75457.1)的HindIII/EcoRI位点，得到质粒YCplac111-RLI1；

3、以YCplac111-RLI1为模板，以RLI1-F/RLI1-R引物对引导，进行易错PCR，并将此易错PCR产物经PstI/BamHI酶切后纯化DNA片段，与YCplac111-RLI1经PstI/BamHI所得DNA大片段做链接，转化大肠杆菌的超级感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素钠的LB固体培养基，于37℃倒置培养18小时，藏于4℃，获得RLI1随机突变文库C；

同时，

4、将eGFP(增强型绿色荧光蛋白基因)克隆于pYD1的BamHI/EcoRI位点，得到pYD1-eGFP；

5、将上述构建好pYD1-eGFP质粒通过热激(击)法转化酿酒酵母EBY100(酿酒酵母EBY100(MATa GAL1-AGA1::URA3ura3-52trp1leu2Δ1his3Δ200pep4::HIS2prb1Δ1.6Rcan1GAL，Invitrogen)细胞，得到EBY100-e；

6、将文库C用液体LB培养基冲洗、收集洗脱液，过夜震荡培养；

7、从培养物中提取质粒，将此质粒电击转化EBY100-e感受态细胞，得到EBY100-e-C酵母文库；

8、将上述酵母文库培养于以半乳糖为唯一碳源的省却亮氨酸及色氨酸的液体完全极限培养基中，诱导18～24小时；

9、经流式细胞仪获得荧光密度较高的重组酵母菌，记作EBY100-e-C-R；

10、在葡萄糖为唯一碳源的省却亮氨酸及色氨酸液体完全极限培养基中培养EBY100-e-C-R；

11、提取质粒；

12、获得RLI1突变体，测序获得RLI1突变信息；

实施例3酿酒酵母基因组上RLI1的修饰

本发明中涉及的表达载体示意图如图1所示，本发明方法的操作流程图如图2所示。

核酸序列SEQ1:

acggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaaccctgcagatgagtgataaaaacagtcgtatcgctatcgttagcgctgataaatgtaaaccaaaaaagtgtcgtcaagagtgtaaacgttcgtgtcccgttgtgaaaactggtaaattatgtattgaagtcactccaacttcaaaaatcgcattcatttccgaaatcttgtgtattggttgtggtatttgcgttaagaaatgtccatttgatgctattcaaattatcaatttgccaactaatttagaagcccatgtaactcaccgttactctgccaatagtttcaaactgcacagattgccaacaccaagaccgggtcaagtccttggtttagtcggtaccaacggtattggtaagtctaccgccttgaaaatcttagccggtaaacaaaaacctaatttaggtcgttttgatgatcctcctgaatggcaggaaattattaaatatttccgtggttctgaattacaaaattacttcaccaagatgctggaagatgatatcaaggctataatcaaacctcaatatgttgataacattcctcgtgctattaaaggtccggttcaaaaagttggcgaacttttgaaattgagaatggaaaaaagtcctgaagatgtgaaacgctacatcaaaattttacagttggaaaacgttttgaaaagagatattgaaaagttatctggtggtgaactgcaaagatttgccattggtatgtcatgtgttcaagaggctgatgtttatatgttcgatgaaccttcatcttatttggatgttaagcaacgtttgaatgccgctcaaattattagatctttactagctccaactaaatacgttatttgtgttgagcacgatttgtcagttttggattatctttccgatttcgtttgtatcatatatggtgttccatctgtttacggtgttgttacattaccagcctctgtcagagaaggtatcaacatattcttggacggtcatattcctgctgaaaacctgagattcagaactgaggctttacaatttagaatagctgatgctaccgaagacttgcagaatgactctgctagtcgcgccttctcttacccaagtttgaagaaaactcaaggtgattttgttttgaatgttgaagaaggtgagttctccgattccgaaatccttgttatgatgggtgaaaacggtaccggtaagaccactttgatcaaattactagctggtgctttgaagccagatgaaggacaagatattccaaaattgaatgtttctatgaaaccacaaaaaattgcaccaaagttcccaggtactgtcagacaattgtttttcaagaaaattagaggacaattcctaaatccacagtttcagactgatgtcgttaaacctttaaggattgacgatattattgatcaagaagtccaacatttgtctggtggtgaattacaaagagtcgccatcgtcttggcattgggtatcccagcagacatatacttgattgatgagccatctgcctacttagattccgaacaacgtattatctgttctaaagttatcagaagattcatcttacataataagaaaactgcgtttattgtcgagcacgatttcatcatggctacttatcttgctgataaggtcattgtttttgaaggtattccttccaagaatgctcacgcaagagcccctgaatctttgttgactggttgtaacagatttttgaagaatttgaatgtcaccttcagaagggacccaaactccttcagaccaagaattaataagctagattcccaaatggataaagaacaaaaatcatcaggaaactactttttcttggataacaccggtatttaa

氨基酸序列SEQ2:

MSDKNSRIAIVSADKCKPKKCRQECKRSCPVVKTGKLCIEVTPTSKIAFISEILCIGCGICVKKCPFDAIQIINLPTNLEAHVTHRYSANSFKLHRLPTPRPGQVLGLVGTNGIGKSTALKILAGKQKPNLGRFDDPPEWQEIIKYFRGSELQNYFTKMLEDDIKAIIKPQYVDNIPRAIKGPVQKVGELLKLRMEKSPEDVKRYIKILQLENVLKRDIEKLSGGELQRFAIGMSCVQEADVYMFDEPSSYLDVKQRLNAAQIIRSLLAPTKYVICVEHDLSVLDYLSDFVCIIYGVPSVYGVVTLPASVREGINIFLDGHIPAENLRFRTEALQFRIADATEDLQNDSASRAFSYPSLKKTQGDFVLNVEEGEFSDSEILVMMGENGTGKTTLIKLLAGALKPDEGQDIPKLNVSMKPQKIAPKFPGTVRQLFFKKIRGQFLNPQFQTDVVKPLRIDDIIDQEVQHLSGGELQRVAIVLALGIPADIYLIDEPSAYLDSEQRIICSKVIRRFILHNKKTAFIVEHDFIMATYLADKVIVFEGIPSKNAHARAPESLLTGCNRFLKNLNVTFRRDPNSFRPRINKLDSQMDKEQKSSGNYFFLDNTGI。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。