鼠李糖脂的应用及其制备方法
阅读说明：本技术 鼠李糖脂的应用及其制备方法 (Application of rhamnolipid and preparation method thereof ) 是由 徐兆林 廖美德 石梦滢 赵鹏飞 王诗琦 马自杰 张婉婷 于 2019-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鼠李糖脂的制备方法,其中,使用胶孢炭疽菌次生代谢产物制备鼠李糖脂。拓展了鼠李糖脂的制备途径,为该化合物功能的进一步研究奠定了基础。本发明中还公开了鼠李糖脂、其农用盐或酯作为除草活性成分的应用。双鼠李糖脂对多种杂草均具有显著的除草活性,不管是单独作为除草活性成分还是与其他常用化学除草剂混用均能高效抑制其种子萌发和生长,可用于杂草的防除,可将其开发出高效、无污染的绿色除草剂组合物,或者为新型除草剂组合物的创制提供先导化合物,具有显著的社会效益、经济效益和生态效益。(the invention discloses a preparation method of rhamnolipid, wherein the rhamnolipid is prepared from colletotrichum gloeosporioides secondary metabolites. Expands the preparation way of rhamnolipid and lays a foundation for further research of the functions of the compound. The invention also discloses application of the rhamnolipid and the agriculturally acceptable salt or ester thereof as a weeding active ingredient. The dirhamnolipid has obvious herbicidal activity on various weeds, can effectively inhibit the germination and growth of seeds of the weeds whether being used as a herbicidal active ingredient alone or being mixed with other common chemical herbicides, can be used for preventing and removing the weeds, can develop an efficient and pollution-free green herbicide composition, or provides a lead compound for creating a novel herbicide composition, and has obvious social benefit, economic benefit and ecological benefit.)
技术领域
本发明涉及生物农药研究领域，具体涉及鼠李糖脂的应用及其制备方法。
背景技术
随着社会文明的进步和公众健康意识的提高，广泛、长期、大量使用化学农药所带来的负面影响日益显现，受全球关注。一方面，大量化学农药的施用带来了环境污染，尤其是长残效农药的应用引起了残毒药害、导致下茬作物的减产甚至人畜中毒。另一方面，过度依赖和长期大量使用单一农药，导致了病虫草害抗药性的产生和发展，使得药效降低、用药量增加、成本提高、也加重了污染，直接威胁到现有农药品种的继续使用和农业生产安全。因此，研制广谱、高效、低毒的新型农药特别是发展生物源农药显得十分迫切。
鼠李糖脂在农业上的应用研究较多，其可作为一种添加剂用于农业领域相关产品的生产上，有促进作物营养吸收、改善土壤环境、抑制真菌霉菌、防治部分病虫害、增产增收的作用。CN105454258A中公开一种含鼠李糖脂和苦参碱的杀虫组合物，将鼠李糖脂与苦参碱两种成分进行合理的复配制得增效明显的杀虫组合物，增强速效性，降低农药成本。CN105964676A公开了一种用生物可降解螯合剂减少重金属在水稻植株中积累的方法。将可降解螯合剂鼠李糖脂用水稀释搅拌均匀，得到稀释剂；将稀释剂分两次施用到水稻田中，从而实现降低水稻籽实中重金属的目的。关于鼠李糖脂在除草中的应用暂未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供鼠李糖脂的一种制备方法。
本发明的目的在于提供鼠李糖脂的一种应用，具体是指其在制备除草剂组合物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种鼠李糖脂的制备方法，其中，使用胶孢炭疽菌次生代谢产物制备鼠李糖脂。
进一步地，上述方法具体包括以下步骤：
1)用乙酸乙酯对胶孢炭疽菌次生代谢产物进行提取，然后减压旋蒸浓缩后得到提取物；
2)将步骤1)所得提取物用二氯甲烷/甲醇系统进行硅胶柱层析，经TLC合并后进行活性测定；
3)使用反相硅胶柱层析进一步分离2)中所得到的活性产物即得所述化合物的粗组分；
4)采用结晶法纯化步骤3)中所得到的化合物的粗组分，即得。
进一步地，鼠李糖脂为双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10。
鼠李糖脂、其农用盐或酯作为除草活性成分的应用。
进一步地，鼠李糖脂为双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10。
一种除草剂组合物，其除草活性成分唯一为鼠李糖脂、其农用盐或酯。
进一步地，鼠李糖脂为双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10。
进一步地，除草剂组合物中还含有农用助剂或载体。
一种防治不需要的植被的方法，向所述植被施用上述的除草剂组合物。
进一步地，所述植被包括胜红蓟、青葙、鬼针草、荠菜、稗草、反枝苋、薇甘菊、播娘蒿、五爪金龙、雀麦、看麦娘中的任意一种或几种。
本发明的有益效果是：
本发明还提供了一种新型生物表面活性剂——双鼠李糖脂的制备方法，拓展了鼠李糖脂的制备途径，为该化合物功能的进一步研究奠定了基础。
本发明提供了鼠李糖脂在制备除草剂组合物中的应用。双鼠李糖脂对多种杂草均具有显著的除草活性，不管是单独作为除草活性成分还是与其他常用化学除草剂混用均能高效抑制其种子萌发和生长，可用于杂草的防除，可将其开发出高效、无污染的绿色除草剂组合物，或者为新型除草剂组合物的创制提供先导化合物，具有显著的社会效益、经济效益和生态效益。
附图说明
图1为胶胞炭疽菌；
图2为胶胞炭疽菌发酵液；
图3为胶胞炭疽菌发酵液乙酸乙酯粗提物；
图4为确定硅胶柱层析馏分82为活性馏分；
图5为确定反相柱层析馏分R127为活性馏分；
图6为化合物Rha-Rha-C10-C10的性状直观图；
图7为化合物Rha-Rha-C10-C10的HPLC检测图；
图8为化合物Rha-Rha-C10-C10的1H-NMR图谱；
图9为化合物Rha-Rha-C10-C10的13C-NMR图谱；
图10为化合物Rha-Rha-C10-C10的质谱图；
图11为化合物Rha-Rha-C10-C10的红外谱图；
图12为化合物Rha-Rha-C10-C10对杂草的除草活性；
图13为化合物Rha-Rha-C10-C10损伤鬼针草的根尖成熟区的扫描电镜图。
具体实施方式
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
实施例1一种双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10的制备方法
使用胶孢炭疽菌次生代谢产物制备双鼠李糖脂的具体步骤如下：
1.于恒温培养箱28℃恒温培养胶胞炭疽菌7d至菌种长满PDA平板，胶胞炭疽菌菌种长势直观图见附图1；
2.从已在28℃培养箱中培养7d的胶孢炭疽菌PDA平板边缘用打孔器打取直径9mm的菌饼，每20块菌饼接入500mL已灭菌的改良查氏培养基(蔗糖3％，磷酸氢二钾 0.1％，硝酸钠0.2％，氯化钾0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，自来水定容，121℃灭菌20min)，于28℃、160rpm震荡培养7d，作为液体菌种种子液。再从液体菌种种子液中分别取100mL分别接种到4瓶2500mL(共10L)已灭菌的新鲜改良查氏培养基中继续于28℃、160rpm摇瓶培养14天，胶胞炭疽菌发酵液长势直观图见附图2；
3.将10L已发酵了14天的胶胞炭疽菌发酵液用500mL离心瓶4000rpm离心10分钟分离发酵液上清和菌丝体沉淀。用等体积比的乙酸乙酯萃取发酵液上清，而菌丝体沉淀用等体积乙醇混合并适量装入豆浆机高速搅拌粉碎5分钟，然后将粉碎后的菌丝体乙醇混合液再次用500mL离心瓶4000rpm离心10分钟分离上清和菌丝体沉淀，重复3次，合并菌丝体的乙醇提取液，60℃减压旋蒸去除乙醇后留下的液体再用乙酸乙酯等体积萃取，将菌丝体最终的乙酸乙酯粗提液与发酵液上清的乙酸乙酯萃取液混合后，再用60℃减压旋蒸除去乙酸乙酯后得到10g红褐色油状的胶胞炭疽菌发酵液乙酸乙酯粗提物，见附图3；
4.将10g乙酸乙酯粗提物进行硅胶拌样和硅胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱得到105个馏分，通过TLC点板合并相近馏分，并通过针刺霸王花茎秆追踪活性馏分，进而确定硅胶柱层析馏分82为活性馏分，见附图4；
5.将柱层析得到的2.5g馏分82进行进一步反相柱层析，洗脱得到130个馏分，通过TLC点板合并相近馏分，并通过针刺霸王花茎秆追踪活性馏分，进而得到1.2g反相柱层析馏分R127,并确定R127为活性馏分，见附图5；
6.采用结晶法纯化R127即得到1g目标化合物Rha-Rha-C10-C10，见附图6；
7.对化合物Rha-Rha-C10-C10进行进一步高效液相色谱(HPLC)检测分析，条件为：安捷伦1290型超高效液相色谱，XDB-C18(5μm)色谱柱(4.6mm×250mm)，流动相组成与比例为甲醇:水＝20:80，流速0.8mL/min，检测波长为266nm，出峰时间为4.9分钟，化合物Rha-Rha-C10-C10的HPLC检测图见附图7；
8.进一步鉴定化合物Rha-Rha-C10-C10的核磁氢谱信息，见附图8；
9.进一步鉴定化合物Rha-Rha-C10-C10的核磁碳谱信息，见附图9；
10.进一步鉴定化合物Rha-Rha-C10-C10的质谱信息，见附图10；
11.进一步鉴定化合物Rha-Rha-C10-C10的红外信息，见附图11；
12.最终鉴定得到化合物Rha-Rha-C10-C10的结构式如下：
实施例2 Rha-Rha-C10-C10的除草活性
采用小杯法测定Rha-Rha-C10-C10对多种杂草的除草活性。将杂草种子先用15％次氯酸钠浸泡15min消毒，再用自来水冲洗数次，然后用蒸馏水洗涤数次。接着将杂草种子浸泡在 200mg·L-1的赤霉素水溶液中催芽，24h后取出种子，用蒸馏水洗涤2～3次备用。
将直径为9cm的定性滤纸置于培养皿中，分别吸取3mL蒸馏水均匀湿润滤纸。每个培养皿中分别均匀放置杂草种子50～100粒，再次滴加蒸馏水，蒸馏水的量以湿润滤纸但种子不漂浮为宜。盖上保鲜膜防止水分蒸发，并扎有小孔以保证透气。将其置于光照培养箱培养25±2℃，16h/8h(L:D)，相对湿度80％。催芽一段时间后，挑取刚露白的种子备用。
以六孔板为容器，每个孔内加入一半体积的玻璃珠，振动塑料杯使玻璃珠面达到平整，分别选取发芽一致的杂草种子(芽长<0.5mm)10粒均匀地放在玻璃珠上，吸取4.0mL不同浓度的提取物药液于六孔板内，盖上扎有小孔的保鲜膜，防止水分蒸发散失并保持透气。每个处理重复3次，对照组加等体积的蒸馏水处理。处理环境于光照培养箱，条件：25±2℃，16h/8h(L:D)，相对湿度80％。7d后观察杂草根部生长情况和植株的整体状况并拍照(图12)，测量鲜重，用Image-Pro Plus 6.0软件测量根长，按照以下公示分别计算根长、鲜重抑制率：抑制率(100％)＝(对照组-处理组)/对照组×100。
Rha-Rha-C10-C10对8种杂草和水稻的株重和根长抑制率(7d)如表1所示。表1中除草活性数据均以平均值±标准误表示，每一行中所有数据后面相同的字母表示用DPS.7.05进行Duncan新复极差分析在P<0.05水平上没有显著性差异。由表1可以看出， Rha-Rha-C10-C10对所有供试杂草均有显著的除草活性，同时对水稻安全。其中， Rha-Rha-C10-C10对胜红蓟、青葙、鬼针草、荠菜的根长和株重抑制率的IC50均小于100mg L-1，对稗草、薇甘菊和反枝苋的根长和株重抑制率的IC50均在150mg L-1以内。
图13为不同浓度的Rha-Rha-C10-C10损伤鬼针草的根尖成熟区(7d)的扫描电镜图(A: 浓度0mg L-1，放大倍数1000；B:浓度0mg L-1,放大倍数5000；C:浓度500mg L-1，放大倍数1000；D:浓度500mg L-1，放大倍数5000；E:浓度1000mg L-1，放大倍数1000；F:浓度1000mgL-1，放大倍数5000。)由图13可以看出，没有用Rha-Rha-C10-C10处理的鬼针草根尖成熟区(A和B)表现出饱满的正常的形态；而500mg L-1处理下的鬼针草根尖成熟区(C和D)已表现出明显的失水萎缩，没有了正常的饱满状态；1000mg L-1处理下的鬼针草根尖成熟区(E和F)则进一步表现出更为严重的失水萎缩甚至破裂。扫描电镜观察结果表明：Rha-Rha-C10-C10的主要作用方式是导致受害部位失水萎缩甚至破裂。
Rha-Rha-C10-C10分别与阳性对照药剂五氟磺草胺和氰氟草酯混配(100mg L-1)对4 种杂草的株重和根长抑制(7d)如表2所示。表2中“氰”为阳性对照药剂氰氟草酯，“五”为阳性对照药剂五氟磺草胺，“RL”为供试化合物Rha-Rha-C10-C10。表中除草活性数据均以平均值±标准误表示，每一行中所有数据后面相同的字母表示用DPS.7.05进行Duncan新复极差分析在P<0.05水平上没有显著性差异。
由表2可以看出，在100mg L-1浓度下，Rha-Rha-C10-C10分别与阳性对照药剂五氟磺草胺和氰氟草酯混配后的除草活性要优于阳性对照药剂本身。其中，Rha-Rha-C10-C10与氰氟草酯混配对4种供试杂草的根长和鲜重抑制率与氰氟草酯本身均具有显著性差异。试验结果表明：Rha-Rha-C10-C10具有显著的除草活性，同时，Rha-Rha-C10-C10与阳性除草剂氰氟草酯和五氟磺草胺均能达到减量增效的除草活性效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。