阅读说明：本技术 一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法 (Preparation method of silk fibroin photoelectric immunosensor ) 是由 王秉 陈博逸 马维维 邓博之 万军民 彭志勤 于 2019-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及文物保护技术领域,公开了一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法,包括聚多巴胺的制备；纳米二氧化钛的制备；玻碳电极预处理；聚多巴胺/二氧化钛GCE电极的制备；丝素蛋白光电免疫传感器的制备；本发明以聚多巴胺/二氧化钛复合材料作为光电免疫传感器的敏感材料,该材料在405nm LED光源激发下,具有强而稳定的光电流,能够实现对丝素蛋白的高灵敏检测。本发明将纳米二氧化钛引入光电化学传感体系,该颗粒生物相容性好、具有较强稳定性。本发明的光电免疫传感器测定丝素蛋白的操作过程简便,不需要特殊实验条件,仪器要求简单,在文物鉴定领域具有较好的应用前景。(The invention relates to the technical field of cultural relic protection, and discloses a preparation method of a silk fibroin photoelectric immunosensor, which comprises the steps of preparing polydopamine; preparing nano titanium dioxide; pretreating a glassy carbon electrode; preparing a polydopamine/titanium dioxide GCE electrode; preparing a silk fibroin photoelectric immunosensor; the poly-dopamine/titanium dioxide composite material is used as a sensitive material of the photoelectric immunosensor, and has strong and stable photocurrent under the excitation of a 405nm LED light source, so that the high-sensitivity detection of the silk fibroin can be realized. The invention introduces the nano titanium dioxide into a photoelectrochemical sensing system, and the particles have good biocompatibility and stronger stability. The photoelectric immunosensor provided by the invention has the advantages of simple operation process for determining silk fibroin, no need of special experimental conditions, simple instrument requirements and good application prospect in the field of cultural relic identification.)

一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及文物保护技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法。

背景技术

中国是世界上最早产生纺织品的国家之一。早在原始社会，人们就掌握了简单的纺织技术，通过搓、编、织将野生的麻等做成衣服以取代防寒保暖、遮羞蔽体的动物毛皮。随着农业、桑蚕业和畜牧业的发展，形成了以麻、丝、毛的为主要纺织原材料的中国古代纺织品体系。在漫长的历史长河中，纺织品文物见证了我国社会更替、经济发展和文化交融，是研究我国古代社会经济技术文化水平的珍贵史料。目前出土的纺织品中，蛋白类纺织品占多数。该类纺织品易受到墓葬环境中水分、温度、酸碱度及微生物等影响而发生老化分解，从而引起大分子链的断裂，肽段的降解，出土时已成为碎片、微痕迹。因此，针对文物的鉴定，建立科学有效而又灵敏的检测方法十分的必要，而光电化学免疫传感灵敏度较高，并且检测限可以进一步降低。此外，由于利用电信号响应，同传统的免疫相比，PEC检测仪器备简易，价格低廉且易于微型化等优点。光电化学免疫传感器在文物检测领域具有强大的应用前景。

光电化学免疫分析的基本方法原理是，在光照条件下，将免疫反应转变为光电活性物质的光电信号，从而实现对待测物的定性与定量检测。其中光电活性物质与增强光电流是光电化学免疫传感器的关键。纳米级的TiO₂具有传导速率高，生物相容性好的特点。如何将其更好地应用于文物保护领域，是一道难题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法。

本发明的具体技术方案为：一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法，以mg和mL计，包括以下步骤：

1)聚多巴胺的制备：向容器中加入8～10ml无水乙醇和18～20ml去离子水，随后加入500-700ul浓氨水(0.898g/ml～0.907g/ml)；将所得混合溶液搅拌20-40min后，缓慢加入45-55mg/ml的1.5-2.5ml多巴胺溶液；在常温下搅拌反应，将所得溶液离心后，取固体即为聚多巴胺。

2)纳米二氧化钛的制备：取20-30ml无水乙醇，依次加入0.8-1.2ml正丁醇、0.8-1.2ml聚乙二醇、0.35-0.40ml氢氟酸、0.8-1.2ml乙二醇和0.4-0.6ml去离子水，搅拌15～20min，配制成溶液A；再取2.5-3.5ml钛酸四丁酯，加入8-12ml无水乙醇，搅拌15～20min配成溶液B；将溶液B以3.5-4.5ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续搅拌3～5h；将搅拌好的溶液在140-160℃下并辅搅拌3.5～4h，至反应结束，分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净所得的产物烘干，研磨后煅烧，得到纳米二氧化钛。

3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗。

4)面滴加2-4ul已配置好的聚多巴胺溶液(10ug/L)，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加2-4ul已配置好的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)于电极表面，烘干后即制得聚多巴胺/二氧化钛/GCE电极；

5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。

作为优选，步骤1)中，加入多巴胺溶液后的搅拌时间为25-35h，搅拌时避光，离心条件为9000-11000rpm，4-6min。

作为优选，步骤2)中，将洗净所得的产物在55-65℃下烘干，研磨1～2h后在420-440℃煅烧20-40min，得到纳米二氧化钛。

作为优选，步骤3)中，用无水乙醇浸泡超声清洗8-12min；最后用去离子水超声清洗8-12min。

作为优选，步骤4)中，在室温下烘干。

作为优选，步骤4)至步骤6)中，所述PBS缓冲液的pH＝7.4。

作为优选，步骤5)中，所述BSA溶液的浓度为0.8-1.2wt％。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

在步骤4)中，本发明分两次将聚多巴胺和纳米二氧化钛附着于电极表面上，能极大增强电化学信号的传导。

在步骤5)中，本发明将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯，可以通过转化基团来实现与抗体的结合，更将量子点标记的抗体引入体系。

本发明以聚多巴胺/二氧化钛复合材料作为光电免疫传感器的敏感材料，该材料在405nm LED光源激发下，具有强而稳定的光电流，能够实现对丝素蛋白的高灵敏检测。

本发明将纳米二氧化钛引入光电化学传感体系，该颗粒生物相容性好、具有较强稳定性。

本发明的光电免疫传感器测定丝素蛋白的操作过程简便，不需要特殊实验条件，仪器要求简单，在文物鉴定领域具有较好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。

2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO₂在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。

3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。

4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L^-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。

5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。

实施例2

1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入9ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。

2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO₂在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。

3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。

4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L^-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。

5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。

实施例3

1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8.5ml无水乙醇和19ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。

2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO₂在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。

3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。

4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L^-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。

5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6uL 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。

实施例4

1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8ml无水乙醇和20ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。

2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO₂在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。

3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。

4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol.L^-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。

5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。