阅读说明：本技术 基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法 (Citrus huanglongbing detection method based on chlorophyll fluorescence imaging technology ) 是由 聂鹏程 蔺磊 瞿芳芳 于 2019-05-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法,以建模集中的柑橘叶片在基于脉冲调制式的叶绿素荧光测试程序中获得的的叶绿素荧光参数作为LS-SVM判别模型的输入,建立LS-SVM判别模型。本发明提供的基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法,对于不同季节、不同果园和不同染病阶段的柑橘黄龙病均具有良好的识别效果。(The invention discloses a citrus greening disease detection method based on a chlorophyll fluorescence imaging technology, which takes chlorophyll fluorescence parameters obtained by modeling concentrated citrus leaves in a chlorophyll fluorescence test program based on a pulse modulation type as input of an LS-SVM discrimination model, and establishes the LS-SVM discrimination model. The citrus greening disease detection method based on the chlorophyll fluorescence imaging technology has a good identification effect on citrus greening diseases in different seasons, different orchards and different infection stages.)

基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法。

(二)背景技术

在光合放氧生物中，光能被叶绿体中的捕光复合体(Light harvesting complex,LHC) 收集后，以荧光共振能量转移的方式向反应中心(Reaction center,RC)转移，实现对叶绿素分子的激发。激发态的叶绿素分子(P680*)被络氨酸(Yz)重新还原，并从水分子的氧化中得到1个电子。在光反应中心II(PSII)的还原侧，脱镁叶绿素(Pheo)得到的电子向初级电子受体Q_A转移，接着Q_B，细胞色素复合体(cytb₆f)，质体蓝素 (plastocyanin)然后传递到光反应中心I(PSI)。在整个电子传递过程中，电子的最初供体为H₂O，最终受体是NADP⁺，任何一个环节受阻均会导致氧化还原反应无法顺利进行，引起荧光信号改变。叶绿素荧光作为植物吸收的光能释放能量的途径之一，能够提供与光合作用和热耗散情况相关的信息，这为研究不同基因型植物光合作用能力以及植物对胁迫逆境的光合响应提供了有力的工具。

有学者尝试了利用叶绿素荧光技术检测柑橘黄龙病。尽管有些研究采用荧光技术能够获得不错的检测结果，但是都是针对特定时期，而且对潜伏期的染病叶片识别效果不佳。由于季节变动、果园以及染病程度差异等因素直接影响着宿主对病原菌的响应。因此，有必要更加全面的分析季节变动、果园以及染病程度差异等因素对柑橘黄龙病对宿主的影响以及柑橘黄龙检测效果的影响。

(三)

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法，该检测方法对于不同季节、不同生长环境和不同染病阶段的柑橘黄龙病均具有良好的识别效果。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法，包括如下步骤：

(a)采集柑橘叶片，所述的柑橘叶片包括不同采集时间和不同生长环境的健康叶片和染病叶片，所述的染病叶片包括不同染病状态的叶片；

(b)将步骤(a)中的柑橘叶片按一定比例划分为预测集和建模集两部分；

(c)启动基于脉冲调制式的叶绿素荧光测试程序，获取建模集中的柑橘叶片在不同测试程序下的的叶绿素荧光参数；

(d)将同一测试程序下的果园1和果园2建模集的数据合并，将该测试程序下获得的叶绿素荧光参数输入LS-SVM(最小二乘向量机)判别模型中，建立不同测试程序下的判别模型；

(e)用步骤(d)获得的不同测试程序下的判别模型对果园1和果园2预测集中的不同月份或季节的柑橘叶片进行识别，确定最佳测试程序，该测试程序获得的模型即为最佳模型；

(f)使用步骤(e)确定的最佳测试程序获取待测柑橘叶片的叶绿素荧光参数，并将该参数输入到步骤(e)获得的最佳模型中，从而判断该柑橘植株是否感染黄龙病。

步骤(a)中，由于柑橘黄龙病病原菌在宿主体内不均匀分布，因此优选从每棵柑橘树的东南西北的四个方位进行采样。

本发明步骤(a)中，所述的柑橘叶片的采集，所述的“不同采集时间”可以根据实际需要确定，比如按月或者按季度。所述的不同生长环境，是指不同生长环境的果园至少有两个。所述的染病叶片包括不同染病状态的叶片，是指至少包括染病显症叶片和染病不显症叶片。作为优选，本发明是采集果园1和果园2的柑橘叶片，所述的果园1 和2的生长环境不同，所述柑橘叶片包括健康叶片和染病叶片，所述果园1中的染病叶片是染病显症叶片，所述果园2的染病叶片是染病非显症叶片。

本发明步骤(b)中，优选利用Kennard-Stone(KS)算法将不同采集时间的数据集分成建模集和预测集，接着将不同采集时间的建模集进行合并，得到能反映不同季节的建模集，最终用于判别模型的建立。

本发明步骤(c)中，经典的基于脉冲调制式的叶绿素荧光测量程序，大致过程如下：

(1)将叶片进行充分暗适应；

(2)打开测量光，测量暗适应下的初始荧光产量Fo；

(3)过一段时间，打开饱和光，测量暗适应下的最大荧光产量Fm；

(4)接着打开光化光，光化光的强度能够维持叶片正常光合作用的进行，直至达到稳定状态，这时测量到的荧光即为稳态荧光Fs；

(5)再次施加一个饱和光，测量光适应下的最大荧光产量Fm’；

(6)关闭光化光，叶片进入暗弛豫状态，打开远红光3-5s，电子传递链再氧化。测量光适应条件下的最小荧光Fo’。在没有配备远红光光源的情况下，可通过公式 Fo/(Fv/Fm+Fo/Fm’)获得近似值。

作为优选，饱和光强度设定为1500μmol photons·m^-2·s^-1，光化光的强度设定与果园中平均光照强度相当。

作为优选，所述的测量程序的打点时间方式如下所示，具体选自下列测试程序的一种：仅为暗适应(Dark)、L1(从暗适应到L1)＝32.24s、L2(从暗适应到L2)＝42.24s、 L3(从暗适应到L3)＝52.24s、L4(从暗适应到L4)＝72.24s、Lss(从暗适应到Lss) ＝92.24s、D1(从暗适应到D1)＝122.24s、D2(从暗适应到D2)＝152.24s以及D3(从暗适应到D3)＝184.24s九个测量程序。除了暗适应条件下，每施加一个饱和光，就可获取一组对应时刻的荧光参数。

作为优选，所述的叶绿素荧光参数至少包括下列之一：稳态时刻发射的荧光强度、Rfd、Fo、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII、ΦNO。

本发明步骤(c)中，若得到的叶绿素荧光图像中某些像素点的数值明显偏离荧光图像中的其他像素点的数值，则需要对这些异常像素点进行预处理，使得最终的结果更加准确。本发明推荐的预处理方法为：采用3σ准则来判断感兴趣区域(Region of interest,ROI)所有像素点是否存在异常值，当判断ROI区域存在着异常像素点时，利用邻近的像素点进行填充，优选用邻近的若干个像素点的平均值来替换。本发明中所述的感兴趣区域优选为整个叶片。

作为优选，步骤(d)中，以径向基核函数(Radical basis function,RBF)作为LS-SVM 模型的核函数。当选定RBF核函数后，需要进一步应用网格搜索(Grid searching)算法对RBF核函数的参数σ以及正则化参数γ需要进行优化，使得LS-SVM模型获得最佳的预测效果。

作为优选，步骤(e)中，所述的最佳测试程序选择L4，该测试程序可使模型对于不同染病程度的柑橘叶片都通用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供的基于叶绿素荧光成像技术的柑橘黄龙病检测方法，对于不同季节、不同生长环境和不同染病阶段的柑橘黄龙病均具有良好的识别效果。

(四)附图说明

图1是叶绿素荧光成像系统。

图2是柑橘叶绿素荧光信号的测量程序。

图3是叶绿素荧光图像中异常值去除前：(a)和处理后(b)对比效果图。

图4是不同季节两个果园田间的气温变化：(a)为果园1；(b)为果园2。

图5是典型的健康和染病叶片的荧光淬灭曲线，图中健康和染病的曲线均是216个样品的平均值。

图6是两个果园中健康和染病叶片在不同季节暗适应条件下的最小荧光(Fo)、PSII最大光量子效率(Fv/Fm)以及可变荧光和最小荧光的比值(Fv/Fo)，图(a)、 (c)、(e)和(b)、(d)、(f)分别表示果园1和果园2的参数，每个月份数值分别为216片健康和216染病叶片的平均值和标准偏差，每个月份柱状图上显示2颗星代表Duncan检验下有显著性差异(p<0.01)。

图7是不同季节两个果园中健康和染病叶片将吸收的光能分配为光化学淬灭 (ΦPSII)、可调式非光化光淬灭(ΦNPQ)以及不可调式非光化光淬灭(ΦNO)，图 (a)和(b)分别表示果园1和果园2，图中每个月份数值分别为216片健康和216染病叶片的平均值和标准偏差，柱状图上显示2颗星代表在Duncan检验下具有显著性差异(p<0.01)。

图8是果园1中6-11月叶绿素荧光参数的PC1、PC2和PC3得分三维散点图；

图9是果园2中1-12月叶绿素荧光参数的PC1、PC2和PC3得分三维散点图。

(五)

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

1、柑橘叶片采集

果园1和果园2的温州蜜柑叶片分别采集于2016年6月-11月的浙江省临海市沿江镇前岙洋村和2017年1月-12月的临海市宝山镇上白岩村。

从两个不同的果园中分别选择3棵健康和3棵经qPCR技术鉴定的感染黄龙病的植株作为研究对象。果园1的病树在秋季会显现典型的黄龙病症状，而果园2的病树则整年均未显症。

由于柑橘黄龙病病原菌在宿主体内不均匀分布，因此从每棵柑橘树的东南西北的四个方位进行采样。在每棵树的每个方位选择长势相似的3条树梢，剪下并立即用湿棉花包住树梢的切口，再装入自封袋，最后放置保鲜盒内，防止水分散失。为了进一步减少人为操作对柑橘叶片的影响，在实验开始的前1个小时内，再从每条树梢上取下6叶片用于高光谱图像采集。每个月从果园1或者果园2采集的叶片分布如表1所示：

表1每个月份分别从果园中采集的叶片分布表

Table 2-1Descriptions of monthly citrus leaves collected from theorchard

柑橘感染黄龙病后，随着染病程度的逐渐增加，叶片会呈现斑驳状黄化，也常被误认为缺素症。为了进一步区分黄龙病侵染与缺素两种胁迫对柑橘宿主的影响，本实验于2016年8月2日再次从浙江省临海市大盘镇大坑村(果园3)以同样的采集方式收集了缺素(缺铁)的温州蜜柑叶片201片，以及健康叶片30片。

本实验整个周期的采样具体情况如表2所示。

表2从三个果园采集的叶片分布情况

^*在2016年6月，由于果园1的感染黄龙病的柑橘植株抽芽(春梢)的速度小于健康植株，无法收集足够数量的新叶，因此对于感病植株采集108片老叶和108片新叶。而对于2017年 6月份的果园2，则是采集同时期的健康和染病叶片。

2、叶绿素成像系统

图1和表3分别为本发明实施例使用的叶绿素荧光成像系统及一些附件性能参数。

表3叶绿素荧光成像系统组件的参数指标

注：光强的大小是距离光源20cm的位置测量所得。

3、柑橘叶片叶绿素荧光图像测量的程序

本发明利用饱和光脉冲调制式荧光成像技术获取不同季节和不同果园的健康和染病柑橘叶片的荧光信号。图2显示了本发明所用的柑橘叶绿素荧光测量程序，该测量程序由PSI公司(FluorCam,Photon Systems Instruments，Brno)提供，包含了暗适应、光适应和暗弛豫三个阶段。饱和光强度设定为1500μmol photons·m^-2·s^-1，光化光的强度设定与果园中平均光照强度相当，为100μmol photons·m^-2·s^-1。除了稳态时刻的1个饱和脉冲外，在光适应和暗弛豫两个过程中均增加3个饱和光，打光的时间方式如下所示：

按照时间进程、将本试验的整个测量程序细分成：仅为暗适应(Dark)、L1(从暗适应到L1)、L2(从暗适应到L2)、L3(从暗适应到L3)、L4(从暗适应到L4)、Lss (从暗适应到Lss)、D1(从暗适应到D1)、D2(从暗适应到D2)以及D3(从暗适应到D3)九个测量程序(如图2所示)。除了暗适应条件下，每施加一个饱和光，就可获取一组对应时刻的荧光参数，常见叶绿素荧光参数见表4。

表4常用叶绿素荧光参数

4、柑橘叶绿素荧光数据预处理及判别模型

根据前期预实验结果表明，CCD相机所得的叶绿素荧光图像(696×520pixels)中某些像素点的数值明显偏离荧光图像中的其他像素点的数值，因此需要对这些异常像素点进行预处理，使得最终的结果更加准确。本试验采用3σ准则来判断感兴趣区域 (Region ofinterest,ROI)即整个叶片所有像素点是否存在异常值。当判断ROI区域存在着异常像素点时，利用邻近的像素点进行填充。图3显示了剔除异常像素点的前后效果，具体采用3σ准则判断异常像素点，并利用临近的四个像素点的平均值替换。

在整个柑橘黄龙病识别过程中，将染病、健康以及缺素的叶片标签类别分别赋值为“1”、“2”和“3”。利用Kennard-Stone(KS)算法按60％：40％的比例将每个月的数据集分成及建模集和预测集。接着将每个月的建模集进行合并，得到能反映不同季节的建模集，最终用于判别模型的建立。最终利用所建立的模型对每个月的预测集进行预测，实现对每个月份柑橘黄龙病的检测。

本发明实施例将建模集获得的叶绿素荧光参数输入到LS-SVM(最小二乘向量机)判别模型中，建立判别模型。本试验选择径向基核函数(Radical basis function,RBF)作为LS-SVM模型的核函数。当选定RBF核函数后，需要进一步应用网格搜索(Grid searching)算法对RBF核函数的参数σ以及正则化参数γ需要进行优化，使得LS-SVM 模型获得最佳的预测效果。

最终利用所建立的模型对每个月的预测集进行预测，并与PCR测试结果进行对比，确定最佳模型。

本发明实验所有的数据处理均在Matlab 2011a(The Mathworks,Inc.,Natick,MA, USA)、Excel(Microsoft)和IBM SPSS Statistics(version 20.0,IBM Corporation,Armonk, New York,USA)软件平台上进行。

5、不同季节两个果园的田间气温变化

温度会对柑橘叶片的光合作用产生影响。当温度超过32℃时有可能产生光抑制，当温度超过42℃时，会对电子传递链产生不可逆的损伤；而当温度低于10℃则也有可能产生冻害损伤。因此，需要记录不同季节两个果园的田间气温变化。图4显示了果园1(图6a)和果园2(图6b)不同季节的最大和最小温度。果园1和果园2的气温均在7月份到达最高，分别为35℃和33℃。果园2则在1月份时气温最低，为4℃，说明在两个果园极端温度的季度柑橘叶片有可能出现光合效率降低。

6、柑橘黄龙病病原菌对柑橘叶片叶绿素荧光淬灭的影响

用图2所示的柑橘叶绿素荧光信号的测量程序对果园1在11月份采集的216片健康和216片染病叶片进行测量，图5显示了果园1在11月份采集的216片健康和216 片染病叶片的平均叶绿素荧光淬灭曲线。从图中可以看出，在稳态时刻，健康叶片发射的荧光强度低于染病叶片，这是由于健康叶片内部叶绿素含量高，导致更多的叶绿素荧光信号被再吸收。进一步分析叶绿素荧光淬灭的速度Rfd＝(Fp-Fs)/Fs，即从Kautsky效应的最大荧光Fp算起直至稳态时刻Fs。Rfd常被当作植物光合作用能力的指示器。从图中可以看出，健康叶片的荧光淬灭的速度大于染病叶片，说明病原菌降低宿主的光合作用能力。总之，健康和染病叶片两者之间不同的荧光强度和淬灭速率说明了两者对所吸收光能的利用率不同。

7、不同季节两个果园中的健康和染病叶片在暗适应条件下的荧光参数

经过暗适应后得到的叶绿素荧光参数能够反映柑橘叶片光合器官的初始状态。图6 的(a)和(b)显示不同季节果园1和果园2的柑橘叶片经充分暗适应(20min)后得到的最小荧光(Fo)。分析不同季节两个果园柑橘叶片的Fo可知，果园1中七月份的健康和染病叶片的Fo值高于其他月份，这可能由于高温胁迫引起的(七月份田间气温为35℃)。进一步观察果园2柑橘叶片的Fo值在1月到12月份中的变化情况，也可以发现Fo值在田间气温高的夏季和低的冬季较高，而在春季和秋季则较低。由于Fo与初级电子受体Q_A有关，有文献表明，高温会损伤PSII反应中心，阻碍电子从Q_A ^-向Q_B传递，影响Q_A ^-的再氧化程度^[154]，而低温则会破坏类囊体膜结构的完整性^[155]。进一步对比两个果园中健康和染病叶片的最小荧光(Fo)，尽管存在季节性波段动，但是还是可以看出黄龙病病原菌的侵染致使宿主Fo上升(除果园2中5月份的叶片之外)。染病叶片Fo的上升，说明了病原菌会损伤类囊体结构，最终阻碍激发能向光反应中心的转移。进一步分析可知，未显症叶片的Fo也出现上升的趋势，说明黄龙病病原菌对宿主光系统II的损伤在未显症时期就已经发生。

Fv/Fm反映了PSII的最大光量子效率，对胁迫十分灵敏，被视为植物遭受胁迫的指示器，也常被用于分析胁迫引起的植物光合效率变化。分析图6的(c)和(d)可以发现， Fv/Fm同样存在是季节性波动，说明了季节变化会直接影响着柑橘叶片的光系统II的活动。果园1中7月份健康叶片的Fv/Fm出现下降，与染病叶片没有显著性差异，这说明高温会使柑橘叶片的光合作用能力下降。然而对比分析健康和染病的Fv/Fm可知，不同季节两个果园中染病叶片的Fv/Fm均小于健康叶片(除了果园1中7月份和果园2 中的5月份)，说明了染病柑橘叶片的PSII遭受到了破坏，而这种破坏在未显症时期就已经发生。

可变荧光和最小荧光的比值(Fv/Fo)反映了光系统II中有活性的反应中心的数量和尺寸。Fv/Fo越低，说明植物受到的胁迫越严重。从图6的(e)和(f)可以发现，除了果园1中的7月高温胁迫引起健康叶片的Fv/Fo下降，以及果园2中5月份年轻的健康和染病叶片的Fv/Fo值无法区分之外，两个果园中其余月份的染病叶片的Fv/Fo均显著低于健康叶片。这说明了黄龙病病原菌会显著减少宿主光系统II中有活性的光反应中心数量，最终降低宿主光合作用效率。

8、柑橘黄龙病病原菌对柑橘叶片PSII能量分配的影响

植物吸收的光能以三个途径释放：光化学淬灭(Photochemistry,ΦPSII)，反映了吸收的光能被用于实际光合作用的份额、由囊体腔酸化(ΔpH)诱导的叶黄素循环以及PSII天线蛋白构象变化两者协同作用引起的可调式非光化光淬灭(Regulated energyquenching,ΦNPQ)，该部分与光保护机制有关、以及由光抑制引起的不可调式非光化光淬灭(Non-regulated energy dissipation,ΦNO)。三者加起来和为1，反映了三个能量释放途径的相互竞争关系。从图7可以看出，尽管存在季节性波动，但是却可以明显的看出两个果园中的染病未显症和显症叶片的ΦPSII值均低于健康的叶片，说明黄龙病病原菌侵染会降低了柑橘宿主将吸收光能转化为光化学反应的能力，而且这种削弱在黄龙病症状未显现时就已经发生。

分析健康和染病叶片将吸收的光能转化为用于光保护的可调式非光化光淬灭(ΦNPQ)。可以得知，对于果园1的6、10和11月份和果园2的3、4、5、6、8和9 月份，两者存在差异。但是，在果园1的7和8月份以及果园2的1、2、7、10和11 的，两者却没有差别。不同季节的ΦNPQ变异较大，这意味着，ΦNPQ对柑橘黄龙病的指示性不如ΦPSII。

进一步分析不同季节的ΦNO，除了果园1中的7月(因高温胁迫)和果园2中5 月(新长的叶片)两类叶片没有差别之外，在其他月份均出现了染病叶片(包括未显症和显症)大于健康叶片的现象。ΦNO对不同季节柑橘黄龙病的指示性比ΦNPQ稳定。染病叶片的ΦNO大于健康叶片，说明了黄龙病病菌侵染会引起宿主PSII不可逆的损伤，产生光抑制。综合整个实验周期来看，两个果园中染病叶片光化学反应效率(ΦPSII) 的降低主要由于宿主受到光抑制后，将吸收的光能转化成了不可调式非光化光淬灭 (ΦNO)。

9、不同季节的三类柑橘叶片叶绿素荧光参数的PCA定性分析

图8为果园1不同月份柑橘叶片(健康、健康和缺素)的PCA可视化分布图。6月、 7月、8月、9月、10月和11月份前三个主成分的累积贡献率分别为86.4％、86.0％、 83.5％、84.3％、85.0％和90.3％，说明前三个主成分能够代表原始数据大部分的变量信息。除了7月份中健康和染病的柑橘叶片存在重叠的情况之外，剩余其他月份的柑橘样品均能较好的聚成了健康、染病和缺素3类。其中，缺素的叶片在每个月份均能与健康和染病的叶片明显地区别开来。当然，不同季节各类别的聚集程度又是变动的，反映了柑橘叶片处于动态的生长过程。

同样对整个试验周期中处于未显症的果园2柑橘叶片的叶绿素荧光数据进行主成分分析。果园2不同季节健康、染病以及缺素3类柑橘叶片的PCA可视化分布图中，1 月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月和12月份前三个主成分的累积贡献率分别占了89.7％、90.8％、91.5％、89.0％、90.9％、92.2％、89.8％、 86.6％、85.3％、86.1％、88.8％和88.6％，同样能够代表原始数据的绝大部分信息。总体来说，不同季节的数据均能分别聚成了健康、染病和缺素3类。与果园1类似，即使存在季节变动，但是缺素的柑橘叶片均能与其他两类区分开来。但是由于两个果园的染病程度不同，果园2的聚集效果略低于果园1。表现为果园2中的2、5、8和9月份健康和染病的柑橘叶片重叠度较高。说明采用无监督的模式识别方法并不能较好地对实现不同季节、不同果园和不同染病程度柑橘黄龙病的判别。

10、基于不同protocol建立的LS-SVM模型对果园1不同季节柑橘黄龙病的检测结果

(a)果园1的柑橘叶片的采集见第1点，

(b)将采集得到的柑橘叶片按表5划分为预测集和建模集两部分；

(c)叶绿素荧光成像系统见图1和表3，采集叶绿素荧光图像，若原始荧光图像中存在异常像素点，按照第4点的预处理方法进行预处理；启动图2所示的基于脉冲调制式的叶绿素荧光测试程序，获取建模集中的柑橘叶片在不同测试程序下的的叶绿素荧光参数；其中饱和光强度设定为1500μmol photons·m^-2·s^-1。

(d)将同一测试程序下的建模集的数据合并，将该测试程序下获得的叶绿素荧光参数输入LS-SVM(最小二乘向量机)判别模型中，建立不同测试程序下的判别模型；

(e)用步骤(d)获得的不同测试程序下的判别模型对果园1预测集中的不同月份或季节的柑橘叶片进行识别，确定最佳测试程序，该测试程序获得的模型即为最佳模型；

(f)使用步骤(e)确定的最佳测试程序获取待测柑橘叶片的叶绿素荧光参数，并将该参数输入到步骤(d)获得的最佳模型中，从而判断柑橘植株是否感染黄龙病。

表5列举了基于不同测量程序得到的叶绿素荧光参数构建的LS-SVM模型对果园1中不同季节的三类柑橘叶片的判别结果。当叶绿素荧光参数仅来自于暗适应(Dark)时，LS-SVM判别模型对果园1所有的季节检测效果均较差。当测量程序选择L1时，即光化光打开后，叶片开始光合作用，模型的预测效果得到了显著的提升，说明了三类柑橘叶片光合作用能力存在差异。除了LS-SVM模型对7月份柑橘黄龙病的识别效果略差之外(总体正确率为80.7％)，在其他月份均获得了大于90％的总体准确率。当测量程序为L2时，模型对7月份柑橘黄龙病的总体识别正确率提升到了96.9％，果园1整个试验周期(6-11月)的总体识别率为97.9％，说明光合作进行到L2时刻时，随着PSII 内部电子传递链氧化还原反应的持续进行，健康、染病和缺素叶片三种类型之间的光化学反应能力的差异性逐渐被进一步凸显。随着光化光的持续进行，到达L3、L4或者Lss 时，与L2相比，模型对柑橘黄龙病检测的效果并没有明显的提升。当继续添加进入暗弛豫后(利用D1、D2或者D3)得到的荧光参数时，模型的判别性能较于L2虽然有略微的提升(低于5％)，但是数据维度和检测时间却也增加了。综合考虑检测效率、输入变量维度以及模型的复杂度，认为选择测量程序L2得到的29个荧光参数构建的模型可满足果园1不同条件下柑橘黄龙病的检测要求。

表5不同测量程序得到的叶绿素荧光参数构建的LS-SVM模型对果园1中不同季节柑橘黄龙病得的识别效果

11、基于不同protocol建立的LS-SVM模型对果园2不同季节柑橘黄龙病的检测结果

因为果园2的染病植株在这个试验周期均没有出现典型的黄龙病症状，因此果园2染病植株的程度低于果园1。倘若采用叶绿素荧光成像技术能检测出处于潜伏期的染病柑橘植株，这将更加有助于及时切断传染源。因此，本部分同样分析了采用不同的叶绿素荧光测量程序得到的叶绿素荧光参数对果园2不同季节柑橘黄龙病的检测。检测步骤同第10点。

表6显示了不同测量程序得到的叶绿素荧光参数构建的LS-SVM模型对果园2中不同季节的三类柑橘叶片的判别结果。结果表明，仅利用暗适应(Dark)条件下得到的叶绿素荧光参数构建LS-SVM不能达到较好的识别效果，这与果园1一致。当柑橘叶片从暗适应环境转向光适应环境中，得到的叶绿素荧光参数能够较好地改善对三类柑橘叶片识别能力。说明健康、染病和缺素叶片内部的PSII的电子链氧化还原以及光合作用相关酶的再激活过程存在差异，也表明了光适应处理对柑橘黄龙病检测的必要性。另一方面，不同月份的总体识别正确率存在波动，这也恰恰说明了季节变化引起的叶片生长状态差异对柑橘黄龙病的检测具有较大的影响。当光化光持续到L2时，LS-SVM模型的判别性能得到了进一步提升，以5、6、8和9月份为例，分别由原来的68.5％、77.2％、 83.1％和74.0％提高到了76.8％、91.3％、90.9％和79.9％。随着光化学反应的持续至L4 时，LS-SVM模型判别模型对各个月份柑橘黄龙病的识别能力趋于稳定，除了5和9月份的正确率为81.9％和85.4％外，其他月份均大于90％。L4得到的53个荧光参数构建的LS-SVM模型对四个季度(春、夏、秋和冬)和整年的柑橘黄龙病总体识别正确率分别为87.7％、94.8％、90.3％、95.0％和91.9％。虽然，采用Lss、D1、D2和D3测量程序时分类结果有略微提高，但也同时延长了测量时间，增加了数据维度和模型复杂度。综合分析，采用测量程序L4得到的荧光参数构建的LS-SVM模型可满足果园2柑橘黄龙病的检测要求。

表6不同测量程序得到的叶绿素荧光参数构建的LS-SVM模型对果园2中不同季节柑橘黄龙病得的识别效果

12、采用两个果园数据合并建立的LS-SVM模型对不同季节、不同果园柑橘黄龙病的检测结果

检测方法同第10点，区别在于将果园1和果园2的数据进行合并，融合果园1和果园2的建模集用于训练新的LS-SVM模型。表7列举了两个果园数据合并后分别利用L1、L2、L3和L4四个测量程序获取到的叶绿素荧光参数建立的LS-SVM模型分别对两个果园不同季节柑橘黄龙病的识别结果。分析表7可知，采用这种方式建立的 LS-SVM模型对果园1不同季节的柑橘黄龙病的识别效果采用测量程序L2就可以达到较为满意的结果，在不同月份的总体的识别正确率均达到了90％以上，这与果园1单独建模所得到的结果相当(表5)。对于染病程度较轻、整年均未显症的果园2而言，还是利用测量程序L4才能得到较好识别效果，这表明合并两个果园数据并未有效地增加与对未显症柑橘黄龙病有关的特征，这可能是由于果园1的染病植株染病程度较为严重，并不能提供一些与染病程度较低有关的特征，测量程序L2获得的29个叶绿素荧光参数构建的LS-SVM判别模型仅对染病程度较为严重的果园1中柑橘黄龙病识别效果较好。因而本部分认为，为了达到模型通用性的要求，在采用叶绿素荧光成像技术时，利用测量程序L4获取的53个叶绿素荧光参数构建的LS-SVM模型(γ＝[142709.35, 556.03,4336.14]，σ²＝[19.36,57.82,135.54])对不同季节、不同果园以及不同染病程度的柑橘黄龙病检测较为合适。

表7两个果园数据合并后采用不同测量程序得到的荧光参数构建的LS-SVM模型对两个果园不同季节的柑橘黄龙病的检测结果

注：a表示两个果园的预测集数一致，b和c分别表示果园1和果园2预测集数分别为1119和2076。