阅读说明：本技术 一种超敏型ecl化学发光试剂 (Hypersensitive ECL chemiluminescent reagent ) 是由 王兴 杨旭源 张新慧 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超敏型ECL化学发光试剂,主要由发光剂鲁米诺、一级增强剂3-(-10-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸钠、二级增强剂4-吗啉基吡啶和氧化剂过氧化氢组成,该超敏型ECL化学发光试剂通过特定组物的复配形成,可在Western blot和EMSA实验中与辣根过氧化物酶(HRP)配套使用,具有反应时间短、灵敏度高、抗猝灭能力强、结果稳定等特点,在4℃条件下可以稳定保存1年。(The invention discloses a hypersensitivity ECL chemiluminescent reagent which mainly comprises luminol as a luminescent agent, 3- (-10-phenothiazinyl) propane-1-sodium sulfonate as a primary reinforcing agent, 4-morpholinopyridine as a secondary reinforcing agent and hydrogen peroxide as an oxidant, wherein the hypersensitivity ECL chemiluminescent reagent is formed by compounding specific components, can be matched with Horse Radish Peroxidase (HRP) for use in Western blot and EMSA experiments, has the characteristics of short reaction time, high sensitivity, strong anti-quenching capacity, stable result and the like, and can be stably stored for 1 year at the temperature of 4 ℃.)

一种超敏型ECL化学发光试剂

技术领域

本发明属于免疫分析领域，涉及一种超敏型ECL化学发光试剂。

背景技术

免疫印迹(Western blotting)技术是将凝胶电泳与固相免疫结合，对多种病毒抗体或抗原进行检测的一项分子生物学技术，具有分析容量大、敏感度高、特异性强等特点，目前已经广泛运用在医学各类学科研究中。该实验主要分三个阶段：第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，第二阶段为电转移，第三阶段为酶免疫定位。第三阶段的最后一步是酶标抗体与底物特异性反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，因此最后一步也是最关键的一步，直接影响分析结果的可靠性。

Western blot的显色方法主要有以下几种：①放射自显影；②底物化学发光ECL；③底物荧光ECF；④底物DAB显色。其中ECL发光操作比较简单，以其高灵敏度、低仪器价格、使用安全以及无放射污染等独特的优势，备受科研者青睐，已经成功应用于生命科学、地质分析、药物分析、临床检测和分子生物学等领域。ECL化学发光底物可与二抗上偶联的辣根过氧化物酶(HRP)发生化学反应发出荧光，从而通过X光片压片或其它合适荧光成像设备检测。目前HRP酶体系常用的发光底物包括以下四类：①酰肼类，如鲁米诺；②咪唑类，比较常用的是2,4,5-三苯基咪唑；③吖啶盐类，最为常用的是N,N-二甲基吖啶硝酸盐；④草酸盐类，其中最常用发光底物是鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物。其基本检测过程包括：二抗孵育结束后，配制ECL工作液，根据转印膜的大小，滴加ECL工作液到膜上，室温下孵育几分钟，然后将膜包被在两片保鲜膜中间，转入暗盒进行X-光胶片曝光，或放入成像仪内直接拍照。

鲁米诺体系的发光基本上为闪光型，不稳定、信号弱、灵敏度低、持续时间短、发光效率不高，因此实验结果常会出现显影效果不佳、发光强度不够、容易形成淬灭以及背景高等问题，严重限制了鲁米诺体系标记的化学发光免疫检测的应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是克服市场上常规ECL发光底物的上述缺陷，提供一种发光信号强、不易淬灭、灵敏度高且稳定性好的超敏型ECL化学发光试剂，该试剂可在Western blot和EMSA等实验中与HRP配套使用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种超敏型ECL化学发光试剂，包括发光剂溶液A和氧化剂溶液B，其中：

具体地，所述发光剂溶液A包含以下组分：

所述氧化溶液B包含以下组分：

醋酸(HAc) 1.75mM

过氧化氢(H₂O₂) 1mM-10mM

双蒸水(ddw) 1000ml

在上述方案的基础上，进一步优化各组分的浓度，确定最优浓度为：

发光剂溶液A：

氧化溶液B：

醋酸(HAc) 1.75mM

过氧化氢(H₂O₂) 9mM

双蒸水(ddw) 1000ml

所述3-(-10-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸钠，英文名称：3-(10’-phenothiazinyl)propane-1-sulfonate，CAS号为101199-38-6，分子式C₁₅H₁₄NNaO₃S₂，分子量为343.396；所述4-吗啉基吡啶，英文名称：4-morpholinopyridine，CAS号为2767-91-1，分子式为C₉H₁₂N₂O，分子量164.2。

本发明的原理为：

HRP+H₂O₂→HRP-Ⅰ (1)

HRP-Ⅰ+LH^-→HRP-Ⅱ+L^·- (2)

HRP-Ⅱ+LH^-→HRP+L^·- (3)

HRP-Ⅰ+E→HRP-Ⅱ+E^·- (4)

HRP-Ⅱ+E→HRP+E^·- (5)

E^·-+LH^-→E+L^·- (6)

L^·-→L+L^·- (7)

L+H₂O₂→LO₂ ^2- (8)

LO₂ ^2-→AP^2-* (9)

AP^2-*→AP^2-+hv (10)

HRP：辣根过氧化物酶，LH：鲁米诺阴离子，LO₂ ^2-：鲁米诺过氧化，AP^2-：3-氨基邻苯二甲酸二价阴离子，HRP-Ⅰ：氧化HRP中间体Ⅰ，L^·-：鲁米诺自由基阴离子，E：增强子，HRP-Ⅱ：氧化HRP中间体Ⅱ，L：重氮喹酮，E^·-：增强子基团，AP^2-*：3-氨基邻苯二甲酸二离子的激发态。

本发明的超敏型ECL发光试剂可以用于以HRP为酶促反应的检测系统。使用时发光剂溶液A和氧化剂溶液B的体积比为2：3～3：2。优选地，发光剂溶液A和氧化剂溶液B的体积比为1：1。

ECL超敏型发光试剂由发光剂溶液A和氧化剂溶液B组成。发光剂溶液A中含有发光剂鲁米诺和增强剂3-(-10-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸钠、4-吗啉基吡啶，氧化剂溶液B中含有氧化剂过氧化氢。由于底物的稳定性和灵敏度直接影响实验结果。因此本发明人以此为研究方向对ECL发光试剂的配方及浓度进行了研究和优化，较目前商品化ECL发光液有明显改进。主要表现在大大增加了光输出和持续时间，克服了发光信号强度弱和易猝灭的缺点，而且具有更高的灵敏性和稳定性。

性能测试：分别进行了灵敏度和稳定性研究。

本发明的有益效果：本发明研究得到的超敏型ECL化学发光试剂，4℃条件下可稳定保存1年，与市场上的ECL发光试剂进行对比，灵敏度更强，节约抗体，曝光30min后的显影结果仍然十分清晰，而且方便用户使用，操作快捷。

附图说明

图1为灵敏度梯度曲线。

图2为本发明与现有技术显影成像结果对照图，曝光时间为5min。

图3为本发明与现有技术显影成像结果对照图，曝光时间为30min。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述，以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中所用的材料和试剂均为市售产品，未具体注明实验条件的方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商建议的条件。本发明所述的“室温”是指实验操作间的温度，一般为25℃。

实施例1ECL发光试剂配制(最优)

缓冲液的配制：160mM Tris-HCL缓冲液，pH 9.0

具体配方如下：

发光溶液A：

氧化溶液B：

醋酸(HAc) 1.75mM

过氧化氢(H₂O₂) 9mM

双蒸水(ddw) 1000ml

A液(1000ml)配制方法：先将0.2657g鲁米诺，用3.5ml氢氧化钠(1M)溶解至溶液澄清透明，取0.206g SPTZ，0.2463g MORP，然后将鲁米诺，SPTZ，MORP溶于Tris-HCL缓冲液中，并以Tris-HCL缓冲液定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

B液(1000ml)配制方法：取0.9ml 30％过氧化氢溶液，0.1ml冰醋酸溶于水中，加水定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

实施例2ECL发光试剂配制(优化浓度一)

发光溶液A：

氧化溶液B：

醋酸(HAc) 1.75mM

过氧化氢(H₂O₂) 10mM

双蒸水(ddw) 1000ml

A液(1000ml)配制方法：先将0.2126g鲁米诺，用3ml氢氧化钠(1M)溶解至溶液澄清透明，取0.2403g SPTZ，0.1970g MORP，然后将鲁米诺，SPTZ，MORP溶于Tris-HCL缓冲液中，并以Tris-HCL缓冲液定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

B液(1000ml)配制方法：取1ml 30％过氧化氢溶液，0.1ml冰醋酸溶于水中，加水定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

实施例3ECL发光试剂配制(优化浓度二)

发光溶液A：

氧化溶液B：

醋酸(HAc) 1.75mM

过氧化氢(H₂O₂) 9mM

双蒸水(ddw) 1000ml

A液(1000ml)配制方法：先将0.2657g鲁米诺，用3.5ml氢氧化钠(1M)溶解至溶液澄清透明，取0.1716g SPTZ，0.1970g MORP，然后将鲁米诺，SPTZ，MORP溶于Tris-HCL缓冲液中，并以Tris-HCL缓冲液定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

B液(1000ml)配制方法：取0.9ml 30％过氧化氢溶液，0.1ml冰醋酸溶于水中，加水定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

实施例4ECL发光试剂配制(优化浓度三)

发光溶液A：

氧化溶液B：

醋酸(HAc) 1.75mM

过氧化氢(H₂O₂) 10mM

双蒸水(ddw) 1000ml

A液(1000ml)配制方法：先将0.0885g鲁米诺，用1ml氢氧化钠(1M)溶解至溶液澄清透明，取0.5494g SPTZ，0.2463g MORP，然后将鲁米诺，SPTZ，MORP溶于Tris-HCL缓冲液中，并以Tris-HCL缓冲液定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

B液(1000ml)配制方法：取1ml 30％过氧化氢溶液，0.1ml冰醋酸溶于水中，加水定容至1000ml，混匀，放于4℃保存。

实施例5灵敏度研究

将HRP用PBS进行梯度稀释(浓度从100ng/ml到0.001ng/ml)，然后向微孔板中加入10μl PBS或10μl HRP(各个检测浓度)，再在各个孔中加入实施例1中的ECL发光试剂，静置一段时间后检测发光信号强度(RLU)。进行三次检测，结果用S/N表示，如表1和附图1所示。从实验结果可以看出，伴随HRP浓度降低，发光强度信噪比也在不断下降，以S/N的对数作为纵坐标，HRP的浓度系为横坐标作图。

表1不同浓度HRP的S/N值

实施例6热稳定性研究

将实施例1中的A液和B液等量分装10份，各取5份分别置于4℃、37℃下保存，放置不同时间时间后取出测RLU，进行三次检测，结果用S/N表示。从表2可以看出，实施例1制备的ECL发光液具有较好的稳定性，ECL发光液于4℃保存2年后取出进行检测，依然很稳定。

表2热稳定性研究数据

实施例7将实施例1制备的超敏型ECL发光试剂应用于Western blot检测Bax蛋白，并与市场上同类产品对比结果，具体步骤如下：

S1，Western Blot主要试剂配制：

电泳液：Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，SDS 1g，双蒸水定容至1000ml。

转膜液：Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，无水甲醇200ml，双蒸水定容至1000ml.

TBST：Tris 2.42g，NaCl 32.44g，加双蒸水900ml搅拌至溶解，加入1.5ml tween20搅拌均匀后，双蒸水定容至1000ml。

S2，A549细胞蛋白提取：

胰蛋白酶消化细胞，弃掉培养皿中的培养液，PBS洗涤细胞，加入含有PMSF的裂解液裂解样本，冰上静置5min，3)4℃，10000×g离心10min，上清即为所得蛋白质抽提物。

S3，蛋白质定量：

(1)标准品制备：将0.5μg/μl的BSA蛋白标准液按照0、1、2、4、8、12、16、20μl体积分装于酶标板各孔，用PBS补足至20μl。

(2)蛋白质待测液制备：待测样本蛋白抽提物2μl与18μl PBS缓冲液混匀。

(3)BCA工作液总量＝(标准品样本个数+待测样本个数)×复孔数×200μl。

(4)根据计算出的BCA工作液总量，将A液与B液按照50:1的体积比，充分混匀。

(5)向各孔加入200μl BCA工作液，充分混匀，置于37℃反应20min。

(6)用酶标仪测定A570，记录数据。

(7)以标准蛋白浓度及对应吸光值绘制标准曲线，并通过回归方程计算样本蛋白浓度。

样本名称 吸光值(Abs) 蛋白浓度(μg/μl)

A549细胞 0.303 4.536

S4，SDS-PAGE：

(1)将清洗干净的玻璃板用滤纸吸干表面水分后，在室温下晾干，确认表面无水渍及灰尘后开始进行组装。长板在外，短板在内，底边对齐，并用楔子固定，底边封死，两面夹紧即可开始灌胶。

(2)先配制分离胶(胶浓度为13％)，灌胶前加入APS、TEMED，混匀，沿玻璃板一侧灌入，上层用水封好以促进凝胶聚合；待分离胶聚合后，倒掉水层，灌入配制好的浓缩胶(胶浓度为5％)，灌胶前加入APS，TEMED，最后用梳子封口，等待30min左右，即可拔出梳子，开始上样。

表3聚丙烯酰胺凝胶配方

(3)用5×Loading Buffer和PBS稀释蛋白样品，在沸水浴中煮沸5min，制成上样液备用。

(4)拔出梳子后，向电泳槽注入电泳液，分别加入10μl蛋白上样液及5μl蛋白Marker，连通电极，调整电流至最大，电压80V，恒压电泳2.5h。

S5，转膜：

(1)将配制好的转膜液提前放入4℃冰箱预冷，电泳即将结束时，将转膜用的滤纸、海绵等浸入转膜液中充分浸湿。

(2)裁取适当大小的PVDF膜，用无水甲醇浸湿后，同样浸入转膜液中，摇床摇动。

(3)制备“三明治”结构，即电泳结束后，将玻璃板取出，用刀片起开，将凝胶的浓缩胶部分及分离胶的底部切掉，将剩余的整块胶剥落至装有转印缓冲液的容器内，浸泡10min；在转印夹负极一侧先铺一层海绵，再铺5层滤纸，然后铺入凝胶，之后是PVDF膜，此时的膜的正面应与凝胶接触，最后在PVDF的上面铺上5层滤纸和一层海绵；形成“海绵-滤纸-膜-胶-滤纸-海绵”的“三明治”形状。

(4)“三明治”铺好后，将转印夹夹紧，***转印槽内，注入足量的转印缓冲液，接通电极，调整电流至最大，电压80V转印1.5h。

S6，封闭：

用TBST缓冲液配制5％(M/V)脱脂奶粉备用，转膜结束后取出PVDF膜，浸入TBST中，摇床摇动5min，倒掉TBST，将PVDF膜浸入脱脂奶粉溶液中，摇床缓慢摇动1h。

S7，孵育一抗和二抗：

用5％(M/V)脱脂奶粉制备一抗工作液，抗体工作液倒入杂交袋中，放入封闭好的PVDF膜，封口，4℃过夜孵育；孵育一抗后的PVDF膜从杂交袋中取出，浸入TBST中，摇床摇动5min，重复清洗4次；制备二抗工作液，然后倒入杂交袋中，放入漂洗好的PVDF膜，封口，37℃孵育45min。

S8，ECL底物发光

(1)孵育二抗后的PVDF膜从杂交袋中取出，浸入TBST中，摇床摇动5min，重复此步骤6次。

(2)将实施例1配制的ECL化学发光试剂用于实验，市面上购买的A公司高灵敏ECL发光试剂、B公司ECL Plus超敏发光液用于对比。

(3)台面上平铺三张保鲜膜，将PVDF背面的水分用滤纸吸干，平铺到保鲜膜上，分别洒上三种ECL发光液，静置反应5min。

(4)另取三张保鲜膜分别覆盖其上，用玻璃棒赶出多余液体，转入暗盒，在暗室进行曝光。

(5)上述实验例与对比例相比，除采用的发光试剂不同以外，其他实验条件完全相同。其中结果见图2。

图2和图3可以看出，在相同蛋白上样量的情况下，实施例1制备的超敏型ECL化学发光试剂比市售ECL化学发光试剂的发光信号值更强，显影图像更好，且曝光后影像持续的时间更长。

以上实施例仅陈述了本发明的几种实施方式，且描述较为具体和详细，但并不能理解为对发明专利范围的限制。应该指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的情况下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此本发明专利的保护范围应该以所附权利要求为准。