阅读说明：本技术 4-苯基取代的异噁唑类化合物及其在抗组胺药物中的用途 (4-phenyl substituted isoxazole compound and application thereof in antihistamine medicine ) 是由 王兴理 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了如式I所示的4-苯基取代的异噁唑类化合物或其药学上可接受的盐,<Image he="401" wi="391" file="DDA0002208114380000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>通过对所述化合物的H<Sub>3</Sub>受体拮抗活性的测定、小鼠机械性痛觉阈值测定及醋酸致小鼠扭体试验发现,所述化合物具有抑制组胺H<Sub>3</Sub>受体的活性,能够缓解机械性刺激引起的疼痛和化学性刺激引起的疼痛。(The invention discloses a 4-phenyl substituted isoxazole compound shown in a formula I or pharmaceutically acceptable salt thereof, By H on said compounds 3 The compounds have histamine H inhibiting effect as shown in the measurement of receptor antagonistic activity, the measurement of mechanical pain threshold of mice and acetic acid induced writhing test of mice 3 The activity of the receptor can relieve pain caused by mechanical stimulation and pain caused by chemical stimulation.)

4-苯基取代的异噁唑类化合物及其在抗组胺药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及4-苯基取代的异噁唑类化合物及其在抗组胺药物中的用途。

背景技术

目前已经发现4种组胺受体，即H₁、H₂、H₃、H₄受体，它们均为G蛋白偶联受体，主要广泛分布在中枢和外周神经系统，参与机体多种生理功能的调节。H₁受体多分布于毛细血管、支气管、肠道平滑肌，当H₁受体激活时，可引起过敏性荨麻疹、血管神经水肿伴随的瘙痒、喉痉挛及支气管痉挛等。H₂受体主要分布于胃壁细胞及血管平滑肌细胞，具有促进胃酸分泌及毛细血管扩张的作用。H₃受体主要表达于脑部各区域，在神经末梢和一些非神经细胞上也有表达，主要通过抑制多种神经介质的分泌来调节神经系统功能。H₄受体与H₃受体有较高的同源性，但在脑中不表达或弱表达，主要分布于外周组织，高度表达于炎症反应相关的组织和造血细胞中。

在组胺的4种类型受体中，H₁受体与H₂受体的研究最为深入。H₁受体拮抗剂如特那非定、阿司咪唑等作为经典的抗过敏药广泛应用于临床；H₂受体拮抗剂如雷尼替丁、西咪替丁等用于治疗胃酸分泌过多。H₃受体自1999年成功克隆以来，研究热点主要集中在中枢神经系统方面，如抗阿尔茨海默病研究，而对外周组织中的研究较少。研究发现一些痛觉传导纤维上存在H₃受体，激活位于Aδ和C纤维伤害性感受器脊髓末端的H₃受体可抑制机械性或化学性伤害的感受，表明H₃受体可能参与痛觉的神经传导。

目前临床常用的镇痛药物分为麻醉性镇痛药和非麻醉性镇痛药。麻醉性镇痛药有阿片生物碱类的***、可待因；半合成***样镇痛药丁丙诺啡；以及合成阿片类镇痛药。非麻醉性镇痛药主要有4中结构类型，包括苯哌啶类(如芬太尼等)、二苯甲烷类(如***等)、***烷类(如左啡诺等)、苯并***烷类(如喷他佐辛等)。这些常见的镇痛药不良反应严重，常见呼吸抑制、支气管痉挛，有些药物成瘾性严重，严重制约在临床中的应用。

目前关于H₃受体拮抗剂在疼痛方面的研究均处于临床前的早期研究阶段，开发新的组胺H₃受体拮抗剂类镇痛药物具有非常重要的研究意义和开发价值，而关于本发明提到的4-苯基取代的异噁唑类化合物在镇痛方面的研究至今还没有报道。

发明内容

本发明提供了一种4-苯基取代的异噁唑类化合物，其结构如式I所示：其中Ar选自3-三氟甲基-6-喹啉基、6-喹啉基、3-氟-6-喹啉基、3-氰基-6-喹啉基、3-硝基-6-喹啉基、3-甲氧基-6-喹啉基、3-甲基-6-喹啉基、3-甲酸乙酯基-6-喹啉基、3-甲酸甲酯基-6-喹啉基、2-三氟甲基-6-喹啉基、2-氟-6-喹啉基、2-氰基-6-喹啉基、2-硝基-6-喹啉基、2-甲氧基-6-喹啉基、2-甲基-6-喹啉基、2-甲酸乙酯基-6-喹啉基、2-甲酸甲酯基-6-喹啉基、4-三氟甲基-6-喹啉基、4-氟-6-喹啉基、4-氰基-6-喹啉基、4-硝基-6-喹啉基、4-甲基-6-喹啉基、4-甲氧基-6-喹啉基、4-甲酸乙酯基-6-喹啉基、4-甲酸甲酯基-6-喹啉基、2-甲基苯并噻吩-5-基、3-甲基苯并噻吩-5-基、2-氟苯并噻吩-5-基、3-氟苯并噻吩-5-基、2-氰基苯并噻吩-5-基、3-氰基苯并噻吩-5-基、2-硝基苯并噻吩-5-基、3-硝基苯并噻吩-5-基、2-甲氧基苯并噻吩-5-基、3-甲氧基苯并噻吩-5-基。

进一步地，所述4-苯基取代的异噁唑类化合物式I药学上可接受的盐。

进一步地，所述4-苯基取代的异噁唑类化合物式I选自化合物1-35，结构如下所示：

本发明还提供了所述4-苯基取代的异噁唑类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征是3-溴-5-甲氧基苯硼酸(式II)与N-甲基亚胺二乙酸(MIDA)以DMF为溶剂加热反应(步骤一)得到中间体1；所得到的中间体1与3,5-二甲基异唑-4-硼酸在Pd(dppf)Cl₂.CH₂Cl₂和K₃PO₄作用下以THF/H₂O为混合溶剂，通过无氧反应(步骤二)得到中间体2；所得到的中间体2与卤代芳烃在Pd(dppf)Cl₂.CH₂Cl₂和碱作用下以DME/H₂O为混合溶剂，通过无氧反应(步骤三)，最终得到式I结构产物。反应过程如下：

进一步地，制备中间体1(步骤一)所采用的温度范围为50℃-153℃，优选90℃-100℃。

进一步地，制备中间体2(步骤二)所采用的THF/H₂O混合溶剂的比例为100:1–50:1，优选90:1–70:1。

进一步地，制备式I结构产物(步骤三)所采碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、磷酸钾、三乙胺、叔丁醇钾、叔丁醇钠、甲醇钠、四丁基氟化铵、氟化钾、氟化铯、氢氧化铯、叔丁胺中的一种。

本发明还提供了所述化合物的H₃受体拮抗活性的测定、小鼠机械性痛觉阈值测定及醋酸致小鼠扭体试验，发现本发明所述化合物具有抑制组胺H₃受体的活性，能够缓解机械性刺激引起的疼痛和化学性刺激引起的疼痛。

附图说明

图1是本发明化合物对小鼠机械性痛觉阈值的测定实验结果。

具体实施方式

实施例1：中间体1的合成

圆底烧瓶中加入3-溴-5-甲氧基苯硼酸(1当量)、N-甲基亚胺二乙酸(MIDA，1.05当量)和DMF(200mL)，搅拌均匀后油浴100℃加热，反应过夜。TLC监测反应完全后冷却，浓缩溶剂。残余物滴加***(50mL)，产生白色固体。抽滤，滤饼***淋洗后晾干即为中间体1化合物。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.15(m,2H),6.96(t,1H,J＝1.0Hz),4.34(d,2H,J＝17.2Hz),4.15(d,2H,J＝17.2Hz),3.79(s,3H),2.57(s,3H).

实施例2：中间体2的合成

封管N₂吹5min后迅速加入中间体1(1当量)、3,5-二甲基异唑-4-硼酸(1.1当量)、Pd(dppf)Cl₂.CH₂Cl₂(5mol％)、无水K₃PO₄(4当量)和THF/H₂O(80：1)溶液，N₂吹5min后迅速旋紧封管盖。反应液90℃加热反应4h，冷却至室温后加入饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取，合并后的有机相无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后残余物柱层析纯化得到中间体2。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.13(s,2H),7.36(dd,1H,J＝2.4,1.6Hz),7.33(m,1H),6.94(dd,1H,J＝2.5,1.6Hz),3.79(s,3H),2.39(s,3H),2.22(s,3H).HRMS for C₁₂H₁₄B₂O₄:Calculated:244.1078；Found:244.1078.

实施例3：化合物1的合成

封管N₂吹5min后迅速加入中间体2(1.1当量)、6-溴-3-三氟甲基喹啉(1当量)、Pd(dppf)Cl₂.CH₂Cl₂(5mol％)、碳酸钠(5当量)和乙二醇二甲醚/H₂O(4：1)溶液，N₂吹5min后迅速旋紧封管盖。反应液120℃加热反应过夜，冷却至室温后加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯萃取，合并后的有机相无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后残余物柱层析纯化得到化合物1。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.12(d,J＝2.1Hz,1H),8.42(s,1H),8.16(d,J＝8.7Hz,1H),7.88–7.84(m,2H),7.66(dd,1H,J＝2.4,1.6Hz),7.63(m,1H),7.14(dd,1H,J＝2.5,1.6Hz),3.99(s,3H),2.49(s,3H),2.32(s,3H).HRMS for C₂₂H₁₇BF₃NO₂:Calculated:395.1304；Found:395.1303.

试验例1：H₃受体拮抗活性的测定

1、细胞培养和稳定表达细胞株的构建：HEK293和CHO细胞均用DMEM培养基加10％FBS进行培养。细胞转染或共转染受体表达载体和报告基因表达载体用转染试剂Lipofectamine2000。转染24h后，加入G418和HEK293细胞为800μg/mL，CHO细胞为600μg/mL，3-4天换一次含G418的新鲜培养基。2周后，可见明显的细胞群落，挑选20-30个细胞群落扩增后，用功能性实验或流式细胞分析受体细胞表面表达及报告基因的效果，把高表达细胞株或功能测试良好的细胞株扩增后冻存，用于药物筛选。

2、细胞内cAMP浓度检测：在组胺H₃受体和CRE-Luciferase稳定表达细胞株的细胞中加入Foskolin(终浓度10μM)和不同浓度的化合物1-35，培养5h后裂解细胞检测荧光素酶活性，活性大小对应cAMP浓度高低。

3、荧光素酶活性的测定：细胞水平高通量筛选模型和用cAMP响应元件(CRE)控制下的荧光素酶表达载体检测cAMP，最后均需测定荧光素酶活性。荧光素酶活性的测定采用Promega试剂盒，按试剂盒要求在反应结束后加入溶胞缓冲液，立即用Topcounter或化学发光仪读出相对光强度RLU值。试验结果见表1。

表1化合物1-35拮抗组胺H₃受体活性

试验结果显示，化合物1、3、6、10、11、14、19、23、26、28的IC₅₀值均小于15nM，表现出优秀的抗组胺H₃受体活性的作用。

试验例2：小鼠机械性痛觉阈值(PWT)测定

用von Frey纤维丝推算50％PWT。50％PWT的测定是指多次机械刺激能够引起50％缩足反应的机械力度。本试验例使用一系列的标准化的von Frey纤维，采用up and down的方法测定小鼠50％缩足阈值。依次用0.02、0.04、0.08、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0的力度刺激后肢。将有机玻璃箱置于金属筛网上，待小鼠在有机玻璃箱中适应30min后，用vonFrey纤维丝垂直刺激小鼠后肢足底中部。持续时间≤4s，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应。开始使用0.6的力度刺激，若没有阳性反应，则选择上一个力度1.0刺激后足；若有阳性反应，则选择其下一个力度0.4刺激后足，以此类推，在出现一次与前一次不同的反应时，继续依次刺激4次，一共6次，即完成50％缩足阈值的测定。若需要使用的力度大于2.0或小于0.02，该阈值则直接记为2.0或0.02，每次刺激间隔30s。在试验中尽量保持一致的测定方法，如力度方向，加力速度和纤维丝弯曲程度，保持力的稳定性，里的撤离速度等。另外，需对小鼠的反应判断标准尽量一致。50％缩足阈值的计算使用公式：50％缩足阈值＝10^{log (X)+κδ}(X为最后刺激使用的力度；κ为不同刺激方式的系数，在系数表中查找；δ指各刺激力度相邻距离间距的平均数，此处为0.224)。

检测机械缩足阈值20min后，确定基础阈值水平，然后按照每公斤体重5.0mg剂量的化合物1口服灌胃给药，持续8h检测小鼠机械缩足阈值。试验结果见图1。

试验结果显示，化合物1灌胃60min后，小鼠机械性痛觉阈值开始增加，200min达到高峰，350min基本恢复到基础水平。化合物1表现出优异的抗机械性痛觉的活性，镇痛活性可达3h以上。

试验例3：醋酸致小鼠扭体试验

昆明种小鼠适应性饲养后随即分为5组，每组10只。分别为灌胃空白对照组(给予等量生理盐水)、阳性对照药组(布洛芬，130mg/kg)、化合物1组(50mg/kg)、化合物1组(100mg/kg)、化合物1组(150mg/kg)。给药后2.5h，腹腔注射0.6％的醋酸溶液，每只小鼠0.2mL，观察注射15min内出现扭体反应的次数。试验结果见表2。

表2不同剂量的化合物1对醋酸致痛小鼠的镇痛作用

试验结果显示，相对于空白对照组，不同剂量的化合物1均可以不同程度的减少小鼠扭体的次数，并呈剂量依赖性减少。100mg/kg的化合物1对小鼠扭体次数的减少作用即与130mg/kg阳性对照药相当。