阅读说明：本技术 一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的制备方法及其应用 (Preparation method and application of bioluminescent probe for detecting pyroglutamic acid aminopeptidase ) 是由 柯博文 李敏勇 陈新新 胡世龙 康婷 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种式I所示的化合物。本发明还公开了式I所示的化合物在制备生物发光探针,特别是检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针中的用途。本发明所提供的探针对目标产物表现出了良好的灵敏性、选择性、生物相容性。本发明提供的探针不仅可以在体外环境中以良好的线性半定量检测焦谷氨酸氨肽酶,还具备活体水平可视化检测内源性焦谷氨酸氨肽酶的能力。本发明探针的制备方法简单、收率高、成本低,在底物检测方面效率高、专一性强、快速、灵敏,并且可同时实现定性、半定量检测和分析焦谷氨酸氨肽酶,易于推广和应用。<Image he="254" wi="700" file="DDA0002196271760000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses a compound shown as a formula I. The invention also discloses application of the compound shown in the formula I in preparing a bioluminescent probe, in particular to a bioluminescent probe for detecting pyroglutamic acid aminopeptidase. The probe provided by the invention has good sensitivity, selectivity and biocompatibility on a target product. The probe provided by the invention not only can be used for detecting pyroglutamic acid aminopeptidase in an in vitro environment in a good linear semi-quantitative manner, but also has the capability of detecting endogenous pyroglutamic acid aminopeptidase in a living body level visualization manner. The probe of the invention has the advantages of simple preparation method, high yield, low cost, high efficiency in substrate detection, strong specificity, rapidness and sensitivity, can realize qualitative and semi-quantitative detection and analysis of pyroglutamic acid aminopeptidase simultaneously, and is easy to popularize and apply.)

一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的制备方法及其 应用

技术领域

本发明具体涉及一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的制备方法及其应用。

背景技术

生物发光是一种自然界普遍存在的，依赖于生物正常生命活动的化学发光。其本质是酶和底物之间的相互作用，经过一系列生物反应产生化学能，并以光能的形式释放出来。生物发光成像(Bioluminescence imaging)是利用生物体内发生酶催化的化学反应而产生光子的原理进行的。最常见的生物发光体系是萤火虫萤光素酶(Luciferase)-萤光素(Luciferin)系统，其实质是萤火虫萤光素酶在能量(ATP)及氧存在的条件下催化底物萤光素，发生电子跃迁，分子由激发态回到稳态时产生光子，并释放氧化性萤光素(Oxyluciferin)。生物发光成像技术凭借其高灵敏性、高生物相容性以及可视化等特点已经成为很重要的检测手段，被广泛应用于各个领域。

焦谷氨酸氨肽酶是使蛋白质或肽(包括一些重要的抗炎蛋白)的氨基末端的L-焦谷氨酸残基特异地释放出来的酶，已知其在多种动物的脑、肺、血清或脑垂体以及植物或微生物中广泛存在。先前的研究表明，焦谷氨酸氨肽酶与细胞中的免疫应答有关，然而，焦谷氨酸氨肽酶是否参与体内炎症反应并且作为新的炎症细胞因子还不清楚，而在炎症过程中检测细胞、生物体内焦谷氨酸氨肽酶变化和分布将有助于更好地解释这一问题。但是，目前还找到关于解决这一问题的相关报告。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种具有高选择性和超灵敏度的生物发光探针，该探针对焦谷氨酸氨肽酶表现出优越的选择性和响应性，并且其还适用于焦谷氨酸氨肽酶在生物成像领域的研究。

本发明的目的是提供一种检测生物体内焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针及制备方法和应用，解决现有焦谷氨酸氨肽酶光学探针选择性差、灵敏度低和条件苛刻的问题，以实现高选择性、高灵敏度地定性、定量分析检测焦谷氨酸氨肽酶。

本发明提供了一种化合物，所述化合物的结构如式I所示：

其中，X为S、Se或NH；R为H或C_1-3烷基；Y为S、Se或NH。

进一步地，所述化合物的结构如式CX-1所示：

本发明还提供了式CX-1所示化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

进一步地，所述方法包括以下具体步骤：

(1)化合物1和化合物2在有机溶剂中进行反应，制备化合物3；

(2)化合物3和三氟乙酸在有机溶剂中进行反应，制备化合物4；

(3)化合物4、D-半胱氨酸盐酸盐在有机溶剂中反应，即得CX-1。

进一步地，步骤(1)中，所述化合物1和化合物2的摩尔比为1：(0.5-1.5)，优选为1：1；所述有机溶剂为乙腈、醇类溶剂、或DMF，优选为乙腈；所述反应温度为0～25℃，反应时间为3～9h，优选地，所述反应温度为25℃，反应时间为5h；所述反应是在惰性气体保护下进行的，所述反应是在催化剂的作用下进行的，优选地，所述催化剂为N-甲基吗啉和氯甲酸异丁酯，更优选地，所述化合物2与N-甲基吗啉和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1：1：1。

进一步地，步骤(2)中，所述化合物3和三氟乙酸的摩尔比为1：(2～4)，优选为1：3；所述有机溶剂为醇类溶剂、二氯甲烷或乙腈，优选为二氯甲烷；所述反应温度为20～60℃，反应时间为2～6h，优选地，所述反应温度为40℃，反应时间为3h。

进一步地，步骤(3)中，所述化合物4和D-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1：(1～3)，优选为1：2；所述溶剂为二氯甲烷、醇类溶剂、或醇类溶剂与水的混合溶剂，优选为甲醇与水的混合溶剂；所述反应是在无机碱的存在下进行的，优选地，所述无机碱为碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠或碳酸氢钠，更优选地，所述化合物4与无机碱的摩尔比为1：(2～3)；所述反应温度为20～50℃，反应时间为1～5h，优选地，所述反应温度为25℃，反应时间为1h。

本发明还提供了上述式I和式CX-1所示化合物在制备生物发光探针中的用途。

进一步地，所述生物发光探针为检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针。

进一步地，所述生物发光探针能在体内和/或体外检测焦谷氨酸氨肽酶；

和/或，所述生物发光探针能够实现活体中内源性焦谷氨酸氨肽酶的生物发光成像；

和/或，所述生物发光探针能在pH＝6～10的水溶液体系里进行检测。

实验结果表明，本发明以Boc-L-焦谷氨酰胺作为焦谷氨酸氨肽酶的特异性识别基团，合成了一种可用于检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针CX-1，并且对目标产物表现出了良好的灵敏性、选择性、生物相容性。

本发明提供的探针CX-1不仅可以在体外环境中以良好的线性半定量检测焦谷氨酸氨肽酶，而且还具备活体水平可视化检测内源性焦谷氨酸氨肽酶的能力。本发明探针CX-1的制备方法简单、收率高、成本低，在底物检测方面效率高、专一性强、快速、灵敏，并且可同时实现定性、半定量检测和分析焦谷氨酸氨肽酶，易于推广和应用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1所制备的一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的核磁共振氢谱；

图2为实施例1所制备的一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的核磁共振碳谱；

图3为本发明探针CX-1在体外检测中，随焦谷氨酸氨肽酶浓度的变化而变化的生物发光图；

图4为本发明探针的选择性检测结果图；

图5为空白对照组(Control)和实验组(D-Gal诱导急性肝脏炎症模型)小鼠生物发光图；

图6为定量表示小鼠(尾部除外)的总光子通量(p/sec/cm²/sr)数据以mean±SD表示(n＝3)；

图7为定量表示小鼠(尾部除外)的每个时刻光子通量(p/sec/cm²/sr)数据以mean±SD表示(n＝3)。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1本发明生物发光探针CX-1的制备

按照以下合成路线，制得生物发光探针CX-1：

(1)将Boc-L-焦谷氨酸(3.0mmol，500mg)溶于10mL无水乙腈中，在氮气保护下，滴加5mL无水乙腈溶解的N-甲基吗啉(3.0mmol，245μL)、氯甲酸异丁酯(3.0mmol，285μL)、2-氰基-6-氨基苯并噻唑(3.0mmol，405mg)在25℃反应5h，然后旋干，萃取，柱层析分离(洗脱剂为体积比为1：5的石油醚和乙酸乙酯)，得到固体粉末中间体3，¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.81(s,1H),8.76(d,J＝1.8Hz,1H),8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.78(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),4.73(dd,J＝9.0,3.5Hz,1H),2.50–2.26(m,3H),1.96(ddd,J＝17.4,8.4,4.3Hz,1H),1.36(s,9H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ174.02,171.11,149.40,148.30,139.70,137.23,135.81,125.40,121.22,114.01,112.08,82.45,60.39,31.52,27.99,22.00.产率为88％，mp：160.4-162.4℃。

(2)将中间体3(1.0mmol，500mg)溶于20mL二氯甲烷中，滴加用3mL二氯甲烷稀释的三氟乙酸(3.0mmol，1.5mL)溶液，在40℃条件下反应3h，旋干，萃取，柱层析分离(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇(12：1，v/v))，得到固体粉末中间体4，¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.56(s,1H),8.76(d,J＝1.9Hz,1H),8.21(d,J＝9.0Hz,1H),7.95(s,1H),7.79(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),4.27(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),2.39(ddd,J＝16.0,12.5,9.0Hz,1H),2.30–2.11(m,2H),2.03(ddd,J＝13.5,9.5,4.9Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ177.96,172.48,148.23,139.75,137.17,135.73,125.31,121.35,114.04,112.11,56.95,29.66,25.80.产率为80％，mp：258.8-259.2℃。

(3)将中间体4(1.0mmol，500mg)溶于10mL二氯甲烷、10mL无水甲醇中，在氮气保护下，滴加用无水甲醇：蒸馏水(1：1～2)的混合溶剂溶解的碳酸钾(2.7mmol,370mg)、D-半胱氨酸盐酸盐(2.0mmol，450mg)，在25℃条件下反应，反应时间为1h，旋干，用1mol盐酸调pH至1析出固体，过滤，得到目标产物固体粉末探针CX-1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.59(s,1H),8.65(dd,J＝5.1,2.0Hz,1H),8.10(t,J＝9.3Hz,1H),7.96(s,1H),7.71(dt,J＝8.9,2.5Hz,1H),5.44(dd,J＝9.8,8.3Hz,1H),4.29(dd,J＝8.6,4.1Hz,1H),3.79(dd,J＝11.2,9.9Hz,1H),3.70(dd,J＝11.3,8.3Hz,1H),2.44–2.32(m,1H),2.29–2.11(m,2H),2.08–1.99(m,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ177.97,172.31,171.58,164.89,159.69,149.20,138.67,136.74,124.72,120.23,112.21,78.58,56.90,35.23,29.68,25.82.产率为82％，mp：170.3-172.5℃。

以下通过实验例的方式来验证本发明的有益效果：

如下实验例1～实验例5采用：

实验例1探针CX-1活性的体外检测

在黑色96孔板中，加入100μM的本发明探针CX-1、不同浓度梯度焦谷氨酸氨肽酶溶液(具体浓度详见图3)，体积各100uL，37℃下孵育，孵育时间为30min，再加入50μL含ATP的萤光素酶混合溶液(ATP1.1mg/ml，荧光素酶20ug/ml)，每个浓度做3个复孔，随即在活体成像仪下成像。

结果如图3所示，随着焦谷氨酸氨肽酶浓度的增加，生物发光强度逐渐增强。在体外检测中，生物发光强度与焦谷氨酸氨肽酶在一定浓度范围内呈现良好的线性关系。

上述结果说明，本发明探针CX-1具有较好的检测灵敏性，可以对生物样本中mU级别的焦谷氨酸氨肽酶进行半定量检测。

本发明以Boc-L-焦谷氨酰胺作为焦谷氨酸氨肽酶的特异性识别基团，荧光素酶底物为发光基团，合成了一种可用于检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针CX-1，该生物发光探针的化学制备方法简单、收率高、成本低。焦谷氨酸氨肽酶可特异性识别该生物发光探针中的酰胺基团，从而使酰胺键断裂释放出氨基荧光素，在ATP、萤光素酶、Mg²⁺等作用下产生强生物发光，并且生物发光强度与焦谷氨酸氨肽酶浓度在一定范围内呈优良的线性关系，可以定性、半定量检测焦谷氨酸氨肽酶。

实验例2探针的选择性检测

在黑色96孔板中，加入100uL的100μM的探针CX-1溶液和不同的分析物溶液(Blank、KCl、ZnCl₂、CaCl₂、MgCl₂、CuCl₂、NaClO、Glucose、Cys、GSH、Try、Ala、Thr、Lys、Ser、Asp、Vitamin C、Glu、Esterase、Trypsin、Thrombin、V8、PGP(焦谷氨酸氨肽酶)；体积各100uL，100μM)在37℃孵育30min，每孔加入50μL含ATP的萤光素酶溶液(ATP1.1mg/ml，荧光素酶20ug/ml)，立即在活体成像仪下成像。

结果如图4所示，在各种体内酶和离子化合物中，只有焦谷氨酸氨肽酶引起了较强的生物发光，其他体内酶和离子化合物几乎没有产生明显的生物发光信号。

实验结果说明，探针CX-1可以不受其他物质干扰，特异性选择检测焦谷氨酸氨肽酶，本发明探针CX-1的特异性良好。

实验例3体内检测实验

实验动物采用萤光素酶转染的转基因小鼠，取三只健康成年转基因雄性小鼠，将其用异氟烷进行麻醉，空白对照组腹腔注射100μL PBS溶液，实验组腹腔注射D-Gal(400mg/kg)溶液。两组小鼠分别尾静脉注射100μL探针CX-1溶液(100μM)，立即在活体成像仪下拍照，时间记为0min，之后每隔一分钟拍一次，直到生物发光强度下降为止，取小鼠除尾部以外的所有发光部分总强度作图。

结果如图5所示，实验组进行小动物活体成像，即可观察到较强的生物发光信号，尾静脉注射探针10min后生物发光强度达到最大，之后趋于下降。与空白对照组相比，注射了D-Gal的小鼠，其生物发光强度明显高于空白对照组，具有显著性统计学差异。并且由于该实验是在小鼠麻醉的状态下进行的，因此我们还可以观察到该探针在体内的变化情况，且不影响小鼠实验中、实验后的正常生命状态。

实验结果说明，在动物体内，本发明探针CX-可以检测到焦谷氨酸氨肽酶的存在，且显像明显，用于体内检测的效果优良。

实验例4体内检测

实验动物采用萤光素酶转染的转基因小鼠，把小鼠分为2组，分别腹腔注射100μLPBS溶液、100μL D-Gal(400mg/kg)溶液，2组小鼠分别尾静脉注射100μL探针CX-1溶液(100μM)，立即在活体成像仪下拍照，取小鼠除尾部以外的所有发光部分总强度作图。

结果如图6所示，在动物体内，0-15min内诱导炎症组小鼠生物发光强度明显高于空白对照组小鼠，说明该探针可以用于实时检测活体内焦谷氨酸氨肽酶的动态变化。

实验结果说明，在动物体内，本发明探针CX-可以检测到焦谷氨酸氨肽酶的存在，且显像明显，用于体内检测的效果优良。

实验例5：体内动态变化检测

实验动物采用萤光素酶转染的转基因小鼠，把小鼠分为4组，分别腹腔注射100μLPBS溶液、100μL D-Gal(100mg/kg)溶液、100μL D-Gal(300mg/kg)溶液、100μL D-Gal(400mg/kg)溶液，4组小鼠分别尾静脉注射100μL探针CX-1溶液(100μM)，立即在活体成像仪下拍照，取小鼠除尾部以外的所有发光部分总强度作图。

结果如图7所示，在动物体内，生物发光强度和注射D-Gal的浓度呈现依赖性，说明该探针可以用于活体内检测焦谷氨酸氨肽酶的动态变化。

实验结果说明，在动物体内，本发明探针CX-可以检测到焦谷氨酸氨肽酶的存在，且生物发光强度和注射D-Gal的浓度呈现依赖性，因而可以用于活体内检测焦谷氨酸氨肽酶的动态变化。

综上，本发明探针CX-1在底物检测方面表现出良好的灵敏性、特异性，可以用于体内体外定性、半定量检测焦谷氨酸氨肽酶，应用前景优良。上述结果说明，探针与焦谷氨酸氨肽酶反应较快，产生的生物发光信号较强且比较稳定，因此，本发明的探针还能够实现活体中内源性焦谷氨酸氨肽酶的生物发光成像。