阅读说明：本技术 一种小分子乏氧探针合成方法 (Synthesis method of small-molecule hypoxic probe ) 是由 张水兴 黄文慧 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小分子乏氧探针合成方法,小分子乏氧探针的合成首先将IRDye800CW NHS加入100ul二甲基甲酰胺溶解,取等摩尔量小分子靶向剂加入染料溶液内,按1：6的当量加入三乙胺作为反应催化剂,置于磁力搅拌器上,转速300rmp,约2小时反应结束,将产物加入超纯水至5ml,置于-80°冰箱过夜第二天在冻干机冻干,待12h后停止冻干,收集产物,本发明从体外细胞水平到体内皮下肿瘤模型,从活体近红外光学2D成像到光声3D实时成像,从宏观成像到微观成像证实了,CAIX-800能够高效、特异性地结合CAIX受体从而靶向乏氧的5-8F肿瘤,可以为实现后续的原位及转移模型的乏氧成像研究提供有力保障。(The invention discloses a synthesis method of a micromolecular hypoxic probe, which comprises the steps of firstly adding IRDye800CW NHS into 100ul of dimethylformamide for dissolving, adding equimolar micromolecular targeting agent into a dye solution, and mixing the components according to the weight ratio of 1: adding triethylamine as a reaction catalyst into an equivalent of 6, placing the mixture on a magnetic stirrer, rotating at the speed of 300rmp, finishing the reaction for about 2 hours, adding ultrapure water into the product to 5ml, placing the mixture in a-80-DEG refrigerator overnight for the second day, freeze-drying the mixture in a freeze dryer, stopping freeze-drying after 12 hours, and collecting the product.)

一种小分子乏氧探针合成方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及一种小分子乏氧探针合成方法。

背景技术

近年来，随着分子影像的突破性进展，这些成像新技术通过引入能够与体内特异性靶点结合的分子成像探针，利用一种或者多种成像技术，如放射性核素成像、磁共振成像、光学成像、光声成像甚至多模态融合成像，实现了生物体内分子水平的直观成像。新型的影像技术将传统的有创性离体化验转变成基于影像的无创性活体检测，同时能获取基于细胞和分子水平的、精确和量化的三维空间信息，从而使无创实时三维定量肿瘤乏氧成为可能。

发明内容

本发明旨在提供一种小分子乏氧探针合成方法。

一种小分子乏氧探针合成方法，标记荧光染料在室温下全程避光操作，首先，将IRDye800CW NHS加入100ul二甲基甲酰胺溶解，取等摩尔量小分子靶向剂加入染料溶液内，按1：6的当量加入三乙胺作为反应催化剂，置于磁力搅拌器上，转速300rmp，约2小时反应结束，将产物加入超纯水至5ml，置于-80°冰箱过夜第二天在冻干机冻干，待12h后停止冻干，收集产物。

作为本发明进一步的方案：小分子乏氧探针的靶向摄取方法，具体包括以下步骤：

1)探针孵育：用新鲜完全培养基溶液稀释探针浓度为50nM；将共聚焦培养皿中原培养基弃去，加入探针溶液，并置于细胞孵育箱中孵育4小时后，弃去皿内溶液，用PBS溶液清洗3次；

2)多聚甲醛固定：1ml移液枪吸取4％多聚甲醛500μL，覆盖细胞表面进行细胞固定，并放入细胞孵育箱15分钟。去除多聚甲醛溶液，用PBS溶液小心清洗细胞表面3次；

3)Triton X-100破膜：加入0.1％Triton X-100/PBS溶液200μL，室温下静置3-5分钟。去除溶液后加入PBS清洗3次；

4)牛血清白蛋白(BSA)封闭：加入0.01g/ml BSA 500μL，与细胞共孵育30分钟，再次用PBS清洗3次；

5)细胞骨架染色：加入100nM罗丹明-鬼笔环肽工作液200μL染细胞骨架，静置半个小时；PBS清洗3次；

6)细胞核染色：加入15ug/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)500μL。静置5分钟，弃皿内液体，PBS清洗3次；

7)冰箱4°冷藏备用：加入100μL PBS溶液保持共聚焦培养皿内细胞湿润，用锡纸包裹共聚焦培养皿后，置于冰箱4°冷藏；

8)以上全程需在避光条件下完成；对照实验采用同样浓度FITC与细胞孵育，实验方法一致；

9)激光共聚焦拍摄：利用Zeiss LSM710激光共聚焦显微镜下观察及Zen软件分析处理，绿色代表FITC荧光，红色代表罗丹明－鬼笔环肽荧光，蓝色代表DAPI荧光。

本发明的有益效果：本发明从体外细胞水平到体内皮下肿瘤模型，从活体近红外光学2D成像到光声3D实时成像，从宏观成像到微观成像证实了，CAIX-800能够高效、特异性地结合CAIX受体从而靶向乏氧的5-8F肿瘤,可以为实现后续的原位及转移模型的乏氧成像研究提供有力保障。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是CAIX-800的合成化学反应式。

具体实施方式

实施例1

1生物材料与实验试剂

1)化学试剂：CAIX的小分子靶向剂是在霍普金斯大学医学院合成。本章化学合成所用原料：N,N-二乙基乙胺(三乙胺)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等，均购自Sigma-Aldrich公司。荧光染料IRDye800CW NHS(LI-COR)及FITC NHS(Thermo Scientific)购自上海楚肽生物公司。

2)细胞株：人鼻咽癌细胞株5-8F、C666-1由南方医科大学友情提供。

3)实验动物：雄性BALB/C 4周龄裸鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

4)本章实验过程中相关试剂列于表1

表1实验试剂

2本章实验过程中所用仪器和设备列于表2

表2实验设备

3实验方法

3.1 CAIX-800及CAIX-FITC的合成

1)标记荧光染料在室温下全程避光操作。首先，将IRDye800CW NHS加入100ul二甲基甲酰胺溶解，取等摩尔量小分子靶向剂加入染料溶液内，按1：6的当量加入三乙胺作为反应催化剂，置于磁力搅拌器上，转速300rmp，约2小时反应结束。将产物加入超纯水至5ml，置于-80°冰箱过夜第二天在冻干机冻干，待12h后停止冻干，收集产物。用于体外实验的CAIX-FITC合成方法同CAIX-800。

3.2 CAIX-800及CAIX-FITC的表征及体外性能分析

1)收集产物委托上海楚肽生物有限公司进行结构检测。对两个产物完成质谱分析和高效液相色谱仪(HPLC)纯度分析。

2)釆用紫外吸收光谱测量仪，检测上述溶液的紫外吸收波长。选用去离子水作为溶剂，配制成各种不同浓度的待测样品。用3ml石英比色皿作为样品池，用量程为1ml移液枪转移5ml待测溶液，待测样品放置在样品检测槽。测量前首先将去离子水作为参照溶液，将测量基线调零，选定检测的初始波长400nm及结束波长1200nm，检测结束后分析光谱的峰值。

3.3鼻咽癌细胞对探针的靶向摄取实验

(1)细胞复苏：从液氮罐快速取出冻存管放入恒温水浴锅中，温度设置为37℃，用镊子夹冻存管在水浴锅中反复晃动，使冻存管中的细胞冻存液快速融化约40s；将冻存管经酒精消毒后，在生物安全柜内将冻存液转移至含有完全培养基的培养皿中，轻轻晃动培养皿后放入细胞培养箱中过夜，待细胞贴壁后弃去上清，用PBS预温缓冲液轻轻冲洗3次后，加入新鲜培养基，继续培养。

(2)细胞传代：待细胞处于对数生长期(融合度约80％)后，弃去旧培养基，用预温的PBS缓冲洗贴壁的细胞3次，加入约0.5mL 0.25％胰酶后，放在细胞培养箱中孵育约0.5min，显微镜下观察细胞形状开始变圆时，加入2mL完全培养基使消化过程终止；用1ml移液枪轻轻吹打贴壁细胞，至细胞完全脱落后，转移至15mL离心管中，转速800rpm，离心5min，细胞沉淀下来后弃去上清，加入新鲜完全培养基将细胞轻轻吹打均匀，然后按照1：3的比例转移至新的培养皿中，继续培养。

(3)细胞铺板：35mm玻底皿(激光共聚焦专用培养皿)置于超净台紫外灯光下照射30分钟灭菌。待5-8F和C666-1细胞生长达到80％，弃培养皿中培养基，预温PBS溶液小心清洗细胞表面3次后，加入0.5mL0.25％胰酶消化细胞30s，收集细胞离心(800rpm,5min)。离心后弃去上清液，加入1mL完全培养基重悬。轻轻吹打均匀后用量程200μL移液枪吸取200μL细胞悬液，缓慢滴入并覆盖共聚焦培养皿内小孔。置于细胞孵育箱中，培育4小时使细胞贴壁。随后在共聚焦培养皿边缘缓慢加入完全培养基1ml，细胞培养箱中过夜。

探针靶向摄取实验：

1)探针孵育：用新鲜完全培养基溶液稀释探针浓度为50nM。将共聚焦培养皿中原培养基弃去，加入探针溶液，并置于细胞孵育箱中孵育4小时后，弃去皿内溶液，用PBS溶液清洗3次。

2)多聚甲醛固定：1ml移液枪吸取4％多聚甲醛500μL，覆盖细胞表面进行细胞固定，并放入细胞孵育箱15分钟。去除多聚甲醛溶液，用PBS溶液小心清洗细胞表面3次。

3)Triton X-100破膜：加入0.1％Triton X-100/PBS溶液200μL，室温下静置3-5分钟。去除溶液后加入PBS清洗3次。

4)牛血清白蛋白(BSA)封闭：加入0.01g/ml BSA 500μL，与细胞共孵育30分钟，再次用PBS清洗3次。

5)细胞骨架染色：加入100nM罗丹明-鬼笔环肽工作液200μL染细胞骨架，静置半个小时。PBS清洗3次。

6)细胞核染色：加入15ug/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)500μL。静置5分钟，弃皿内液体，PBS清洗3次。

7)冰箱4°冷藏备用：加入100μL PBS溶液保持共聚焦培养皿内细胞湿润，用锡纸包裹共聚焦培养皿后，置于冰箱4°冷藏。

8)以上全程需在避光条件下完成。对照实验采用同样浓度FITC与细胞孵育，实验方法一致。

9)激光共聚焦拍摄：利用Zeiss LSM710激光共聚焦显微镜下观察及Zen软件分析处理，绿色代表FITC荧光，红色代表罗丹明－鬼笔环肽荧光，蓝色代表DAPI荧光。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。