阅读说明：本技术 一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法及其产品和应用 (Preparation method of human serum albumin standard substance raw material, product and application thereof ) 是由 全灿 孔金隆 孙永跃 李红梅 罗坚 何雅娟 于 2018-06-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及蛋白纯化领域的一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法及其产品和应用；所述人血白蛋白标准物质原料的制备方法,包括以下步骤：(1)采用冷乙醇沉淀法处理人血清,弃沉淀组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ,留上清液；(2)上清液超滤脱乙醇,置换缓冲液；(3)阳离子交换层析；(4)阴离子交换层析；(5)超滤置换为水；(6)冷冻干燥。本工艺制备的白蛋白产品纯度较高,可达99％以上,单体含量较低,优于Sigma公司样品,值得推广应用。(the invention relates to a preparation method of a human serum albumin standard substance raw material, a product and application thereof, belonging to the field of protein purification; the preparation method of the human serum albumin standard substance raw material comprises the following steps: (1) treating human serum by cold ethanol precipitation, removing precipitation components I + II + III, and collecting supernatant; (2) ultrafiltering the supernatant to remove ethanol, and replacing the buffer solution; (3) cation exchange chromatography; (4) anion exchange chromatography; (5) replacing the ultrafiltration with water; (6) and (5) freeze drying. The albumin product prepared by the process has high purity which can reach more than 99 percent, has low monomer content, is superior to a sample of a Sigma company, and is worthy of popularization and application.)

一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明涉及蛋白纯化领域，更进一步说，涉及一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法及其产品和应用。

背景技术

白蛋白是血浆中含量最高的蛋白质。每100mL血浆含3500mg～5500mg，约占血浆总蛋白含量的50％以上，易大量、高纯度的提取。白蛋白分子量为66kDa，等电点4.7，分子呈椭圆形，白蛋白分子是由585个氨基酸组成的单条肽链盘曲形成的球状分子。白蛋白的结构中包含3个功能区和9个亚功能区，且链内半胱氨酸残基间有17个二硫键交叉连接，维持天然的四级结构，稳定性好。

白蛋白是目前临床上应用最广的药用蛋白。白蛋白标准物质的研制能够为各种分析检测的方法提供质控样品，另一方面标准物质是溯源性的基础，是测量分析的保障，还可以为分析方法提供评价。由于我国人口众多以及医疗水平的提高，白蛋白临床需求逐年增加。这也就意味着，在现有血浆资源紧缺的情况下，提高我国现有白蛋白纯化工艺的纯度和收率均具有重要的意义。除此之外，在科研项目和生产过程中，白蛋白的定量和定性检测都是必不可少的操作。因此，白蛋白标准物质的研制刻不容缓。一方面能够为各种分析检测的方法提供质控样品，另一方面标准物质是溯源性的基础，是测试分析的保障，并可以提供评价。美国药典(United States Pharmacopeia，USP)将Sigma公司的重组人白蛋白作为对照品，另外Sigma公司还拥有纯度≥97％的人血清白蛋白纯品。而通过国家标准物质中心查询可得目前我国只有冷冻人血清白蛋白、前白蛋白标准物质(GBW(E)090619)和纯度在85％以上的人血清白蛋白成分标准物质。因此，研制高纯白蛋白标准物质具有重要的意义。

目前市售的人血白蛋白产品均是由人血清通过冷乙醇沉淀法纯化制得，乙醇沉淀的优点在于所用溶剂乙醇具有杀菌功能，沉淀过程能抑制HIV等病毒，且生产过程相对简单。但是由于冷乙醇沉淀过程中可能会存在共沉淀的现象，这也导致白蛋白产品纯度并不高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提出一种人血白蛋白标准物质原料，具体地说涉及一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法及其产品和应用。本发明考虑到随着色谱技术的发展，冷乙醇沉淀与色谱相结合的方法能够优势互补，对人血白蛋白进行更好的纯化。

本发明目的之一是提供一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法，可包括以下步骤：

(1)采用冷乙醇沉淀法处理人血清，弃沉淀组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ，留上清液；

(2)沉淀上清液超滤脱乙醇，置换缓冲液；

(3)阳离子交换层析；

(4)阴离子交换层析；

(5)超滤置换为水；

(6)冷冻干燥。

其中，

步骤(1)是以传统的冷乙醇沉淀工艺为基础，该工艺为五步沉淀法，在本发明中，弃其工艺生产过程中的沉淀组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ，留上清液。所述步骤(1)中，具体可用生理盐水稀释血清至蛋白浓度为45±1g/L，使用0.1～0.5mol/L的盐酸调整pH至5.8±0.2，置于低温循环水浴中预冷，低温循环槽的温度设置在-5±1℃，95％乙醇在-20℃预冷，加入到预冷样品中，边加边搅拌至乙醇终体积比为19±1％，-5℃±1℃下搅拌1h以上；离心弃沉淀留上清液，得到预处理液。

所述步骤(2)中，可采用膜包脱乙醇处理，具体可采用30kDa的超滤膜包(如30kDa0.005m²规格)，其中使用的超滤稀释液即为所述步骤(3)中阳离子交换层析所用的平衡缓冲液，在超滤的后处理步骤中稀释至蛋白浓度范围选自5～25mg/mL、5～20mg/mL、5～15mg/mL、5～10mg/mL、10～20mg/mL或10～15mg/mL，优选5～15mg/mL，最优选5～10mg/mL。利用0.1～0.3mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至5.5～6.5，得到合适的层析上样溶液。

阳离子交换层析和阴离子交换层析流速可为8～12mL/min，紫外检测波长设定为280nm。

所述步骤(3)中的阳离子交换层析使用的平衡缓冲液为pH5.0～7.0、其中含浓度为5～100mmol/L(优选10～30mmol/L)的缓冲剂，所述缓冲剂选自磷酸盐和/或柠檬酸盐(即所述平衡缓冲液选自磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的至少一种)，优选柠檬酸盐(即所述平衡缓冲液优选为柠檬酸盐缓冲液)；

所述步骤(3)中的阳离子交换层析使用的洗脱缓冲液中含浓度为0.1～1mol/L的氯化钠，及含浓度为5～100mmol/L(优选10～30mmol/L)的缓冲剂，所述缓冲剂选自磷酸盐和/或柠檬酸盐，优选柠檬酸盐。

所述步骤(3)中的阳离子交换层析使用弱酸型阳离子交换介质，优选所述的弱酸型阳离子交换介质的电荷基团为羧甲基。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(3)中阳离子交换层析使用的平衡缓冲液的pH范围可选自5.0～7.0、5.0～6.5、5.0～6.0、5.0～5.5、5.5～6.5、5.5～6.0或6～6.5，优选为5.5～6.5，最优选为6.0～6.5。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(3)中平衡缓冲液的pH可为5.0～7.0之间的任意值，例如5.2、5.8、6.0、6.2等。

阴离子交换层析可包括以下步骤：将上述层析收集的穿透峰组分调pH至5.2±0.2，上样至用10～50mmol/L(优选15～30mmol/L)的醋酸和醋酸钠缓冲体系平衡好的阴离子交换柱，用pH4.6±0.2的醋酸缓冲液洗脱，得到的洗脱液为白蛋白。

经两步层析得到的洗脱液用8～12倍体积超纯水进行缓冲液置换，并冷冻干燥保存。

所述步骤(4)中的阴离子交换层析使用的是弱碱型阴离子交换介质，优选的弱碱型阴离子交换介质的电荷基团是二乙基氨基乙基。

所述步骤(4)中的弱碱型阴离子交换介质的基质选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺和聚苯乙烯中的至少一种；优选的，所述离子交换介质的基质是琼脂糖，例如是Capto介质、Sepharose FF、Sepharose等。

发明人考虑到，冷乙醇沉淀上清里除白蛋白外，主要的杂蛋白为免疫球蛋白，免疫球蛋白的等电点为6～7，在阳离子交换层析中，pH6.0上样，部分免疫球蛋白吸附在柱子上而除去，但是仍然有部分随着白蛋白穿透出来。因此在阴离子交换层析中，采用pH洗脱的方式，pH5.2上样，pH4.6洗脱，等电点大于5.2或者小于4.6的蛋白以穿透或分布洗脱的方式实现了与白蛋白的分离。最终使得终产物白蛋白达到了99％以上的高纯度。

本发明技术方案制备的产品纯度高，制备成本低(因采用的均为常规介质)，周期短(现有技术中冷乙醇沉淀结合阴阳离子交换色谱的方法均采用的是pH洗脱的方式，在本工艺中采用的是一步pH洗脱加一步盐洗脱，盐洗脱的方式要比pH洗脱更快捷方便，且盐洗脱的方式容易放大)。且步骤(3)阳离子交换层析为穿透式层析，流穿式层析在节省时间的同时可以增加样品处理量节省成本，同时由于蛋白直接穿透未与介质产生相互作用，降低了蛋白变性失活的可能。

本发明目的之二是提供所述的人血白蛋白标准物质原料的制备方法制成的白蛋白，所述白蛋白的纯度大于99％，优选大于99.3％。本文中纯度计算按照本领域技术人员熟知的方法进行，例如根据HPLC中280nm紫外吸收值积分获得。

本发明目的之三是按照所述的人血白蛋白标准物质原料的制备方法制成的白蛋白在作为标准物质的应用，具体如可用于转铁蛋白标准物质的用途。白蛋白标准物质一方面能够为各种分析检测的方法提供质控样品，另一方面标准物质是溯源性的基础，是测试分析的保障，并可以为分析方法提供评价。本发明技术方案制备的产品弥补了我国在白蛋白标准物质领域的空白。

附图说明

图1为实施例1制备的人血白蛋白标准物质原料与Sigma公司生产的样品的对比图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。但本发明不受这些实施例的限制。

实施例1

纯化血浆中的白蛋白：取-20℃下的新鲜冷冻血浆50mL在4℃冰箱缓慢冻融后离心(4℃，10000r/min，30min)，上清液用生理盐水(0.9％NaCl)稀释至蛋白浓度为45g/L，盐酸调pH值至5.8，置于-5℃的低温循环水浴中预冷30min。取-20℃的95％乙醇，加入到预冷样品中，边加边搅拌至乙醇终体积比为19％，-5℃下搅拌反应1h以上，离心弃沉淀留上清液，得到预处理液。

预处理液用截留分子量为30KDa的膜包(Pellicon XL超滤膜包Ultracel 30kDa0.005m²，美国Millipore公司生产)置换缓冲液为20mmol/L Na₂HPO₄和柠檬酸缓冲体系(pH6.0)并稀释至蛋白浓度约为10mg/mL。

阳离子交换层析：阳离子和阴离子交换层析流速为10mL/min，紫外检测波长设定为280nm。其中CM阳离子交换层析柱(25cm×26cm)用20mmol/L Na₂HPO₄和柠檬酸缓冲体系(pH 6.0)平衡柱子4～5个柱体积，直至基线平行。进样约200mL，收集穿透峰，用含有1MNaCl的20mmol/L Na₂HPO₄和柠檬酸缓冲体系(pH6.0)洗脱杂蛋白。

阴离子交换层析：将上述层析收集的穿透峰组分用醋酸调pH至5.2，上样至用20mmol/L的醋酸和醋酸钠缓冲体系(pH5.2)平衡好的DEAESepharose FF阴离子交换柱(25cm×26cm)，用pH4.6的醋酸缓冲液洗脱，得到的洗脱液为白蛋白。

经两步层析得到的洗脱液用10倍体积超纯水进行缓冲液置换，并冷冻干燥保存，即得人血白蛋白标准物质原料。

将所述人血白蛋白标准物质原料与Sigma公司生产的样品(Lot NO:A9511，纯度≥97％)进行对比，得到图1。其中高效液相色谱使用岛津LC-20A高效液相色谱系统，色谱柱为TSK-GEL G3000SW_XL(300mm×7.8mm,I.D.)，缓冲液为20mmol/L PB+0.1mol/L Na₂SO₄(pH7.0)，检测波长280nm，进样量100μL，流速0.6mL/min，柱温为室温。从结果可以看出，本工艺制备的白蛋白产品纯度较高，单体含量较低。根据HPLC中280nm紫外吸收值积分，所述白蛋白标准物质原料的纯度为99.3％。

实施例2

按照实施例1中的冷乙醇沉淀和超滤步骤得到了粗制的白蛋白，在不同pH柠檬酸盐平衡缓冲条件下，得到了CM Sepharose洗脱组分的HPLC图谱。三种条件下所得的粗制产物比较如下表：

三种pH值条件下CM Sepharose穿透峰组分的HPLC分析汇总

在三种不同的pH条件下，综合考虑纯度和收率的因素，优选pH为6.0。