阅读说明：本技术 柚皮素抗原及其制备方法与应用 (Naringenin antigen and preparation method and application thereof ) 是由 崔永亮 焦必宁 赵静 赵其阳 张耀海 陈爱华 王成秋 何悦 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种柚皮素抗原及其制备方法与应用,将柚皮素与同时含有氨基和羧基的化合物B进行反应得到化合物C；化合物C和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到化合物D；化合物D与载体蛋白经偶联反应得柚皮素抗原；柚皮素抗原在制备用于检测样品中柚皮素的酶联免疫试剂盒、柚皮素的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用。发明提供的制备柚皮素抗原的方法,能够方便、快捷地获得柚皮素抗原,合成步骤简洁明了、合成成本低,效果好。用本发明方法制备的柚皮素抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。为柚皮素的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。(The invention discloses a naringenin antigen and a preparation method and application thereof, wherein naringenin reacts with a compound B containing amino and carboxyl at the same time to obtain a compound C; carrying out coupling reaction on the compound C and N-hydroxysuccinimide in the presence of dicyclohexylcarbodiimide or 1-ethyl- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride to obtain a compound D; coupling reaction is carried out on the compound D and carrier protein to obtain naringenin antigen; the naringenin antigen is applied to the preparation of an enzyme linked immunosorbent kit, a luminous immunoassay kit or an immunoaffinity chromatographic column for detecting naringenin in a sample. The method for preparing the naringenin antigen can conveniently and quickly obtain the naringenin antigen, and has the advantages of concise and clear synthesis steps, low synthesis cost and good effect. The antibody obtained by immunizing the naringenin antigen prepared by the method has good specificity and low minimum detection limit. Has wide prospect in the rapid immunodetection application of naringenin.)

柚皮素抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种柚皮素抗原的制备方法，以及采用该制备方法制得的柚皮素抗原及其应用。

背景技术

柚皮素是柚皮苷的苷元，广泛存在于芸香科植物中，通用名为Naringenin；化学名为：4'，5，7-三羟基黄酮；商品名为：柚皮苷原、柑橘素；CAS登记号:480-41-1；分子式为：C₁₅H₁₂O₅；相对分子量为：272.25。其化学结构式如下：

柚皮素(Naringenin)具有***样活性，因而具有促进内皮细胞分泌NO的作用；它可以减轻细胞氧化损伤；它能有效地降低视网膜功能和组织结构的损伤，改善视功能；柚皮素还具有明显的止咳、化痰、平喘作用；柚皮素可以直接抑制T淋巴细胞的激活，从而阻止各种炎症因子的分泌，进而对免疫性急性肝损伤有保护作用。

目前，柚皮素提取方法主要有回流法、有机溶剂法、固相萃取法、超声提取法。柚皮素含量分析方法有分光光度法、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)、反相高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)、毛细管区带电泳法、RP-HPLC法等，其灵敏度高，准确性好，但是这几种检测方法需要使用昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时长，不适用于现场快速检测。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。

基于上述分析，一种能快速、简便、实时对柚皮素进行现场检测，且灵敏度高、选择性强、适用于高通量分析的柚皮素抗原是目前行业内急需的。

发明内容

鉴于上述不足，本发明提供了一种制备灵敏度高、选择性强、适用于高通量分析的柚皮素抗原的方法以及采用该方法制得的柚皮素抗原及其应用。

本发明是通过如下手段实现的：

本发明提供的柚皮素抗原结构通式如式A所示，

所述式A中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。

本发明提供的制备柚皮素抗原(式A)的方法，包括如下步骤：

(1)将柚皮素与式B所示同时含有氨基和羧基的化合物进行反应得到式C所示化合物；

H₂N-X-(CH₂)n-COOH

式B结构式

所述式B和式C中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；

(2)式C所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式D所示化合物；

所述式D中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；

(3)式D所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示柚皮素抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。

进一步的，步骤(1)中，式B所示化合物选自羧甲氧基胺、肼基乙酸、氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸中至少一种。

进一步的，步骤(1)中，所述式B化合物和柚皮素的投料摩尔配比为(0.1-10)：1

所述反应的温度为0～100℃，时间为6～48小时；

所述反应的溶剂选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜和四氢呋喃中至少一种。

进一步的，步骤(2)中，式C所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺的摩尔份数比为1：(1～5)：(1～5)；

式C所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔份数比为1：(1～5)：(1～5)；

所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为4～24小时。

进一步的，步骤(3)中，式D所示化合物与所述载体蛋白的摩尔份数比为(5～100)：1；

所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为8～36小时；所述偶联反应在pH值为4～11的条件下进行；

式D所示化合物在所述载体蛋白的溶液中进行偶联反应，所述载体蛋白的溶液是由所述载体蛋白加入至缓冲溶液中得到的，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中至少一种，所述缓冲液的pH值均为7.4；

进一步的，所述方法还包括将所述偶联反应的反应体系进行透析的步骤；所述透析步骤中，所用透析液为pH值为4～10、浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。

按照上述方法制备得到的柚皮素抗原，也属于本发明的保护范围。该柚皮素抗原是柚皮素与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物；所述酰胺键是式C上的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。

由上述本发明提供的柚皮素抗原得到的抗体，以及上述抗原和/或抗体在检测样品中柚皮素中的应用、在制备用于检测样品中柚皮素的酶联免疫试剂盒、柚皮素的化学发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用，均属于本发明的保护范围。其中，所述检测样品为水体、药品、食品或土壤。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的制备柚皮素抗原的方法，能够方便、快捷地获得柚皮素抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的柚皮素抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本发明的制备柚皮素抗原的方法及由该方法获得的柚皮素抗原在柚皮素的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。

附图说明

图1为柚皮素抗原的合成路线图；

图2为建立的柚皮素间接ELISA法标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，牛血清白蛋白和卵清白蛋白均购于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，邻苯二胺(OPD)，羧甲氧基胺半盐酸盐、柚皮素等其余常规试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1

柚皮素-卵清白蛋白(柚皮素-OVA)抗原的制备(合成路线如图1所示)

1)式I所示柚皮素半抗原化合物的合成：

在25mL三口瓶中，加入0.2g柚皮素和0.3g羧甲氧基胺半盐酸盐，然后加入5mL吡啶，加热至100度，反应24h后冷却至室温，将反应液倒入20mL水中，用浓盐酸调节pH值为3，用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，无水硫酸钠干燥，旋转脱溶，柱层析得到产物0.13g，产率51.4％。

¹H NMR(600MHz，dmso)δ10.44(s，1H)，7.30(d，J＝8.2Hz，2H)，6.78(d，J＝8.3Hz，2H)，5.91(s，1H)，5.88(s，1H)5.06(d，J＝11.5Hz，1H)，4.68(s，2H)，3.30(d，J＝17.1Hz，1H)，2.91(dd，J＝17.0，11.8Hz，1H).

¹³C NMR(151MHz，dmso)δ171.06，161.64，159.43，158.88，157.97，155.69，129.84，128.58，115.57，96.94，96.56，95.96，76.03，70.98，40.34.

ESI-MS m/z 346.16[M+H]⁺，368.14[M+Na]⁺。

产品经¹H-NMR、¹³C-NMR和质谱确证，为式I所示化合物。

2)偶联：

方法(1)：称取步骤1)得到的式I所示柚皮素半抗原(0.036mmol)，NHS(0.047mmol)，和DCC(0.040mmol)用1mL无水DMF溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，将反应液在8000转下离心5分钟，取上清液，得到式B所示化合物；

方法(2)：称取步骤1)得到的式I所示柚皮素半抗原(0.036mmol)，NHS(0.047mmol)，和EDC(0.040mmol)用1mL水溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，得到式Ⅱ所示化合物；

3)将步骤2)所得式B所示化合物缓慢滴加入载体蛋白OVA溶液(该载体蛋白溶液是由105mg OVA溶于10mL pH值为7.5的磷酸盐(PBS)缓冲液混匀而得)中，式B化合物与载体蛋白的投料摩尔比为15:1，在4℃搅拌过夜。

4)透析：将步骤3)所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液(柚皮素-OVA)稀释为1mg/mL的溶液，至于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的柚皮素半抗原或其它小分子，得到式Ⅲ1所示柚皮素与OVA的偶联物，也即式C所示柚皮素抗原。

其中，PBS溶液按照如下方法制备而得：将NaCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O以质量比8.0：0.2：2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。

实施例2

柚皮素-牛血清白蛋白(柚皮素-BSA)抗原的制备

1)式I所示柚皮素半抗原的合成及其活化与实施例1中无差别，在此不再赘述。

2)将实施例1中步骤2)所得式Ⅱ所示化合物缓慢滴加到载体蛋白溶液中(该载体蛋白溶液是由157.5mg BSA溶于10mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS))，式Ⅱ化合物与载体蛋白的投料摩尔比为15：1，在4℃搅拌过夜。

3)透析：将步骤2)所得反应液用pH值为7.4、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液(柚皮素-BSA)稀释为1mg/mL的溶液，至于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的柚皮素或未反应的其它小分子，得到式Ⅲ2所示柚皮素与OVA的偶联物，也即式C所示柚皮素抗原。

其中，PBS溶液按照如下方法制备而得：将NaCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O以质量比8.0：0.2：2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。

实施例3

柚皮素-牛血清白蛋白(柚皮素-BSA)抗原的应用

一、利用柚皮素-牛血清白蛋白(柚皮素-BSA)抗原制备抗体

(1)取6-8周龄的Bal b/c小白鼠作为实验动物。

(2)基础免疫：由实施例2中得到稀释好的柚皮素-BSA抗原溶液(浓度为1mg/mL)，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，注射剂量为0.1mg乳化抗原/只。

(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1mL上述稀释好的柚皮素-BSA抗原溶液，然后加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg乳化稀释抗原(8周龄的Bal b/C小鼠体重约23-25g)。

加强免疫每隔15天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3-5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，包被原为1mg/mL柚皮素-OVA稀释500倍用，待效价大于1:8000后(效价定义为对照孔显色值为1时，血清的稀释倍数)，眼球摘除采血，血液室温静置1小时后，再于4℃冰箱中静置2小时，然后于离心机中8000r/min离心5分钟后，分离出抗血清，即得到柚皮素-BSA抗体。用于下述各实验。

二、抗体效果检测

下述实验中所用的各种缓冲液如下：

(1)包被缓冲液：0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；

(2)磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.5)：称量4.0g NaCl、0.1g KH₂PO₄、1.48g Na₂HPO₄·12H₂O用蒸馏水定容到500mL，浓度为0.1M、pH为7.5磷酸盐缓冲液；

(3)样品稀释液PBSTG：由0.5mL吐温20、0.5g明胶和500mL浓度为0.1M、pH为9.6的PBS缓冲液混合得到；

(4)柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液：由柠檬酸三钠、Na₂HPO₄和水组成；柠檬酸三钠在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.01M，Na₂HPO₄在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.03M；柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的pH值为5.5；

(5)底物缓冲液：将20.0mg邻苯二胺(OPD)溶解于10.0mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，然后加入4μL体积百分含量为30％的H₂O₂水溶液得到的溶液，柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液为(4)中所述；

(6)终止缓冲液：2.0M的硫酸水溶液；

(7)洗涤液：由NaCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、Tween-20和水组成；NaCl在洗涤液中的浓度为8.0g/L，KH₂PO₄在洗涤液中的浓度为0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O在洗涤液中的浓度为2.96g/L，Tween-20在洗涤液中体积百分含量为1：1000。

试验例1

抗体抑制实验

1、柚皮素-OVA包被抗原溶液的配制

将上述实施例1制备的稀释后的1mg/mL的柚皮素-OVA抗原完全解冻后，用包被缓冲液按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行梯度稀释，得到不同浓度的柚皮素-OVA的包被抗原溶液。

2、柚皮素标准品溶液的配制

(1)称取1mg柚皮素标样，充分溶解于10mL无水甲醇中，即得到1mg/mL柚皮素标准品溶液；

(2)用样品稀释液将上述步骤(1)的1mg/mL柚皮素标准品溶液配成浓度为2000ng/mL的柚皮素标准品溶液。

3、柚皮素-BSA抗血清稀释液的配制

将上述步骤一制备的柚皮素-BSA抗体用样品稀释液按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行梯度稀释，得到柚皮素-BSA抗血清稀释液。

4、抗原、抗体的棋盘格实验

包被：在96孔酶标板中每孔加入100μL步骤1制备得到的柚皮素-OVA包被抗原溶液，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

封闭：3％脱脂奶粉封闭液180μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h，弃封闭液，洗涤3次。

竞争：对照孔每孔加50μl样品稀释液，抑制孔每孔加入50μl步骤2制备得到的柚皮素标准品溶液。将上述步骤3得到的柚皮素-BSA抗血清稀释液(从2.5×10³倍到40×10³倍)加入酶标板中(50μl/孔)，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗(IgG-HRP，Jackson公司，产品目录号为79556)(0.1mg/mL)稀释1000倍，稀释液是0.1M，pH为9.6的PBSTG，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

显色：将底物缓冲液加入酶标板中，每孔100μl。避光显色15min。

终止：每孔加入50μL终止缓冲液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。

效价的定义为零孔OD值为1时的血清稀释倍数。

结果如表1所示。

表1、抗柚皮素小鼠的血清效价检测(OPD室温显色15min，2000ng标样抑制)

注：I表示酶标板中的抑制孔，C表示酶标板中的对照孔。

根据表1中结果表明，当包被抗原稀释度为1：8000，抗血清稀释度为1:4000时，此时的抑制率最好，为93.6％[抑制率＝(A₀-A₂₀₀₀)/A₀×100％]，也即此时的抑制效果最好。说明上述实施例2制备的柚皮素-BSA可以作为免疫原制备出检测柚皮素的抗体。

A₀为对照孔OD值；A₂₀₀₀为抑制孔OD值；

抑制率的计算公式：抑制率＝(A₀-A₂₀₀₀)/A₀×100％。

(二)柚皮素标准曲线的建立

将上述制备的柚皮素标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL。

(1)包被原的包被：将上述制备的柚皮素-OVA抗原按照1:8000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，37℃温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的柚皮素标准品溶液(实验孔)，每孔50μL，对照孔中不添加柚皮素标准品溶液而加入50μL样品稀释液；

(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入稀释倍数为1:8000的柚皮素-BSA抗血清稀释液，每孔50μL；37℃温育30分钟；倒掉酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(4)在实验孔和对照孔中分别加入100μL稀释倍数为1:1000的IgG-HRP(Jackson公司，产品目录号为79556)(0.1mg/mL)，37℃温育30分钟；用洗涤液洗板4次，倒掉酶标板中的溶液，甩干；

(5)向实验孔和对照孔中分别加入100μL底物缓冲液，室温孵育15分钟后，再向每孔中加入50μL 2.0M的硫酸溶液终止反应；

(6)在492nm下测定吸光值；

(7)绘制标准曲线：以不同浓度(ng/mL)的柚皮素标准品溶液作为X轴，以吸光度值的比值(B/B₀×100％，其中，B为柚皮素标准品溶液的平均吸光度值，B₀为对照孔的平均吸光度值)作为Y轴，绘制标准曲线图。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线图如图2所示。结果表明，其灵敏度(IC₅₀)为65.5ng/mL，检测范围是22.0ng/mL-220.8ng/mL。说明上述实施例1制备的柚皮素-BSA作为抗原免疫小鼠得到的抗体具有很好的效果。

(三)抗体特异性检测

1、柚皮素类似物标准品溶液的配制

柚皮素类似物标准品的配制

参照步骤(一)中柚皮素标准品的配制方法，制备柚皮素类似物的标准样品。

用样品稀释液将上述柚皮素分别稀释成如下浓度：20000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL、312.5ng/mL。

2、建立标准曲线，测定抑制中浓度IC₅₀(抑制率达到50％的标样浓度值)。

标准曲线的建立方法与上述柚皮素标准曲线的建立方法相同。

交叉反应率(％)＝(柚皮素IC₅₀)/(柚皮素类似物IC₅₀)×100％。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表2所示。

表2、由柚皮素-BSA制备的抗体的特异性检测

分析物	IC<sub>50</sub>(ng/mL)	交叉反应率(％)
			柚皮素	65.5	100
柚皮素	>20000	-
			柚皮苷	>20000	-
橙皮苷	>20000	-
			橙皮素	>20000	-

根据表2结果表明，上述由柚皮素-BSA制备得到的抗体与其类似物的交叉反应率很小，说明用柚皮素-BSA制备的抗体对柚皮素具有很好的特异性。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。