阅读说明：本技术 安乃近人工抗原的合成方法 (Synthetic method of analgin artificial antigen ) 是由 胥传来 李月 匡华 徐丽广 马伟 刘丽强 吴晓玲 宋珊珊 胡拥明 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：安乃近人工抗原的合成方法,属于生物化工技术领域。本发明采用戊二醛法将4-氨基安替比林H1与载体蛋白偶联,得到安乃近的人工抗原；或先由4-氨基安替比林H1和丁二酸酐反应得到安乃近半抗原H1-HS,再用碳二亚胺法将安乃近半抗原H1-HS与载体蛋白偶联,即得到安乃近人工抗原。本发明成功合成了安乃近人工抗原,合成步骤简单、安全、有效,完全可用于免疫分析中,为以后的研究提供了必需的人工抗原。(A synthetic method of analgin artificial antigen belongs to the technical field of biochemical engineering. The invention adopts a glutaraldehyde method to couple 4-aminoantipyrine H1 with carrier protein to obtain an artificial antigen of analgin; or 4-amino antipyrine H1 and succinic anhydride react to obtain analgin hapten H1-HS, and then the analgin hapten H1-HS is coupled with carrier protein by a carbodiimide method to obtain the analgin artificial antigen. The invention successfully synthesizes the analgin artificial antigen, has simple, safe and effective synthesis steps, can be completely used in immunoassay, and provides the necessary artificial antigen for the later research.)

安乃近人工抗原的合成方法

技术领域

本发明涉及两种安乃近人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

安乃近(dipyrone)为临床常用的解热镇痛药之一，属于吡唑酮类解热镇痛药， 自投入临床用于治疗以来已有百年的历史。安乃近在体内可迅速水解成活性产物4-甲氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine，MAA)，再进入体循环；MAA在体内代谢为4-甲酰氨基安替比林(4-formylaminoantipyrine，FA)和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，AA)；AA可以继续代谢为4-乙酰氨基安替比林(4-acetylaminoantipyrine，AAA)。

安乃近具有较强的解热和镇痛作用，目前在许多国家被广泛使用，但该药能导致粒细胞减少、再生障碍性贫血、严重的过敏和休克虚脱等严重反应。由于其毒副作用和尚不确切的药效作用机理，世界上一些发达国家已经对安乃近作出了停止或限制使用的规定，如美国、瑞典禁止该药物用于食源性动物中，日本的肯定列表亦将其列入一律标准，而欧盟对安乃近在牛奶中的限量要求为 50 µg/kg(以MAA含量计算)。

目前报道的用于安乃近或其类似物的测定方法有分光光度法、流动注射化学发光光度法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等，然而，这些仪器分析法都需要复杂的前处理，耗时，耗力，不适合大量样品的快速检测。为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对安乃近的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对安乃近的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的目的是提供两种安乃近人工抗原的合成方法，所制备的产品用于安乃近免疫分析方法研究，为今后的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案，两种安乃近人工抗原的合成方法，第一种，采用戊二醛法将4-氨基安替比林（H1）与载体蛋白偶联，得到安乃近的一种人工抗原。第二种，先由H1和丁二酸酐反应得到半抗原，以下简称为H1-HS，再用碳二亚胺法将半抗原H1-HS与载体蛋白偶联，即得到安乃近的另一种人工抗原。

第一种合成方法具体步骤如下：

（1）A液的制备：称取4-氨基安替比林H1 2.03 mg，溶解在500 μL超纯水中，再加入60 μL 2.5% 戊二醛溶液，冰浴搅拌15 min，得反应液A液；

（2）B液的制备：称取5mg BSA，用1mL 0.01M pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS溶解，得B液；

（3）偶联：将A液逐滴加入到B液中，边加边搅拌，室温搅拌反应2h，得偶联混合液；

（4）透析：取10cm蛋白截留为3kDa的透析袋，煮沸5 min，冷却至室温后，将偶联混合液加入透析袋中，并用pH=7.4、0.01M PBS透析3天，每6 h更换一次透析液，除去多余的小分子化合物，得到安乃近的人工抗原H1-BSA，采用紫外吸收扫描方法鉴定。

第二种合成方法具体如下：

（1）安乃近半抗原H1-HS的合成：

合成路线如下：

称取4-氨基安替比林H1 50 mg，4-二甲氨基吡啶175 mg，丁二酸酐300 mg，溶于20 mL无水吡啶，60℃ 回流12 h。反应液蒸发浓缩，残留物溶解在10 mL水中，并用5 mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相。有机相经氮气吹干后，得到白色固体，即为安乃近半抗原H1-HS，采用核磁和质谱鉴定其结构。

（2）完全抗原的制备：称取步骤（1）获得的安乃近半抗原H1-HS 1.1 mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1.3 mg，溶解于300 μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）2.2 mg，用50 μL pH = 4.6, 0.01M 2-(n-吗啉)乙基磺酸缓冲溶液（MES）充分溶解后，加入到上述H1-HS溶液中，室温搅拌反应6-8 h，得A液；取5 mg KLH，用0.01 M PBS溶解，得B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温搅拌反应过夜，得偶联物混合液。混合液在0.01M PBS 溶液中透析三天，最终得到安乃近人工抗原H1-HS-KLH，采用紫外吸收扫描方法鉴定。

所获得的安乃近人工抗原的鉴定：

（1）采用核磁共振和质谱技术鉴定半抗原。

（2）采用紫外法鉴定人工抗原的偶联效果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的分子的摩尔浓度与蛋白的摩尔浓度的比确定偶联比。

偶联比=偶联物中小分子的摩尔浓度/偶联物中蛋白的摩尔浓度。

本发明的有益效果：本发明成功合成了安乃近的人工抗原，合成步骤简单、安全、有效，完全可用于免疫分析中，为以后的研究提供了必需的人工抗原。

附图说明

图1安乃近人工抗原H1-BSA紫外鉴定图。

图2安乃近半抗原H1-HS的质谱鉴定图。

图3 安乃近人工抗原H1-HS-KLH紫外鉴定图。

具体实施方式

以下实施例中人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

实施例1 安乃近人工抗原H1-BSA的制备

称取H1 2.03 mg，溶解在500 μL超纯水中，再加入60 μL 2.5% 戊二醛溶液，冰浴搅拌15 min，得反应液A液。称取5 mg BSA，用1 mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）溶解，得B液。将A液逐滴加入到B液中，边加边搅拌，室温搅拌反应2 h，得偶联混合液。取10 cm透析袋 (蛋白截留：3kDa)，煮沸5 min，冷却至室温后，将偶联混合液加入透析袋中，并用pH=7.4、0.01M PBS透析3天，每6 h更换一次透析液，除去多余的小分子化合物，得到安乃近人工抗原H1-BSA，采用紫外吸收扫描方法进行鉴定，具体鉴定图如图1所示。

图1中，H1扫紫外时的浓度为12.5μg/mL，其分子量为203.24g/mol，计算其摩尔浓度为6.25×10^-5。H1在特征峰273 nm处的吸光值A1= 0.54474，可以得到ε=A1 / 6.25×10^-5=8716。

H1-BSA人工抗原偶联物在273 nm处的吸光值A2= 1.36652，BSA在该波长下吸光值A3=0.28902，则偶联物中H1的摩尔浓度为（A2-A3）/ε=1.236×10^-4，即为1.236×10^-4×203.24×10³=25.125μg/mL。

BSA的分子量为67000g/mol，扫紫外的浓度为500μg/mL，由此可计算偶联物中BSA的浓度为500μg/mL-25.125 μg/mL=474.875μg/mL，其摩尔浓度为474.875×10^-3 / 67000 =7.087×10^-6。

偶联比=1.236×10^-4 / 7.087×10^-6 =17.4。

实施例2 安乃近人工抗原H1-HS-KLH的制备

（1）安乃近半抗原H1-HS的合成：

称取4-氨基安替比林H1 50 mg，4-二甲氨基吡啶175 mg，丁二酸酐300 mg，溶于20 mL无水吡啶，60℃ 回流12 h。反应液蒸发浓缩，残留物溶解在10 mL水中，并用5 mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相。有机相经氮气吹干后，得到白色固体，即为安乃近半抗原H1-HS，采用核磁和质谱鉴定其结构，具体结构图如图2所示。

核磁鉴定结果：¹H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H, COOH), 9.08 (s,1H, NH), 7.52–7.48(m, 2H, H-1/H-5 PhPh), 7.36–7.29 (m, 3H, H-2/H-3/H-4 PhPh),3.03 (s, 3H, N-methyl), 2.53–2.46 (m, 4H, methylene), 2.09 (s, 3H, methyl)。

质谱鉴定结果如图2所示，H1-HS(C₁₅H₁₇O₄N₃) 分子量为303.24，在负离子模式下得到的母离子碎片是 m/z=302.24，在正离子模式下，得到的母离子碎片是 m/z=304.24。

（2）完全抗原的制备：称取步骤（1）获得的半抗原H1-HS 1.1 mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1.3 mg，溶解于300 μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）2.2 mg，用50 μL pH = 4.6, 0.01 M 2-(n-吗啉)乙基磺酸缓冲溶液（MES）充分溶解后，加入到上述H1-HS溶液中，室温搅拌反应6-8h，得A液；取5 mg KLH，用0.01 M PBS溶解，得B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温搅拌反应过夜，得偶联物混合液。混合液在0.01M PBS 溶液中透析三天，最终得到安乃近人工抗原H1-HS-KLH，采用紫外吸收扫描方法进行鉴定，具体鉴定图如图3所示。

图3中，H1-HS扫紫外时的浓度为250μg/mL，其分子量为303.24g/mol，计算其摩尔浓度为8.244×10^-4mol/mL。H1-HS在特征峰273nm处的吸光值A1= 0.47147，可以得到ε=A1/8.244×10^-4=571.89。

H1-HS-KLH人工抗原偶联物在273 nm处的吸光值A2= 0.44928，KLH在该波长下吸光值A3=0.5781，则偶联物中H1的摩尔浓度为（A2-A3）/ε=2.253×10^-4mol/mL，即为2.253×10^-4×303.24 ×10³=68.320μg/mL。

KLH的分子量为4000 000 g/mol，扫紫外的浓度为500 μg/mL，由此可计算偶联物中KLH的浓度为500μg/mL-68.320 μg/mL=431.68 μg/mL，其摩尔浓度为431.68 μg/mL×10^-3/4000 000 g/mol=1.079×10^-7 mol/mL。

偶联比=2.253×10^-4mol/mL / 1.079×10^-7 mol/mL=2088.04。