阅读说明：本技术 一种犬血清中白蛋白的提纯方法 (Purification method of albumin in dog serum ) 是由 石晶 赵健 陈宪平 陈放 付玉 侯强 董鹏 殷玉和 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种犬血清中白蛋白的提纯方法,通过乙醇两步法从犬血清中分离提纯白蛋白,其中,步骤S1采用温度≤-20℃的低温乙醇法,步骤S2采用温度65～68℃的热乙醇法。本发明提供的犬血清中白蛋白的提纯方法,采用乙醇两步法即可获得高纯度的犬血白蛋白,是一种快速、简单、高纯度及高回收率的从犬血清中提纯白蛋白的工艺方法,可应用于犬白蛋白药物以及犬相关疾病治疗药物的制备,工艺方法简单,节约资源,成本低,适合规模化生产。(The invention discloses a purification method of albumin in dog serum, which is used for separating and purifying the albumin from the dog serum by an ethanol two-step method, wherein a low-temperature ethanol method with the temperature of less than or equal to-20 ℃ is adopted in the step S1, and a hot ethanol method with the temperature of 65-68 ℃ is adopted in the step S2. The method for purifying the albumin in the dog serum provided by the invention can obtain the high-purity dog blood albumin by adopting an ethanol two-step method, is a quick, simple, high-purity and high-recovery-rate process method for purifying the albumin from the dog serum, can be applied to the preparation of dog albumin medicaments and medicaments for treating dog-related diseases, has the advantages of simple process method, resource saving and low cost, and is suitable for large-scale production.)

一种犬血清中白蛋白的提纯方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种犬血清中白蛋白的提纯方法。

背景技术

随着经济发展人民生活日益富足，越来越多的人们饲养宠物来陪伴自己和家人。犬是宠物种类中数量最多的，据不完全统计我国犬只数量多达1.2亿只。随着犬数量日益增多，犬疾病的发生在所难免，在犬病治疗过程中犬血白蛋白的使用是普遍和有效的，但市场中犬血白蛋白产品良莠不齐，存在着以次充好、以血清充当犬血白蛋白的情况。

在人血白蛋白提纯工艺中，普遍采用低温乙醇五步或者七步法能够逐级地将人血浆中各种成分分离纯化出来，操作繁琐，步骤多，试剂消耗大，成本高，我们虽然可以借鉴人血白蛋白纯化的工艺，但犬血清中的白蛋白和球蛋白为主要用于制药的物质，而其他成分现还没能形成产品，故若一味地模仿人血白蛋白低温乙醇逐成分分离会造成资源浪费和成本的增加，进而人血白蛋白分离纯化方法不能适用于犬血白蛋白分离纯化，更不利于犬血白蛋白的市场化。因此，现急需一种快速、简单、高纯度及高回收率的从犬血清中提纯白蛋白的工艺方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简单的犬血清中白蛋白的提纯方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种犬血清中白蛋白的提纯方法，通过乙醇两步法从犬血清中分离提纯白蛋白，其中，步骤S1采用温度≤-20℃的低温乙醇法，步骤S2采用温度65～68℃的热乙醇法，最终获得高纯度的犬血白蛋白。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，包括以下步骤：

步骤S1、低温乙醇法

将融化的血清，上清经澄清柱芯过滤后置于-8～-12℃环境中，pH值调至6.8～7.2，待温度降到10℃以下时，缓慢添加温度≤-20℃的95％乙醇，添加量为血清体积的25～30％，搅拌混匀后反应14～18h；搅拌均匀，离心，上清液即为犬血白蛋白粗提液；

步骤S2、热乙醇法

取步骤S1中的犬血白蛋白粗提液，加入氯化钠溶液，二者混合后氯化钠终浓度为0.85～0.92％(w/v)；在倒入辛酸钠粉末，使终浓度在0.75～0.85％(w/v)；pH值调至6.0～6.2，搅拌40～60分钟，即为水浴液；水浴液分装，密封，置于65～68℃水浴锅中水浴1小时以上；将水浴后液体置于-20℃中静置冷却12-16小时，即为冷却液；将冷却液用台式离心机5000g或以上离心力离心20-30分钟，收集上清；离心上清经500KDa超滤后，膜下液即为犬血白蛋白精纯原液。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，步骤S1中乙醇的添加量为血清体积的27％。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，步骤S1中反应时间为16小时。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，步骤S1中pH值调至7.0。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，步骤S2中氯化钠终浓度为0.9％(w/v)。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，步骤S2中辛酸钠终浓度在0.8％(w/v)。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，包括以下步骤：

步骤S1、低温乙醇法

将融化的血清进行16000rpm离心，上清经0.45um澄清柱芯过滤后置于-10℃环境中，pH值调至7.0，待温度降到10℃以下时，缓慢添加温度≤-20℃的95％乙醇，添加量为血清体积的27％，搅拌混匀后反应16h；搅拌均匀，经16000rpm离心，上清液即为犬血白蛋白粗提液；

步骤S2、热乙醇法

取步骤S1中的犬血白蛋白粗提液，加入氯化钠溶液，二者混合后氯化钠终浓度为0.9％(w/v)；再倒入辛酸钠粉末，使终浓度在0.8％(w/v)；pH值调至6.1，搅拌50分钟，即为水浴液；水浴液分装，密封，置于65～68℃水浴锅中水浴1小时以上；将水浴后液体置于-20℃中静置冷却14小时，即为冷却液；将冷却液用台式离心机5000g或以上离心力离心20分钟，收集上清；离心上清经500KDa超滤后，膜下液即为犬血白蛋白精纯原液。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，步骤S1或S2中采用pH值为4.0的HAC-NaAC缓冲溶液调节上清液pH值。

优选地，上述的犬血清中白蛋白的提纯方法，步骤S2中使用40℃～55℃注射用水配制成浓度为0.71M升的氯化钠溶液。

与现有技术相比，本发明的技术效果：

本发明提供的犬血清中白蛋白的提纯方法，采用乙醇两步法即低温乙醇法+高温乙醇法，即可获得高纯度(≥95％)的犬血白蛋白，是一种快速、简单、高纯度及高回收率的从犬血清中提纯白蛋白的工艺方法，可应用于犬白蛋白药物以及犬相关疾病治疗药物的制备，工艺方法简单，节约资源，成本低，适合规模化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的SDS-PAGE结果；其中，泳道1：蛋白Marker，泳道2：白蛋白浓缩液，泳道3：球蛋白。

图2为本发明对比例1提供的SDS-PAGE结果；泳道1：预染蛋白Marker(ThermoFisher#26616)；泳道2：犬血清；泳道3：水浴离心上清液；泳道4：水浴离心沉淀；泳道5：500KDa超滤膜下液；泳道8：低温乙醇法超滤膜下液；泳道9：10KDa浓缩液。

图3为本发明对比例2提供的SDS-PAGE结果；泳道1：蛋白Marker；泳道2：犬血清；泳道3：20％乙醇上清；泳道5：20％乙醇水浴离心上清；泳道6：20％乙醇水浴离心沉淀；泳道8：20％乙醇水浴离心上清超滤浓缩液。

具体实施方式

本发明的犬血清中白蛋白的提纯方法，通过乙醇两步法从犬血清中分离提纯白蛋白，其中，步骤S1采用温度≤-20℃的低温乙醇法，步骤S2采用温度65～68℃的热乙醇法，最终获得高纯度的犬血白蛋白。具体地，包括以下步骤：

步骤S1、低温乙醇法

将融化的血清离心，上清经澄清柱芯过滤后置于-8～-12℃环境中，pH值调至6.8～7.2，优选7.0；待温度降到10℃以下时，缓慢添加温度≤-20℃的95％乙醇，添加量为血清体积的25～30％，优选27％；搅拌混匀后反应14～18h，优选16小时；搅拌均匀，离心，上清液即为犬血白蛋白粗提液；

步骤S2、热乙醇法

取步骤S1中的犬血白蛋白粗提液，加入氯化钠溶液，二者混合后氯化钠终浓度为0.85～0.92％(w/v)；在倒入辛酸钠粉末，使终浓度在0.75～0.85％(w/v)；pH值调至6.0～6.2，优选6.1，搅拌40～60分钟，即为水浴液；水浴液分装，密封，置于65～68℃水浴锅中水浴1小时以上，优选66℃，水浴2小时；将水浴后液体置于-20℃中静置冷却12-16小时，即为冷却液；将冷却液用台式离心机5000g或以上离心力离心20-30分钟，收集上清；离心上清经500KDa超滤后，膜下液即为犬血白蛋白精纯原液。

其中，本发明的步骤S1中，pH值调至6.8～7.2，该pH值为球蛋白的等电点，在此pH值下球蛋白易聚集析出，经过试验，优选pH值7.0；步骤S1中乙醇的加入可破坏蛋白质溶解时的水化膜使蛋白质溶解度降低，其中也包括球蛋白；步骤S1中-8～-12℃环境中反应14～18h同样降低蛋白的溶解度，使球蛋白更快的聚集沉淀，反应时间优选为16小时。

在本发明的步骤S2中，氯化钠终浓度为0.85～0.92％(w/v)，优选0.9％(w/v)，在该浓度的氯化钠溶液中白蛋白溶解度最大；辛酸钠终浓度在0.75～0.85％(w/v)，优选0.8％(w/v)，辛酸钠与白蛋白可逆结合，可增加白蛋白的耐热性；pH值调至6.0～6.2，搅拌40～60分钟使白蛋白充分的溶解并与辛酸钠结合；水浴时在温度为65～68℃的水浴锅中水浴1小时以上，使除被辛酸钠保护的白蛋白外其他蛋白质热变性；静置-20℃中冷却12-16小时使变性的蛋白质聚集，便于离心。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。

实施例1 480瓶犬血清两步法提纯犬血白蛋白

1.材料

犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠

2.方法

将480瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(10℃)间隔10cm摆放融化，融化至瓶中只留有约直径3cm冰块，将犬血清及冰块一同倒入处理好的小不锈钢桶内，16000rpm管式离心后，再用0.45μm柱芯过滤犬血清去掉残存细胞及不溶蛋白成分；对澄清后犬血清进行称重，然后置于-10℃冰柜内，安装搅拌器，低速搅拌，用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至7.0，然后再搅拌过程中缓慢流加-20℃的95％乙醇，用量为澄清后血清体积的27％，流加速度约300ml/min，流加完毕后撤掉搅拌器，盖上桶盖反应16h；将反应液搅拌一下，16000rpm管式离心，收集上清，即为犬血白蛋白粗提液，称重并记录，单位为千克，数字记为M；

配置氯化钠溶液：使用50℃注射用水配制0.71M升的氯化钠溶液；

白蛋白粗提液桶上安装搅拌器，边搅拌犬血白蛋白粗提液边倒入氯化钠溶液，二者混合后氯化钠终浓度为0.9％(w/v)，倒入辛酸钠粉末，使其终浓度在0.8％(w/v)，完全溶解后用pH值为4.0的HAC-NaAC缓冲溶液将pH值调至6.1，搅拌60分钟，将混合液分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于66℃水浴锅中水浴2小时，回收水浴后混合液至洁净不锈钢桶内，置于-20℃冰柜中冷却过夜12小时；将冷却后的混合液用台式离心机5100g离心20分钟，收集上清，将上清经过500KDa膜包超滤，去除在水浴反应过程中产生的白蛋白多聚体，膜下液即为澄清透明的白蛋白溶液；再用10KDa膜包进行浓缩，用注射用水洗涤去除溶液中氯化钠、辛酸钠等无关成分，收集膜上液，留取样品做检测，然后用0.22um除菌滤芯进行除菌保护，置于4℃保存。

3.结果

使用澄清后犬血清共220.8千克，血清中白蛋白的含量为25g/L，纯化后最终获得犬血白蛋白浓缩液20升，蛋白含量100g/L，取40ul浓缩液与5×Protein loading buffer混匀，煮沸10分钟，上样10ul，SDS-PAGE(10％分离胶，5％浓缩胶)灰度扫描结果如图1泳道2所示，白蛋白纯度高达95％，回收率(纯化白蛋白量/原料中白蛋白量)达36.8％。

实施例2 240瓶犬血清两步法提纯犬血白蛋白

1.材料

犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠

2.方法

将240瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(12℃)间隔10cm摆放融化，融化至瓶中只留有约直径3cm冰块，将犬血清及冰块一同倒入处理好的小不锈钢桶内，16000rpm管式离心后，再用0.45μm柱芯过滤犬血清去掉残存细胞及不溶蛋白成分；对澄清后犬血清进行称重，然后置于-12℃冰柜内，安装搅拌器，低速搅拌，用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.8，然后再搅拌过程中缓慢流加-25℃的95％乙醇，用量为澄清后血清体积的30％，流加速度约300ml/min，流加完毕后撤掉搅拌器，盖上桶盖反应18h；将反应液搅拌一下，16000rpm管式离心，收集上清，即为犬血白蛋白粗提液，称重并记录，单位为千克，数字记为M；

配置氯化钠溶液：同实施例1；

白蛋白粗提液桶上安装搅拌器，边搅拌犬血白蛋白粗提液边倒入氯化钠溶液，二者混合后氯化钠终浓度为0.92％(w/v)；在倒入辛酸钠粉末，使终浓度在0.85％(w/v)；完全溶解后用pH值为4.0的HAC-NaAC缓冲溶液将pH值调至6.2，搅拌60分钟，将混合液分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于65℃水浴锅中水浴2小时，回收水浴后混合液至洁净不锈钢桶内，置于-20℃冰柜中冷却14小时；将冷却后的混合液用台式离心机5000g离心25分钟，收集上清，将上清经过500KDa膜包超滤，去除在水浴反应过程中产生的白蛋白多聚体，膜下液即为澄清透明的白蛋白溶液；再用10KDa膜包进行浓缩，用注射用水洗涤去除溶液中氯化钠、辛酸钠等无关成分，收集膜上液，留取样品做检测，然后用0.22um除菌滤芯进行除菌保护，置于4℃保存。

3.结果

使用澄清后犬血清共109.6千克，血清中白蛋白的含量为25g/L，纯化后最终获得犬血白蛋白浓缩液20升，蛋白含量100g/L，取40ul浓缩液与5×Protein loading buffer混匀，煮沸10分钟，上样10ul，SDS-PAGE(10％分离胶，5％浓缩胶)灰度扫描结果白蛋白纯度高达95％，回收率(纯化白蛋白量/原料中白蛋白量)达36.5％。

实施例3 480瓶犬血清两步法提纯犬血白蛋白

1.材料

犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠

2.方法

将480瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(20℃)间隔10cm摆放融化，融化至瓶中只留有约直径3cm冰块，将犬血清及冰块一同倒入处理好的小不锈钢桶内，16000rpm管式离心后，再用0.45μm柱芯过滤犬血清去掉残存细胞及不溶蛋白成分；对澄清后犬血清进行称重，然后置于-8℃冰柜内，安装搅拌器，低速搅拌，用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至7.2，然后再搅拌过程中缓慢流加-23℃的95％乙醇，用量为澄清后血清体积的25％，流加速度约300ml/min，流加完毕后撤掉搅拌器，盖上桶盖反应14h；将反应液搅拌一下，16000rpm管式离心，收集上清，即为犬血白蛋白粗提液，称重并记录，单位为千克，数字记为M；

配置氯化钠溶液：同实施例1；

白蛋白粗提液桶上安装搅拌器，边搅拌犬血白蛋白粗提液边倒入氯化钠溶液，二者混合后氯化钠终浓度为0.85％(w/v)，倒入辛酸钠粉末，使终浓度在0.75％(w/v)，完全溶解后用pH值为4.0的HAC-NaAC缓冲溶液将pH值调至6.0，搅拌40分钟，将混合液分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于68℃水浴锅中水浴1小时，回收水浴后混合液至洁净不锈钢桶内，置于-20℃冰柜中冷却16小时；将冷却后的混合液用台式离心机5100g离心30分钟，收集上清，将上清经过500KDa膜包超滤，去除在水浴反应过程中产生的白蛋白多聚体，膜下液即为澄清透明的白蛋白溶液；再用10KDa膜包进行浓缩，用注射用水洗涤去除溶液中氯化钠、辛酸钠等无关成分，收集膜上液，留取样品做检测，然后用0.22um除菌滤芯进行除菌保护，置于4℃保存。

3.结果

使用澄清后犬血清共218.4千克，血清中白蛋白的含量为25g/L，纯化后最终获得犬血白蛋白浓缩液20升，蛋白含量100g/L，取40ul浓缩液与5×Protein loading buffer混匀，煮沸10分钟，上样10ul，SDS-PAGE(10％分离胶，5％浓缩胶)灰度扫描结果白蛋白纯度高达95％，回收率(纯化白蛋白量/原料中白蛋白量)达36.4％。

对比例1

1.材料

犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠。

2.方法

将5瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(10℃)间隔10cm摆放融化，待完全融化后经4500rpm离心15分种，取上清称重；用纯化水配制相同体积稀释液(1.2％w/w辛酸钠+1.6％w/w氯化钠)，将血清与稀释液等比混合于不锈钢桶内，安装搅拌器，低速搅拌，缓慢滴加-20℃95％乙醇，滴加的总体积为混合液体积的10％，再用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.3，分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于60℃水浴锅中水浴45分种；水浴后用台式离心机5100g离心20分钟，上清经500KDa超滤收集膜下液，用注射用水洗涤去除溶液中氯化钠、辛酸钠等无关成分，膜下液经10KDa浓缩获得纯化液。

3.结果

使用血清原料3500ml，血清中白蛋白的含量为25g/L，回收白蛋白浓缩液700ml，蛋白含量为48mg/mL，回收率为37.84％，如图2泳道10所示白蛋白纯度为70％，内毒素40～80EU/mL，外检有严重乳光。

对比例1与实施例1相比，没有球蛋白等电点沉淀步骤，氯化钠和辛酸钠使用的终浓度等工艺参数也超出本方案范围，导致最终蛋白含量、纯度低，此外，外检有严重乳光问题出现，不符合注射生物制品要求。

对比例2

1.材料

犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠。

2.方法

将4瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(10)间隔10cm摆放融化，待完全融化后经4500rpm离心15分种，取上清称重；缓慢滴加-20℃的95％乙醇353ml，再用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至7.0，置于-20℃冰箱沉淀2小时，然后离心取上清；1:1混入室温注射用水，称重，添加0.6％(w/w)辛酸钠、0.8％(w/w)氯化钠，边搅拌边用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.3，搅拌1小时，分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于60℃水浴锅中水浴1小时；水浴后用台式离心机5100g离心20分钟，上清经500KDa超滤收集膜下液，称重并进行蛋白含量及纯化检测。

3.结果

使用血清2000ml血清中白蛋白的含量为25g/L，回收白蛋白浓缩液90.4ml，蛋白含量为100mg/mL，回收率为36.16％，如图3泳道8所示白蛋白纯度为82％。

对比例2同对比例1相比增加了一步低温乙醇(S1)沉淀，与对比例1相比，虽然提高了终产物白蛋白的纯度，降低了内毒素含量，但仍然达不到高纯度的要求。另外，本实验例发现，在热乙醇(S2)步骤中，辛酸钠的使用量不同是产生乳光的重要因素之一。

对比例3

1.材料

犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠。

2.方法

将50瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(10)间隔10cm摆放融化，待完全融化后经4500rpm离心15分种，取上清称重；缓慢滴加-20℃的95％乙醇4413ml，再用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至7.0，置于-20℃冰箱沉淀2小时；离心取上清，将上清分为5份，分别以不同的比例混入室温注射用水，称重，添加0.6％(w/w)辛酸钠、0.8％(w/w)氯化钠，边搅拌边用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.3，搅拌1小时，分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于60℃水浴锅中水浴1小时；然后水浴后用台式离心机5100g离心20分钟，上清经500KDa超滤收集膜下液，观察膜下液乳光情况。

3.结果

上清分别以不同比例混入室温注射用水后热乙醇法的乳光结果如表1所示，当上清与注射用水混合比例为1.2-1.6：1时，水浴离心后上清无乳光，为能够最大量的使用上清液进行水浴，提高效率，所以选择使用1.2-1.6：1作为上清混合注射用水的最加比例。

表1不用比例混合后热乙醇法乳光问题

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。