阅读说明：本技术 基于hrp催化聚苯胺原位生成用于afb1的检测方法 (Detection method for AFB1 based on HRP catalysis polyaniline in-situ generation ) 是由 刘元建 袁伟 熊晓辉 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法,包括以下步骤：DNA正四面体探针金电极的合成；将AFB1-HRP抗原分别与金电极孵育；然后将孵育后的金电极与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号获得标准曲线；将待测样品、AFB1-HRP与金电极孵育,然后与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号；通过聚苯胺的电化学信号对应于标准曲线得出AFB1的浓度。本发明利用DNA正四面体的刚性结构,将黄曲霉毒素B1鼠单抗有序组装在金电极表面,有效提高了抗原抗体专一性识别结合效率；相比传统的单链DNA或者11-巯基十一烷酸等小分子探针,电化学信号明显增强,方法灵敏度提升1~2个数量级。(the invention discloses a detection method for AFB1 based on HRP-catalyzed polyaniline in-situ generation, which comprises the following steps of synthesizing a DNA regular tetrahedron probe gold electrode, respectively incubating AFB1-HRP antigens with the gold electrode, reacting the incubated gold electrode with an aniline polymerization buffer solution to detect an electrochemical signal of polyaniline to obtain a standard curve, incubating a sample to be detected, AFB1-HRP and the gold electrode, reacting with the aniline polymerization buffer solution to detect the electrochemical signal of the polyaniline, and obtaining the concentration of AFB1 according to the standard curve corresponding to the electrochemical signal of the polyaniline.)

基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法。

背景技术

真菌毒素是指真菌生长繁殖过程中产生的次级代谢产物，其种类繁多，现已被分离鉴定的有400余种，主要包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮/醇等。真菌毒素一般都是相对分子质量小的物质，通常不被粮食谷物加工工艺或食品的烹调加热所破坏，所以在某种程度上比其他毒素如细菌毒素更危险。真菌毒素的社会危害极大，主要以黄曲霉毒素AFB1危害最大，同时也是危害中国少年儿童身体健康的主要原因，具有高致癌性。目前，国内谷物产品存在规模小、分散、晾晒方法不科学等问题，且AFB1检测产品良莠不齐，其影响了食品生产企业的自检和监管机构的监测效果。AFB1快检产品没有完全实现本土化，国外产品的垄断地位虽然已被打破，但依然占据很大的市场。为了阻止AFB1带来的食品安全问题和减少经济损失，开发AFB1快速、灵敏的检测方法显得尤其重要。

目前，我国绝大多数检测机构所采用的AFB1的检测方法主要分为三类：一类是生物学检测法，包括种子发芽试验、呕吐试验等，很不利于快速检测，已很少采用；一类是理化检测法，薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC虽然简便，但检出限高、灵敏度差，只能作半定量。HPLC虽然灵敏度高，但样品处理步骤烦琐、操作复杂、仪器设备要求高、标准品耗用大；另一类是免疫化学检测法，如ELISA方法和胶体金免疫层析方法。ELISA法特别适宜大批样品集中检测，胶体金免疫层析方法适合现场单个或少数样品即时检测，但是若样品前处理不当，极易导致假阳性的出现。荷兰EuroProxima公司、美国Beacon公司、北京望尔生物技术有限公司、杭州迪恩生物科技股份有限公司开发的基于酶联免疫试剂盒快检的假阳性率普遍较高。

因此开发一种简单、快速、准确检测谷物中的黄曲霉毒素AFB1新方法对于控制食品安全发生具有重要意义！

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于HRP催化聚苯胺原位生成用于谷物中AFB1的检测方法。本发明中针对苯胺聚合在正四面体探针表面后电化学性质发生明显变化，从而建立竞争法检测AFB1，其原理简单、可以达到高效快检，并实现检测仪器的小型化。本发明通过一种基于金电极表面功能化修饰单克隆抗体形成DNA正四面体探针，特异性识别AFB1-HRP抗原，然后催化苯胺原位沉积，竞争法检测AFB1。本发明利用DNA正四面体探针、苯胺沉积性质以及抗原抗体特异性识别性质，实现竞争法检测AFB1。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法，包括以下步骤：

1)DNA正四面体探针金电极的合成；

2)将已知不同浓度AFB1-HRP抗原分别与步骤1)得到的DNA正四面体探针金电极孵育；

3)然后将步骤2)孵育后的DNA正四面体探针金电极与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号获得AFB1-HRP抗原浓度与聚苯胺的电化学信号的标准曲线；

4)将未知浓度待测样品、AFB1-HRP与步骤1)得到的DNA正四面体探针金电极孵育，然后与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号；

5)通过聚苯胺的电化学信号对应于标准曲线得出AFB1的浓度。

本发明在DNA正四面体探针金电极合成之前，第一步是单抗隆抗体和真菌霉素的选择，本发明的单克隆抗体为黄曲霉毒素B1鼠单抗。

进一步的，本发明包括核酸序列的选择，本发明选择的是四条修饰后的核酸序列Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH。将这四种核酸序列进行人工合成得到四种核酸溶液。

其中，所述步骤1)的具体步骤如下：将4种核酸溶液、TCEP和TM buffer，混匀后在水浴加热，冷却得到溶液，然后在金电极表面滴加上述溶液室温下孵育，孵育后将电极浸泡在EDC和NHS混合溶液中室温活化，PBS清洗电极，加入黄曲霉毒素B1鼠单抗，继续孵育得到DNA正四面体探针金电极。

其中，所述4种核酸溶液分别为Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH，所述Tetra-A-COOH的核苷酸序列为：

COOH-TTTTTTTTTT-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA；

所述Tetra-B-SH的核苷酸序列为：

HS-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；

所述Tetra-C-SH的核苷酸序列为：

HS-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；

所述Tetra-D-SH的核苷酸序列为：

HS-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。

其中，四条修饰后的核酸序列(Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH)，等比例混合后，可以形成三个底端带有巯基(SH)，顶端带有羧基(COOH)的正四面体核酸纳米结构。SH可以与金电极通过Au-S共价键连接固定正四面体，而羧基则与后续中AFB1单克隆抗体进行偶联，形成检测探针；普通核酸单链如SH-Tetra-T₁₀-COOH或者小分子MUA虽然可以达到固定抗体的作用，由于只有一条链，不能做到和正四面体一样的有序排列；

作为进一步优选的，DNA正四面体探针金电极的合成步骤如下：将核酸序列(Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH)用TE buffer(10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)稀释至50μM；将黄曲霉毒素B1鼠单抗用PBS稀释至100ng mL^-1；AFB1-HRP用PBS稀释至10ng mL^-1，-20℃冷冻待用。取一EP管，加入核酸溶液(50μM Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH)各1μL，1μL 500mM TCEP，45μL TM buffer(20mM Tris，pH8.0，50mM MgCl2)，混匀后在95℃水浴加热10min，4℃下冷却30min，然后在金电极表面滴加上述溶液20μL，室温下孵育10～12h，孵育后将电极浸泡在1mL 1.66μM EDC和1mL4.15μMNHS混合溶液中室温活化2h，PBS清洗电极3遍以后，加入20μL 100ng mL^-1黄曲霉毒素B1鼠单抗，继续孵育10～12h，得到检测探针DNA正四面体探针金电极；

其中，所述步骤2)中的AFB1-HRP抗原的浓度为0.1～200ng/mL。

其中，所述步骤3)中的苯胺聚合缓冲液为醋酸-醋酸钠溶液、苯胺和过氧化氢配制而成。

其中，所述步骤3)中的DNA正四面体探针金电极与苯胺聚合缓冲液的体积比为：1∶100-1∶1000。

其中，所述步骤4)待测样品、AFB1-HRP与步骤1)得到的DNA正四面体探针金电极的体积比为1∶10-1∶30。

作为进一步优选的，所述步骤4)的未知浓度AFB1和已知固定浓度AFB1-HRP混合溶液与检测探针作用步骤如下：滴加20μL按照国标处理的实际样品和100ng mL^-1AFB1-HRP混合溶液到检测探针上，室温孵育2h。

作为进一步优选的，所述步骤4)的HRP催化苯胺沉积步骤如下：将检测探针修饰的金电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)室温孵育2h，进行示差脉冲伏安法检测。

作为进一步优选的，所述PBS缓冲溶液为含有NaCl和KCl的pH 7.2～7.4的10mM的PBS缓冲溶液，所述NaCl初始浓度为136.89mM，KCl初始浓度为2.67mM。

其中，所述待测样品为米、小麦、玉米、高粱、大麦、荞麦中的一种或几种。

其中，所述使用的DNA正四面体探针金电极的直径为2mm。

本发明还包括将传统单链DNA、11-巯基十一烷酸(MUA)与DNA正四面体检测探针进行对比实验，具体步骤如下：根据步骤1)分别合成传统单链DNA探针以及MUA探针后，其余步骤跟上述步骤2)～5)一样处理，进行示差脉冲伏安法检测，对比三种探针的检测效果。

本发明的原理：本发明在DNA正四面体三个顶点上标记巯基(SH)，通过Au-S共价键，将DNA正四面体纳米结构修饰在金电极表面。然后用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将DNA正四面体顶端的羧基活化，活化后的羧基与单克隆抗体耦合形成检测探针，利用抗原抗体专一性识别原理，促使样品中未知浓度的AFB1与已知浓度的AFB1-HRP竞争活性位点。苯胺在pH 4.3的缓冲溶液中发生质子化，可通过静电作用吸附到DNA正四面体纳米结构的磷酸骨架上。组装在金电极上的HRP催化苯胺在DNA纳米结构上原位聚合生成聚苯胺，通过示差脉冲伏安法观察电极电流和电位变化，以此竞争法检测谷物中黄曲霉毒素AFB1。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：

1)本发明利用DNA正四面体的刚性结构，将单克隆抗体有序排列在金电极表面，有效提高了抗原抗体专一性识别结合效率；

2)DNA正四面体纳米结构作为苯胺聚合的模板，富含磷酸双螺旋骨架，可吸附大量的苯胺，相比传统的单链DNA或者11-巯基十一烷酸(MUA)等小分子探针，DNA正四面体纳米结构灵敏度低至0.05ng ml^-1而传统的单链DNA灵敏度仅到10ng ml^-1；最低检测限提升200倍，方法灵敏度提升约2个数量级。

3)本发明不需要借助精密仪器检测，具有成本低、快速、简便、敏感且特异性好的优点。

附图说明

图1显示了基于HRP催化聚苯胺原位生成用于谷物中AFB1的检测方法的流程图；

图2A显示了循环伏安法；图2B显示了生物传感器的奈奎斯特图：a：裸金电极，b：DNA正四面体探针金电极，c：黄曲霉毒素AFB1抗体修饰后的电极，d：AFB1-HRP修饰后的电极，e：苯胺聚合后的电极；

图3显示了扫描速率对传感器的影响；图3A：聚合后金电极在不同扫描速率下的循环伏安曲线(不同速率(a)20，(b)50，(c)100，(d)150，(e)200，(f)250，(g)300，(h)350，(i)400，(j)450，(k)500mV s^-1)；图3B：峰电流对扫描速率平方根作图；图3C、图3D显示了苯胺聚合前后金电极的扫描电镜图；

图4显示了不同浓度AFB1-HRP进行优化验证图，a-f：0.1，1，10，50，100，200ng/mL；

图5显示了检测黄曲霉毒素AFB1特异性的电化学信号图，从图中可以DNA正四面体探针可以特异性识别黄曲霉毒素AFB1；

图6DNA正四面体探针的与SH-T10-COOH探针灵敏度比较；

图7显示了MUA探针、SH-T₁₀-COOH探针(ssP)与DNA正四面体探针(DTP)对比实验。

具体实施方式

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

本实验中用到的试剂和仪器：

核酸序列见下表购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，黄曲霉毒素B1-HRP(AFB1-HRP)、黄曲霉毒素B1-BSA(AFB1-BSA)、黄曲霉毒素(AFM1、AFFG1)、黄曲霉毒素B1鼠单抗(AFB1 mAb)、展青毒素(Patulin)、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤烯毒素(F-2)、呕吐毒素(DON)均购自于上海佑隆生物有限公司，米、小麦、玉米、高粱、大麦、荞麦购自苏果超市，醋酸钠(NaAc)，三(2-羧基)膦盐酸盐(TCEP)，PBS，11-巯基十一烷酸(MUA)，铁***(K₃[Fe(CN)₆])，亚铁***(K₄[Fe(CN)₆])，氯化钾(KCl)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，苯胺(aniline)，过氧化氢(H₂O₂)，乙二胺四乙酸(EDTA)，氯化镁(MgCl2)，电化学工作站(CHI750E)，扫描电子显微镜(JEM-2100，JEOL，Japan)，混合涡旋仪(IKA German)，离心机(Eppendorf German)。

表1.本发明所用到的核酸序列

实施例1 DNA正四面体探针金电极的合成及原理验证

分别将核酸(Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH)用TE buffer(10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)稀释至50μM；将黄曲霉毒素B1鼠单抗用PBS稀释至100ngmL^-1；AFB1-HRP用PBS稀释至10ng mL^-1，-20℃冷冻待用。

取一EP管，加入核酸溶液(50μM Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH)各1μL，1μL 500mM TCEP，加入TM buffer(20mM Tris，pH8.0，50mM MgCl2)45μL，混匀后在95℃水浴加热10min，4℃下冷却30min，然后在金电极表面滴加20μL孵育12h，孵育后将电极浸泡在1mL 1.66μM EDC和1mL 4.15uM NHS混合体系中室温活化2h，加入20μL 100ngmL^-1黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体，继续孵育12h后得到DNA正四面体探针金电极；

原理验证：往孵育12h后的DNA正四面体探针金电极中滴加20μL 10ng/mL AFB1-HRP抗原，孵育2h；将孵育后的电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡2h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH4.3)中使用电化学工作站对其进行循环伏安法以及奈奎斯特图，我们可以看出与裸金电极相比较苯胺聚合后有一个明显的氧化还原峰，是聚苯胺的氧化还原性质造成的，说明生成聚苯胺，结果见图2A(a-e：裸电极、正四面体电极、抗体修饰后电极、抗体抗原结合后电极、聚合后电极)；我们可以看出随着修饰的增多电极表面的电子转移电阻值会增加，但是当苯胺成功聚合后由于聚苯胺优良的导电性，其电极表面的电子转移电阻值会明显降低，其结果见2B(a-e：裸电极、正四面体电极、抗体修饰后电极、抗体抗原结合后电极、聚合后电极)。

实施例2生物传感器扩散性实验

对实施例1得到的DNA正四面体探针金电极表面滴加20μL 10ng mL^-1AFB1-HRP抗原，孵育2h后，将电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3，200Mm苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡6h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3)，使用电化学工作站在进行不同速率扫描((a)20，(b)50，(c)100，(d)150，(e)200，(f)250，(g)300，(h)350，(i)400，(j)450，(k)500mV s^-1)，我们可以看出这一聚合过程是处于扩散控制阶段，结果如图3A和3B；对处理前后的电极进行电镜扫描，我们可以看出从两张扫描电镜对比中可以看出，裸金电极表面光滑，无粒径；而聚合后金电极表面粒径均一，分散性好，表面聚苯胺在电极表面形成；结果如图3C和3D。

实施例3 AFB1-HRP用量的确定

对实施例1得到的DNA正四面体探针金电极表面滴加20μL不同浓度AFB1-HRP抗原(0.1，1，10，50，100，200ng/mL)，孵育2h后，将电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡2h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3)使用电化学工作站进行示差脉冲伏安法测量并观察信号变化。图4A显示的是不同浓度的HRP-AFB1对该传感器的DPV电流值的响应图；图4B显示的折线图对于4A响应值的一个更为直观的体现可以看出浓度的变化对其影响很大。实验结果见图4A、4B(a-f：0.1，1，10，50，100，200ng mL^-1)。

实施例4 DNA正四面体探针效果验证

将核酸序列(50μM Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH)用TEbuffer(10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)稀释至50μM得到核酸溶液；将黄曲霉毒素B1鼠单抗用PBS稀释至100ng/mL；AFB1-HRP抗原用PBS稀释至10ng/mL，-20℃冷冻待用。

取EP管，加入核酸溶液(50μM Tetra-A-COOH、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH)各1μL，1μL 500mM TCEP，加入TM buffer(20mM Tris，pH 8.0，50mM MgCl₂)45μL，混匀后在95℃水浴加热10min，4℃下冷却30min，然后在金电极表面滴加20μL孵育12h，孵育后将电极浸泡在1mL 1.66μM EDC和1mL 4.15μM NHS混合体系中活化2h，加入20μL 100ng/mL黄曲霉毒素B1鼠单抗，继续孵育12h后以形成DNA正四面体探针电极；

取EP管，分别加入核酸溶液(50μM SH-T10-COOH；MUA)各1μL，lμL 500mMTCEP，加入TM buffer(20mM Tris，pH 8.0，50mM MgCl₂)48μL然后在金电极表面滴加20μL孵育12h，孵育后将电极浸泡在1mL 1.66μM EDC和1mL 4.15μM NHS混合体系中活化2h，加入20μL100ng/mL黄曲霉毒素B1鼠单抗，继续孵育12h后制得SH-T10-COOH探针电极和MUA探针电极；

往孵育12h后的DNA正四面体探针电极、SH-T10-COOH探针电极和MUA探针电极分别滴加20μL 10ng/mL AFB1-HRP抗原，孵育2h；将孵育后的电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡2h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3)使用电化学工作站进行示差脉冲伏安法测量比较信号大小，在图5中我们可以看到，DNA正四面体探针电极的信号明显约为SH-T10-COOH探针电极和MUA探针电极信号的4倍，可能的原因是DNA正四面体探针是一种刚性结构比较稳定，同时也增强了抗原抗体的结合效率，而SH-T10-COOH探针电极和MUA探针电极是一种单链结构不够稳定导致抗原抗体结合较差。

实施例5方法灵敏度

对实施例1得到的DNA正四面体探针金电极表面滴加20μL 100ng/ml AFB1-HRP抗原和不同浓度黄曲霉毒素B1-BSA(0.05，0.1，0.5，1，5，10，20，50，70，100，and 150ng/mL)，孵育2h后，将电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡2h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3)使用电化学工作站进行示差脉冲伏安法测量并观察信号变化，结果见图6；

取EP管，分别加入核酸溶液(50μM SH-T10-COOH；MUA)各1μL，1μL 500mM TCEP，加入TM buffer(20mM Tris，pH 8.0，50mM MgCl₂)48μL然后在金电极表面滴加20μL孵育12h，孵育后将电极浸泡在1mL 1.66μM EDC和1mL 4.15μM NHS混合体系中活化2h，加入20μL100ng/mL黄曲霉毒素B1鼠单抗，继续孵育12h后制得SH-T10-COOH探针金电极，像得到的SH-T10-COOH探针金电极表面滴加20μL 100ng/ml AFB1-HRP抗原和不同浓度黄曲霉毒素B1-BSA(0.05，0.1，0.5，1，5，10，20，50，70，100和150ng/mL)，孵育2h后，将电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡2h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3)使用电化学工作站进行示差脉冲伏安法测量并观察信号变化，结果见图6，图6A显示出不同浓度AFB1与HRP-AFB1抗原竞争活性位点对于峰电流的响应，从图中可以看出检测的灵敏度非常高，图6B可以看出DNA正四面体纳米结构灵敏度低至0.05ng ml^-1，而传统的单链DNA灵敏度仅到10ng ml^-1；最低检测限提升200倍，方法灵敏度提升约2个数量级，因而认定DNA正四面体探针的灵敏度较SH-T10-COOH探针有数量级的优势。

实施例6特异性检测

取7个EP管每管分别加入AFB1-HRP抗原和不同真菌毒素的溶液，以配得终浓度为100ng/mL AFB1-HRP抗原和100ng/mL真菌毒素溶液，7管分别为100ng/mL AFB1-HRP抗原+10ng/mL AFB1-BSA、100ng/mL AFB1-HRP抗原+100ng/mL Patulin、100ng/mL AFB1-HRP抗原+100ng/mL OTA、100ng/mL AFB1-HRP抗原+100ng/mL F-2、10ng/mL AFB1-HRP抗原+100ng/mL DON、100ng/mL AFB1-HRP抗原+100ng/mL AFM1、100ng/mL AFB1-HRP抗原+100ng/mLAFG1，分别取20μL加入在实施例1制备的DNA正四面体探针电极中，进行竞争反应2h后，将电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡2h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3)使用电化学工作站进行示差脉冲伏安法测量并观察信号变化，结果见图7。从图7中可以看出AFB1和HRP-AFB1参与了与黄曲霉毒素B1鼠单抗的竞争，导致HRP-AFB1与DNA正四面体探针金电极结合量减少从而引起电化学信号的降低而其它六组由于不能参与竞争所以信号保持不变，因而本发明使用的DNA正四面体探针金电极对黄曲霉毒素B1具备高特异性识别能力。

实施例7实际样品检测

按照中国国家食品安全标准(GB 2761-2017)酶联免疫吸附筛查法处理的实际样品(米、小麦、玉米、高粱、大麦、荞麦)，首先分别称取至少100g样品，用研磨机进行粉碎，粉碎后的样品过1mm～2mm孔径试验筛。分别取5.0g样品于50mL离心管中，25.0mL准确加入甲醇水(1∶1)，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液，用PBS于样品提取液(1：1)稀释即得待测样液。

在实施例1得到的DNA正四面体探针金电极中，分别向金电极表面滴加10μL的上述处理的的实际样品(米、小麦、玉米、高粱、大麦、荞麦)，待孵育半小时后向其中滴加10μL10ng/mL AFB1-HRP抗原，进行竞争反应2h，将电极浸泡在500μL苯胺聚合缓冲液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3，200mM苯胺，20mM过氧化氢，新配置)，浸泡2h后，在20mL电解液(100mM醋酸-醋酸钠，pH 4.3)使用电化学工作站进行示差脉冲伏安法测量并观察信号变化，结果见表2。对所有的谷物产品(米、小麦、玉米、高粱、大麦以及荞麦)进行加标检测生物传感器的灵敏度并与ELISA试剂盒进行对比，首先我们要在国标的限量值进行检测以确保灵敏度可以得到国标的检测标准，可以应用实际样品的检测并比较ELISA试剂盒发现二者是可以相互媲美，之后我们对每种样品加标量分别减少和加大浓度并与ELISA试剂盒对比发现二者的结果相当，以此断定本发明的生物传感器的灵敏度与市售ELISA试剂盒回收率结果相当。表2中的生物传感器指的是实施例1得到的DNA正四面体探针金电极。

表2生物传感器和ELISA试剂盒在谷物样品中回收率对比.

^a粗体斜体数据是食品中真菌毒素中每种谷物样品的限量值，中国国家食品安全标准(GB 2761-2017).

^b每个数据点五次独立测量

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> Tetra-A-COOH(Artificial Sequence)

<400> 1

tttttttttt acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca 60

tagta 65

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> Tetra-B-SH(Artificial Sequence)

<400> 2

tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> Tetra-C-SH(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> Tetra-C-SH(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> Tetra-C-SH(Artificial Sequence)

<400> 5

tttttttttt t 11