阅读说明：本技术 经修饰的Cκ和CH1结构域 (Modified C kappa and CH1 domains ) 是由 王永强 方磊 王正毅 郭炳诗 臧敬五 于 2019-01-15 设计创作，主要内容包括：提供了具有经修饰的Cκ和CH1结构域的抗体和抗原结合片段,该经修饰的Cκ和CH1结构域仍然能够配对,但是与未经修饰的野生型CH1和Cκ结构域相比其配对减少。这些修饰对于制备具有两个不同对的Cκ和CH1结构域的双特异性抗体特别有用。(Antibodies and antigen-binding fragments are provided having modified ck and CH1 domains that are still capable of pairing but have reduced pairing compared to unmodified wild-type CH1 and ck domains. These modifications are particularly useful for making bispecific antibodies with two different pairs of C κ and CH1 domains.)

具体实施方式

实施例1四种Fab片段的Cκ/CH1界面相互作用分析

该实施例分析了一些抗体Fab片段的Cκ/CH1界面相互作用。

结构1：Fab 1F8的Cκ和CH1的界面相互作用分析

1F8是由对人CD47特异的抗体制备的Fab分子。2017年以的分辨率解析获得CD47与抗CD47 Fab 1F8的复合晶体结构(轻链具有219个氨基酸，其中Cκ包括第114-219位氨基酸；重链具有220个氨基酸，其中CH包括第119-220位氨基酸)。

在该Fab片段的Cκ和CH1结构域之间的界面中，总共有来自CH结构域的32个残基和来自Cκ结构域的35个残基。1F8在CH结构域的Ser14和Gly20之间具有连续的残基。与4NYL相比，来自CH片段的Lys16主链氧原子和来自Cκ片段的残基Lys100之间形成另外一个氢键(参见下面的结构4)。疏水相互作用类似于如下所示的其他结构。

氢键(距离截值：

注：

1.只要旋转Lys30的NZ，CH-Lys30和Ser24之间的HD可以在其他三种结构中形成。

2.因为序列不同于其他3个pdb，在CH-Lys16/Cκ-Lys100和CH-Ser102/Cκ-Glu106之间形成额外HD。

1F8的Cκ和CH1之间的盐桥

疏水界面

*在该表中也排除了涉及氢键和盐键的疏水接触

自由能偏差分析确定1F8 CH1中的一些残基与Cκ残基具有更强的相互作用(参见下表中的前10个残基，用粗体表示)。

1F8 CH1中的界面残基

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

在Cκ结构域中，七个残基可能参与相互作用。

在1F8 Cκ中的界面残基

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正直涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

结构2：1CZ8的Cκ和CH1的界面相互作用分析

1CZ8是由对VEGF特异的抗体制备的Fab分子。2000年，以的分辨率解析获得VEGF与Fab的复合晶体结构。

氨基酸残基在CH结构域中形成三个反向平行β折叠，在Cκ结构域中形成四个反向平行β折叠。这些β折叠在界面中形成面对面的构象。在该Fab片段的Cκ和CH1结构域之间的界面中，总共有来自CH的28个残基和来自Cκ结构域的30个残基。Cκ和CH1结构域之间存在三个氢键。例如，在1CZ8中，CH残基His 51以及Pro54和Leu57的主链氧原子分别与Cκ残基的Asn31、Ser55和Gln53形成三个氢键。这些氢键位于界面的一侧。

疏水相互作用主要位于界面的中心和另一侧，在CH残基Phe9、Leu11、Phe53、Val68和Cκ残基Gln17、Phe11、Val26、Phe69和Val28之间。在C末端的CH残基Lys96和Lys101与Cκ残基Asp15和Glu16之间形成两个盐桥，以稳定界面另一侧的CH和Cκ复合物结构(图1；与氢键相关的残基以粉红色着色；盐桥为黄色；疏水相互作用残基为蓝色或绿色的棍棒)。

氢键(距离截值：

Cκ和CH1之间的盐桥

疏水界面(距离截值：

对于Cκ和CH1相互作用最重要的5个界面残基

注意：排除了盐桥残基

自由能偏差分析确定1cz8 CH1中的一些残基与Cκ残基具有更强的相互作用(参见下表中的前9个残基，用粗体表示)。

界面残基：1cz8 CH1

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

在Cκ结构域中，五个残基可能参与相互作用。

界面残基：1cz8 Cκ

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

结构3：1L7I的Cκ和CH1的界面相互作用分析

1L7I是靶向ErbB2的已知Fab分子(PDB ID：1L7I)。该抗-ErbB2 Fab2C4的晶体结构在2002年以得到解析。

在该Fab片段(PDB ID 1L7i)的Cκ和CH1结构域之间的界面中，存在来自CH的总共33个残基和来自Cκ结构域的35个残基。

1L7i的氢键(距离截值：

1L7i的Cκ和CH1之间的盐桥

注意：CH的C末端残基Cys 107和Cκ的Cys 103形成二硫桥，其破坏在CH残基Lys101和Cκ残基Asp15之间的盐桥(其他结构中可见)。

1L7i的疏水界面

自由能偏差分析确定1L7i CH1中的一些残基与Cκ残基具有更强的相互作用(参见下表中的前12个残基，用粗体表示)。

界面残基：1L7i CH1

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

在Cκ结构域中，九个残基可能参与相互作用。

界面残基：1L7i Cκ

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

结构4：4NYL的Cκ和CH1的界面相互作用分析

所研究的第四种结构是4NYL，其为一种靶向TNFα的已知Fab分子(PDB ID：4NYL)。2014年以解析获得阿达木单抗FAB片段的晶体结构在(用相对高的Rfree(Rfree＝35.8％/R＝27.5)，这意味着该结构不适合于详细分析)。阿达木单抗是抗TNFα的抗体，用于治疗患有类风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎的患者，以及患有幼年特发性关节炎的儿童。在阿达木单抗Fab片段(PDB ID 4NYL)的Cκ和CH1结构域之间的界面中，总共有来自CH1的24个残基和来自CK结构域的28个残基。

4NYL具有与1CZ8相同的氢键和疏水相互作用。由于缺乏C-末端Ch残基，在CH的C-末端的残基Lys96和Cκ残基Glu15之间仅形成一个盐桥。

4NYL的氢键(距离截值：

注意：由于分辨率限制，未发现水介导的氢键。

4NYL的Cκ和CH之间的盐桥

注意：由于4NYL缺失C-末端残基100-103，因此在CH-Lys101和Cκ-Asp15之间没有盐桥。

4NYL的疏水界面

自由能偏差分析发现4NYL CH1中的一些残基与C_K残基具有更强的相互作用(参见下表中的前九个残基，表示为粗体)。

界面残基：4NYL CH1

位置	残基	键	ASA	BSA	DeltaG	DeltaG的绝对值
							53	PHE		96.83	95.9	1.53	1.53
9	PHE		97.57	74.98	1.2	1.2
							11	LEU		67.89	65.22	1.04	1.04
56	VAL		102.16	64.24	1.03	1.03
							28	LEU		56.92	51.23	0.82	0.82
54	PRO	H	117.72	48.38	0.65	0.65
							68	VAL		38.86	38.35	0.61	0.61
24	ALA		56.65	54.38	0.59	0.59
							51	HIS	H	109.04	76.51	0.54	0.54
70	THR		65.96	30.78	0.47	0.47
							12	ALA		65.59	34.43	-0.27	0.27
10	PRO		58.21	35.55	0.21	0.21
							96	LYS		71.02	8.03	0.13	0.13
13	PRO		110.53	7.16	0.11	0.11
							58	GLN		45.51	21.8	0.11	0.11
52	THR		68.63	7.32	-0.08	0.08
							57	LEU	H	105.07	6.99	-0.08	0.08
25	LEU		10.31	4.61	0.07	0.07
							66	SER		27.04	21.25	0.07	0.07
23	ALA		20.19	3.62	0.06	0.06
							22	THR		99.8	17.73	0.04	0.04
59	SER		129.22	4.43	-0.04	0.04
							30	LYS		68.02	48.93	-0.03	0.03
64	SER		15.79	1.32	-0.01	0.01

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

在Cκ结构域中，七个残基可能参与相互作用。

界面残基：4NYL Cκ

位置	残基	键	ASA	BSA	DeltaG	DeltaG的绝对值
							11	PHE		94.4	92.85	1.49	1.49
9	PHE		98.42	57.04	0.91	0.91
							28	LEU		53.03	53.03	0.85	0.85
57	THR		77.07	52.33	0.81	0.81
							26	VAL		46.03	45.87	0.73	0.73
53	GLN	H	146.87	74.61	-0.59	0.59
							30	ASN		53.19	42.51	-0.51	0.51
14	SER		73.33	53.83	0.41	0.41
							16	GLU		81.87	23.61	0.36	0.36
69	SER		36.91	32.06	0.36	0.36
							31	ASN	H	68.16	17.44	-0.21	0.21
22	THR		53.37	11.88	0.19	0.19
							67	SER		17.29	16.83	0.15	0.15
20	SER		77.72	8.53	0.14	0.14
							12	PRO		72.19	25.45	0.12	0.12
56	VAL		66.37	16.66	-0.12	0.12
							60	ASP		61.84	6.5	-0.11	0.11
73	THR		69.46	16.93	0.1	0.1
							17	GLN		47.27	41.79	0.08	0.08
24	SER		37.71	35.01	0.05	0.05
							54	GLU		93.02	10.6	-0.05	0.05
58	GLU		154.24	3.58	0.05	0.05
							10	ILE		33.1	3.56	-0.04	0.04
55	SER	H	70.17	60.32	0.04	0.04
							13	PRO		16.67	1.84	0.03	0.03
68	LEU		7.35	1.92	0.03	0.03
							71	THR		45.38	15.86	0.01	0.01

键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥

ASA：可及表面积

BSA：掩埋表面积

DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用

DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。

1cz8、4nyl、1l7i、hCD47-1_1F8的CH1_Cκ界面分析

上述四种结构的界面分析包括盐桥、氢键和疏水相互作用。计算所有DeltaG并且通过DeltaG对氨基酸进行排序。对于每种结构，选择前10对并进行进一步分析。分析集中在疏水相互作用，而不考虑其他相互作用。然后选择前5对作为主要的候选。

CH1的序列重新编号

Cκ的重新编号

1cz8、4nyl、1l7i和1F8的最高自由能残基汇总表

加粗:独特的残基下划线:低同源性残基

没有标记:保守残基

具有最稳定作用的残基

对于Cκ和CH1相互作用重要的5个界面残基(基于结构和自由能)

注意：排除了盐桥残基

实施例2发现对Cκ和CH1相互作用重要的界面残基

基于Cκ和CH1的界面分析，本实施例总结了对Cκ和CH1相互作用最重要的界面残基(参见下面的图2和表4)。

表4影响Cκ/CH1相互作用的残基对

注意：排除了盐桥残基

根据上表，使用丙氨酸或色氨酸单突变来测试每个界面残基。构建不含VH和VL的IgG(-Fv)并表达以筛选Ala和Trp。突变列表如下所列。

丙氨酸筛选

色氨酸筛选

名称	描述	Cκ	CH1
				Cκ/CH1_028	Cκ/CH1_A24W	WT	A24W
Cκ/CH1_029	Cκ/CH1_L11F	WT	L11F
				Cκ/CH1_030	Cκ/CH1_L11W	WT	L11W
Cκ/CH1_031	Cκ_F9A_F11A/CH1_L11F_A24F	F9A_F11A	L11F_A24F
				Cκ/CH1_032	Cκ_V26W/CH1	V26W	WT

如图3的SDS-PAGE图像所示，对于第2对(Cκ_F11_V26和CH1_L11)，两个突变体Cκ_F11A/CH1和Cκ_V26A/CH1强烈干扰了Cκ和CH1的相互作用；两个突变体Cκ_V26W/CH1和Cκ/CH1_L11W也破坏了相互作用(图4)。突变Cκ/CH1_L11A和Cκ/CH1_F9A(来自第1对)也破坏了相互作用。相反，突变体Cκ_F9A/CH1、Cκ/CH1_A24F和Cκ/CH1_A24L不影响Cκ和CH1的相互作用。这表明第3对(Cκ_F9和CH1_A24)对于Cκ和CH1的结合不重要。

配对编号	CH1	Cκ	重要与否
				第1对	Phe9	Gln17	是
第2对	Leu11	Phe11,Val26	是
				第3对	Ala24	Phe9	否

实施例3通过Discovery Studio开发配对1的突变

在鉴定对维持Cκ和CH1之间的相互作用重要的残基对后，本实施例测试了建立新的相互作用的突变对。这种研究成果的理论基础是：突变体Cκ可以显示出与突变体CH1的良好结合；但突变体Cκ不与野生型CH1结合或为弱结合，突变体CH1与野生型Cκ结合弱或不结合。

第1对突变的研究

第1对中的残基是Cκ_Q17和CH1_F9(表4)。本发明人设计并分析了Cκ/CH1_033至050的这些突变。Cκ/CH1_051-066突变对由软件程序Discovery Studio(DS)开发，用于设计该位点的随机突变。它在C_K_Q17和CH1_F9中生成了8对，如下所示。

突变	突变效能	影响	VDW	静电	熵	非极性
							H:PHE9>ILE.L:GLN17>HIS	0.03	中性	0.15	0.03	-0.07	0
H:PHE9>HIS.L:GLN17>ARG	0.07	中性	-1.42	1.4	0.09	0
							H:PHE9>LYS.L:GLN17>ASP	0.09	中性	2.15	-3.23	0.72	0
H:PHE9>HIS.L:GLN17>HIS	0.19	中性	0.16	-0.07	0.17	0
							H:PHE9>PRO.L:GLN17>ARG	0.25	中性	0.13	1.33	-0.55	0
H:PHE9>MET.L:GLN17>HIS	0.29	中性	0.12	0.09	0.21	0
							H:PHE9>GLN.L:GLN17>ARG	0.3	中性	-0.42	1.89	-0.49	0
H:PHE9>GLN.L:GLN17>HIS	0.33	中性	-0.46	-0.12	0.7	0

注意：突变效能：突变后效能的差别；低值意味着更稳定；VDW：范德华力。

Cκ/CH1_033	Cκ_Q17R/CH1	Q17R	WT
				Cκ/CH1_034	Cκ_Q17K/CH1	Q17K	WT
Cκ/CH1_035	Cκ_Q17D/CH1	Q17D	WT
				Cκ/CH1_036	Cκ_Q17E/CH1	Q17E	WT
Cκ/CH1_037	Cκ/CH1_F9R	WT	F9R
				Cκ/CH1_038	Cκ/CH1_F9K	WT	F9K
Cκ/CH1_039	Cκ/CH1_F9D	WT	F9D
				Cκ/CH1_040	Cκ/CH1_F9E	WT	F9E
Cκ/CH1_041	Cκ_F11E_V26A/CH1_L11R	F11E_V26A	L11R
				Cκ/CH1_042	Cκ_Q17K_F11K_V26A/CH1_F9E_L11E	Q17K_F11K_V26A	F9E_L11E
Cκ/CH1_043	Cκ_Q17R/CH1_F9D	Cκ_Q17R	CH1_F9D
				Cκ/CH1_044	Cκ_Q17K/CH1_F9D	Cκ_Q17K	CH1_F9D
Cκ/CH1_045	Cκ_Q17R/CH1_F9E	Cκ_Q17R	CH1_F9E
				Cκ/CH1_046	Cκ_Q17K/CH1_F9E	Cκ_Q17K	CH1_F9E
Cκ/CH1_047	Cκ_Q17D/CH1_F9R	Cκ_Q17D	CH1_F9R
				Cκ/CH1_048	Cκ_Q17D/CH1_F9K	Cκ_Q17D	CH1_F9K
Cκ/CH1_049	Cκ/CH1_F9D_L11A	Cκ	CH1_F9D_L11A
				Cκ/CH1_050	Cκ_Q17K/CH1_F9D_L11A	Cκ_Q17K	CH1_F9D_L11A
Cκ/CH1_051	Cκ_Q17H/CH1_F9I	Cκ_Q17H	CH1_F9I
				Cκ/CH1_052	Cκ_Q17R/CH1_F9H	Cκ_Q17R	CH1_F9H
Cκ/CH1_053	Cκ_Q17H/CH1_F9H	Cκ_Q17H	CH1_F9H
				Cκ/CH1_054	Cκ_Q17R/CH1_F9P	Cκ_Q17R	CH1_F9P
Cκ/CH1_055	Cκ_Q17D/CH1_F9H	Cκ_Q17D	CH1_F9H
				Cκ/CH1_056	Cκ_Q17I/CH1_F9H	Cκ_Q17I	CH1_F9H
Cκ/CH1_057	Cκ_Q17H/CH1_F9M	Cκ_Q17H	CH1_F9M
				Cκ/CH1_058	Cκ_Q17R/CH1_F9Q	Cκ_Q17R	CH1_F9Q
Cκ/CH1_059	Cκ_Q17H/CH1_F9Q	Cκ_Q17H	CH1_F9Q
				Cκ/CH1_060	Cκ_Q17H/CH1	Cκ_Q17H	CH1
Cκ/CH1_061	Cκ_Q17I/CH1	Cκ_Q17I	CH1
				Cκ/CH1_062	Cκ/CH1_F9I	Cκ	CH1_F9I
Cκ/CH1_063	Cκ/CH1_F9H	Cκ	CH1_F9H
				Cκ/CH1_064	Cκ/CH1_F9P	Cκ	CH1_F9P
Cκ/CH1_065	Cκ/CH1_F9M	Cκ	CH1_F9M
				Cκ/CH1_066	Cκ/CH1_F9Q	Cκ	CH1_F9Q

下面列出了两个好的突变对：

突变ID	位置编号	Kabat编号
			Cκ/CH1_043	Cκ_Q17R/CH1_F9D	Cκ_Q124R/CH1_F122D
Cκ/CH1_044	Cκ_Q17K/CH1_F9D	Cκ_Q124K/CH1_F122D

实施例4通过Discovery Studio开发第2对的突变

对于第2对，测试每个界面残基的丙氨酸/色氨酸单突变。构建并表达不含VH和VL的IgG(-Fv)用于Ala和Trp筛选。此示例使用Discovery Studio为该位置设计随机突变。

三个良好的突变对为下面列出的Cκ/CH1_072、Cκ/CH1_079和Cκ/CH1_107：

突变ID	位置编号	Kabat编号
			Cκ/CH1_072	Cκ_V26W/CH1_L11K_L28N	Cκ_V133W/CH1_L124K_L141N
Cκ/CH1_079	Cκ_F11W_V26G/CH1_L11W	Cκ_F118W_V133G/CH1_L124W
			Cκ/CH1_107	Cκ_V26W/CH1_L11W	Cκ_V133W/CH1_L124W

第2对突变的研究

第2对中重要的残基是Cκ_F11_V26和CH1_L11_L28(参见表4)。该热点的突变开发策略是为修复突变V26W或L11W。本实施例还测试了引入Cκ_F11_V26和CH1_L11_L28的饱和点突变；然后应用DS计算所有有效突变。

策略1：具有固定突变V26W的同时，针对CH1_L11_L28引入随机点突变；然后使用DS软件为该位置生成一些变异对。以下列出一些优选的突变对。

突变	突变效能	影响	VDW	静电	熵	非极性
							H:LEU11>VAL.L:VAL26>TRP	-0.14	中性	-0.31	0.11	-0.04	0
H:LEU11>ASN.L:VAL26>TRP	-0.08	中性	-0.56	0.29	0.06	0
							H:LEU11>MET.L:VAL26>TRP	-0.03	中性	-0.46	0.32	0.04	0
H:LEU11>ILE.L:VAL26>TRP	0.18	中性	-0.01	0.3	0.04	0
							H:LEU11>SER.L:VAL26>TRP	0.31	中性	-0.83	0.58	0.49	0
H:LEU11>GLU.L:VAL26>TRP	0.38	中性	-1.76	2.45	0.04	0
							H:LEU11>GLY.L:VAL26>TRP	0.41	中性	0.16	0.18	0.27	0

突变	突变效能	影响	VDW	静电	熵	非极性
							H:LEU28>SER.L:VAL26>TRP	-0.54	Stabilizing	-2.58	0.34	0.66	0
H:LEU28>GLU.L:VAL26>TRP	-0.5	Neutral	-4.5	3.13	0.21	0
							H:LEU28>ASN.L:VAL26>TRP	-0.43	Neutral	-2.26	0.37	0.58	0
H:LEU28>CYS.L:VAL26>TRP	-0.21	Neutral	-1.49	0.12	0.54	0
							H:LEU28>THR.L:VAL26>TRP	-0.09	Neutral	-1.22	0.3	0.42	0
H:LEU28>VAL.L:VAL26>TRP	-0.06	Neutral	-1.14	0.16	0.49	0
							H:LEU28>ALA.L:VAL26>TRP	0.1	Neutral	-1.04	0.12	0.64	0
H:LEU28>ASP.L:VAL26>TRP	0.38	Neutral	-2.6	2.36	0.57	0

策略2：具有固定突变L11W的同时，针对Cκ1_F11_V26引入随机点突变；然后使用DS软件为该位置生成一些变异对。以下列出一些优选的突变对。

突变	突变效能	影响	VDW	静电	熵	非极性
							H:LEU11>TRP.L:VAL26>LEU	-2.24	Stabilizing	-4.78	0.32	-0.01	0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>MET	-1.89	Stabilizing	-4.2	0.19	0.13	0
							H:LEU11>TRP.L:VAL26>TRP	-1.38	Stabilizing	-3.01	0.58	-0.19	0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>GLU	-1.21	Stabilizing	-3.88	0.87	0.34	0
							H:LEU11>TRP.L:VAL26>LYS	-0.9	Stabilizing	-5.72	3.44	0.27	0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>CYS	-0.84	Stabilizing	-1.95	0.12	0.09	0
							H:LEU11>TRP.L:VAL26>SER	-0.68	Stabilizing	-2.65	0.42	0.49	0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>ALA	-0.6	Stabilizing	-1.65	0.02	0.25	0
							H:LEU11>TRP.L:VAL26>GLY	-0.26	Neutral	-1.66	0.16	0.56	0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>PRO	-0.19	Neutral	-0.91	0.1	0.25	0

突变

突变效能

影响

VDW

静电

熵

非极性

H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS

-0.3

Neutral

-1.46

0.14

0.41

0

策略3：针对Cκ_F11_V26和CH1_L11_L28引入饱和点突变；然后使用DS计算所有有效突变。产生了下面列出的23个优选的突变对。

突变	突变效能	影响	VDW	静电	熵	非极性
							H:LEU11>VAL.L:VAL26>TRP	-0.14	Neutral	-0.31	0.11	-0.04	0
H:LEU11>ASN.L:VAL26>TRP	-0.08	Neutral	-0.56	0.29	0.06	0
							H:LEU11>MET.L:VAL26>TRP	-0.03	Neutral	-0.46	0.32	0.04	0
H:LEU11>MET.L:VAL26>GLU	0.14	Neutral	-0.04	-0.17	0.28	0
							H:LEU11>ASN.L:VAL26>GLU	0.16	Neutral	-0.65	0.14	0.47	0
H:LEU11>ILE.L:VAL26>TRP	0.18	Neutral	-0.01	0.3	0.04	0
							H:LEU11>PRO.L:VAL26>GLU	0.28	Neutral	0.39	-0.52	0.39	0
H:LEU11>MET.L:VAL26>LEU	0.3	Neutral	0.78	0.05	-0.13	0
							H:LEU11>SER.L:VAL26>TRP	0.31	Neutral	-0.83	0.58	0.49	0
H:LEU11>VAL.L:VAL26>GLU	0.34	Neutral	0.22	-0.32	0.44	0
							H:LEU11>GLU.L:VAL26>TRP	0.38	Neutral	-1.76	2.45	0.04	0
H:LEU11>GLY.L:VAL26>TRP	0.41	Neutral	0.16	0.18	0.27	0
							H:LEU11>ILE.L:VAL26>GLU	0.43	Neutral	0.38	-0.22	0.4	0
H:LEU11>MET.L:VAL26>MET	0.44	Neutral	0.91	0.01	-0.02	0
							H:LEU28>SER.L:VAL26>TRP	-0.54	Stabilizing	-2.58	0.34	0.66	0
H:LEU28>GLU.L:VAL26>TRP	-0.5	Neutral	-4.5	3.13	0.21	0
							H:LEU28>ASN.L:VAL26>TRP	-0.43	Neutral	-2.26	0.37	0.58	0
H:LEU28>CYS.L:VAL26>TRP	-0.21	Neutral	-1.49	0.12	0.54	0
							H:LEU28>THR.L:VAL26>TRP	-0.09	Neutral	-1.22	0.3	0.42	0
H:LEU28>VAL.L:VAL26>TRP	-0.06	Neutral	-1.14	0.16	0.49	0
							H:LEU28>ALA.L:VAL26>TRP	0.1	Neutral	-1.04	0.12	0.64	0
H:LEU28>ASP.L:VAL26>TRP	0.38	Neutral	-2.6	2.36	0.57	0
							H:LEU28>VAL.L:VAL26>GLU	0.42	Neutral	-0.19	-0.07	0.62	0

基于上述突变对，对于第1对，通过SDS-PAGE(还原和未还原，图4A-D)分析所有突变对；对于第2对，选择具有最低自由能的一些有效突变对进行分析。在所有突变对中，三个突变对Cκ/CH1_107更有效。结果可与已发表的突变对相媲美。构建不含VH和VL的IgG(-Fv)并表达每个突变对。突变列表如下所示。

三个良好的突变对是以下列出的Cκ/CH1_072、Cκ/CH1_079和Cκ/CH1_107：

Cκ/CH1_072	Cκ_V26W/CH1_L11K_L28N
		Cκ/CH1_079	Cκ_F11W_V26G/CH1_L11W
Cκ/CH1_107	Cκ_V26W/CH1_L11W

如图5A-5B中的SDS-PAGE凝胶图片所示，突变对Cκ_V26W/CH1_L11W重新建立了Cκ和CH1之间的结合(CK_L28Y_S69W/CH1_H51A_F53G用作对照)。

实施例5通过Discovery Studio改进突变对Cκ_V26W/CH1_L11W

策略4：具有固定突变Cκ_V26W和CH1_L11W的同时，针对Cκ_F11和CH1_L28引入饱和点突变；然后DS用于计算所有有效突变。产生了下面列出的23个优选的突变对。

实施例6突变对的开发

对于第2对，测试每个界面残基的丙氨酸/色氨酸单突变。构建不含VH和VL的IgG(-Fv)并表达，用于Ala和Trp筛选。突变列表如下所示。

名称	描述	Cκ	CH1
				Cκ/CH1_001	Cκ/CH1	WT	WT
Cκ/CH1_002	Cκ_L28Y_S69W/CH1_H51A_F53G	L28Y_S69W	H51A_F53G
				Cκ/CH1_003	Cκ/CH1_H51A_F53G	WT	H51A_F53G
Cκ/CH1_004	Cκ/CH1_D31K_F53T_V68F	WT	D31K_F53T_V68F
				Cκ/CH1_005	Cκ/CH1_F9A_F53A	WT	F9A_F53A
Cκ/CH1_006	Cκ_F9G_F11A_K100A/CH1	F9G_F11A_K100A	WT
				Cκ/CH1_007	Cκ_F11A/CH1	F11A	WT
Cκ/CH1_008	Cκ_F9A_F11A/CH1	F9A_F11A	WT
				Cκ/CH1_009	Cκ_F11A_K100A/CH1	F11A_K100A	WT
Cκ/CH1_010	Cκ_F9A_K100A/CH1	F9A_K100A	WT
				Cκ/CH1_011	Cκ/CH1_F9A_L11A	WT	F9A_L11A
Cκ/CH1_012	Cκ/CH1_L11A_F53A	WT	L11A_F53A
				Cκ/CH1_013	Cκ/CH1_F9A	WT	F9A
Cκ/CH1_014	Cκ/CH1_L11A	WT	L11A
				Cκ/CH1_015	Cκ_F9A/CH1	F9A	WT
Cκ/CH1_016	Cκ_F9A_F11M/CH1	F9A_F11M	WT
				Cκ/CH1_017	Cκ/CH1_A24F	WT	A24F
Cκ/CH1_018	Cκ/CH1_A24L	WT	A24L
				Cκ/CH1_019	Cκ_F9A_F11A/CH1_A24F	F9A_F11A	A24F
Cκ/CH1_020	Cκ_F9A_F11A/CH1_A24L	F9A_F11A	A24L
				Cκ/CH1_021	Cκ_F9A_F11M/CH1_A24F	F9A_F11M	A24F
Cκ/CH1_022	Cκ_F9A_F11M/CH1_A24L	F9A_F11M	A24L
				Cκ/CH1_023	Cκ_V26A/CH1	V26A	WT
Cκ/CH1_024	Cκ_V26A_F11A/CH1	V26A_F11A	WT
				Cκ/CH1_025	Cκ/CH1_L11F_L28G	WT	L11F_L28G
Cκ/CH1_026	Cκ_V26A/CH1_L11F_L28G	V26A	L11F_L28G
				Cκ/CH1_027	Cκ_V26A_F11A/CH1_L11F_L28G	V26A_F11A	L11F_L28G
Cκ/CH1_028	Cκ/CH1_A24W	WT	A24W
				Cκ/CH1_029	Cκ/CH1_L11F	WT	L11F
Cκ/CH1_030	Cκ/CH1_L11W	WT	L11W
				Cκ/CH1_031	Cκ_F9A_F11A/CH1_L11F_A24F	F9A_F11A	L11F_A24F
Cκ/CH1_032	Cκ_V26W/CH1	V26W	WT

实施例7盐桥改造

实施例1中Cκ和CH1的界面相互作用分析表明，1F8、1CZ8、1L7I和4NYL的CH1和Cκ之间的共同盐桥如下：

在1F8和1CZ8中还有一个盐桥：

因此，该实施例集中于具有两个盐桥的1F8的CH1和Cκ，并利用Discovery Studio在CH1和Cκ内设计新的盐桥对，其不利于突变的CH1或Cκ与其WT对应物的结合，并利用新的盐桥重建在突变的CH和Cκ之间的结合。

盐桥CH1_LYS96和Cκ_GLU16的设计。如下表所示，两对显示用新盐桥稳定CH1^mut和Cκ^mut：

CH1：LYS96>ASP突变和Cκ：GLU16>ARG突变；

CH1：LYS96>GLU突变和Cκ：GLU16>ARG突变；

Discovery Studio进一步用于发现新的盐桥，其可以与新的Cκ_V26W和CH1_L11W协同作用，以破坏突变的CH1或Cκ与其WT对应物的结合，并重建突变的CH和Cκ之间的结合。如下表所示：三对显示与Cκ_V26W和CH1_L11W协同作用稳定CH1^mut和Cκ^mut：

CH1：LEU11>TRP；LYS96>GLU突变和Cκ：GLU16>LYS；VAL26>TRP突变

CH1：LEU11>TRP；LYS96>GLU突变和Cκ：GLU16>ARG；VAL26>TRP突变

CH1：LEU11>TRP；LYS101>GLU突变和Cκ：ASP15>LYS；VAL26>TRP突变

表5：在CH1_K96/Cκ_E16中的突变

表6：在CH1_K101/Cκ_D15中的突变

实施例8改变盐桥的测试

构建含有编码CH1-CH2-CH3或Cκ的多核苷酸的质粒。在下面列出的一些结构域中引入突变。

将质粒瞬时转染到293F细胞中用于蛋白质表达。通过蛋白A柱和抗FLAG亲和凝胶纯化蛋白质，并通过SDS-PAGE(每泳道5μg)分析纯化的蛋白质。由于蛋白A仅与重链结合，轻链的密度表明重链和轻链之间的结合强度。

在第一批中，测试了13种抗体。表7列出了这些抗体中包含的突变。

表7测试具有突变的抗体

结果显示在图6A中。对于Cκ/CH1_001(野生型)和Cκ/CH1_107(CH1中的L11W和Cκ中的V26W)观察到良好的结合。Cκ/CH1_203包括破坏野生型盐桥(K96-E16)的正-负和负-正突变对。Cκ/CH1_210中的结合(CH1中的L11W和K96D和Cκ中的V26W和E16R)明显强于K96D和E16R之间的结合。相反，每个突变体链更明显地不能与野生型对应部分结合(参见，Cκ/CH1_208和Cκ/CH1_209)。

Cκ/CH1_207中的突变体链，具有L11W和K96E的CH1，以及具有E16K和V26W的Cκ在突变体内也显示出比其野生型对应物更强的结合(参见，Cκ/CH1_205和Cκ/CH1_206)。

在第二批中，测试了七种抗体。表8中列出了这些抗体中包含的突变。

表8测试具有突变的抗体

	蛋白名称	CH1-CH2CH3	Ck
				1	Cκ/CH1_001	Wt	Wt
2	Cκ/CH1_211	Wt	E16K
				3	Cκ/CH1_202	K96E	Wt
4	Cκ/CH1_212	K96E	E16K
				5	Cκ/CH1_205	L11W,K96E	Wt
6	Cκ/CH1_209	Wt	E16R,V26W
				7	Cκ/CH1_213	L11W,K96E	E16R,V26W

结果显示在图6B中。Cκ/CH1_213中的突变体链，具有L11W和K96E的CH1，以及具有E16R和V26W的Cκ在突变体内表现出比其野生型对应部分更强的结合(参见，Cκ/CH1_205和Cκ/CH1_206)。

在第三批中，测试了15种抗体。表9列出了这些抗体中包含的突变。

表9测试具有突变的抗体

如图6C所示，在Cκ/CH1_223(K101E-D15K)和Cκ/CH1_224(K101E-D15H)中重建的盐桥导致突变的重链和轻链之间的强相互作用，并且相比于Cκ/CH1_107(CH1中的L11W和Cκ中的V26W)，它们各自更明显地不能结合野生型的对应物。如图所示，突变体之间的强结合也基于L11W和V26W之间的疏水相互作用。换句话说，疏水相互作用和新盐桥之间的协同作用产生强结合和高特异性，这将有助于设计多特异性抗体。

实施例9双特异性抗体构建

为了进一步评估CH1/Cκ突变对轻链错配的影响，我们通过使用CH3结构域中的DE/EE突变使用IgG样异二聚体双特异性形式(J.Biol.Chem.(2017)292(35)14706–14717)。我们使用PDL1/CD73对构建了双特异性抗体。

PDL1/CD73对设计在下表中描述：

如图8A所示，通过ELISA发现，所有设计的对都不影响PDL1部分的结合，而CD47的结合效力受损。可以通过ELISA发现，B5024 Cκ/CH1_207突变(CH1：L11W/K96E；Cκ：E16K/V26W)和B5023Cκ/CH1_210突变(CH1：L11W/K96D；Cκ：E16R/V26W)恢复了CD73部分抗原结合。此外，PDL1单一测定和CD73酶活性测定显示与ELISA结合相似的模式(图8B)。在这方面，所有PDL1部分显示出相似的PDL1拮抗活性，并且仅B5024和B5023显示出有效的CD73拮抗活性。在该对中，PDL1的轻链显著损害CD73臂的功能，而CD73轻链对PDL1臂的作用很小。Cκ/CH1_207和Cκ/CH1_210突变均可恢复CD73的功能，并且不影响PDL1臂，表明CH1/Ck突变可以阻止轻链错配。

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