阅读说明：本技术 一种体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法 (Method for producing dicarboxylic acid by in vitro catalysis of omega-amino acid ) 是由 高超 严金鑫 马翠卿 许平 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法,是以ω-氨基酸为底物,加入ω-氨基酸氧化酶Am-AOX,黄嘌呤氧化酶和过氧化氢酶,构建多酶反应体系,通过体外多酶高效催化ω-氨基酸生产一系列二元羧酸,如琥珀酸、戊二酸和己二酸。本发明构建的体外催化体系中只底物和3种酶,不需外源添加任何辅因子和辅助底物,并且所用酶的数量也少于天然合成途径,生产成本低、操作简便、污染低,产物得率高、分离方便,具有良好的应用价值。(the invention discloses a method for producing dicarboxylic acid by catalyzing omega-amino acid in vitro, which takes the omega-amino acid as a substrate, adds omega-amino acid oxidase Am-AOX, xanthine oxidase and catalase to construct a multi-enzyme reaction system, and efficiently catalyzes the omega-amino acid to produce a series of dicarboxylic acid such as succinic acid, glutaric acid and adipic acid by the multi-enzyme in vitro. The in vitro catalytic system constructed by the invention only contains the substrate and 3 enzymes, does not need to add any cofactor and auxiliary substrate from external sources, has the advantages of less enzyme quantity than that of a natural synthetic approach, low production cost, simple and convenient operation, low pollution, high product yield, convenient separation and good application value.)

一种体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法

技术领域

本发明涉及一种二元羧酸的生产方法，尤其涉及一种体外纯酶催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法，属于二元羧酸的酶催化制备技术领域。

背景技术

二元羧酸是合成塑料，聚酯和尼龙的重要组成部分，具有巨大的市场和广泛的应用^[1]。目前二元羧酸主要是依赖化学石油合成的。如生产戊二酸的一般化学方法是通过丁内酯与***的开环水解生成^[2]。它也可以由1,3-二溴丙烷与***或***的反应，或通过环戊烯与离子液体的氧化裂解制备^[3]。己二酸是以硝酸为催化剂氧化环己酮和环己醇的混合物制得^[4]。但是上述化学方法工艺复杂，毒性高，污染严重。因此，研究者们致力于开发安全无污染的生产二元羧酸的方法，而构建生物技术途径从可再生原料中生产二元羧酸是目前最具有吸引力和可持续性的替代化学制备的方法^[5,6]。

目前已经有许多人构建了生物工程菌株用来合成二元羧酸，如琥珀酸，戊二酸和己二酸^[7-9]。但是由于微生物细胞内存在大量与目标代谢途径相竞争的代谢支路，微生物也需要进行代谢过程来支持自身生长，这就会导致目标产物的得率下降，从而阻碍使用工程菌株进行二元羧酸的工业生产。因此亟待开发一种低污染，高得率的生产二元羧酸的新方法。

ω-氨基酸在自然界中的分布较为广泛，并且可以从可再生资源中获得^[10,11]。检索发现体外纯酶催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法未见报道。

参考文献：

[1]Haushalter,R.W.,Phelan,R.M.,Hoh,K.M.,et al.(2017)Production ofodd-carbon dicarboxylic acids in Escherichia coliusing an engineered biotin-fatty acid biosynthetic pathway.J.Am.Chem.Soc.139:4615-4618.

[2]Paris,G.,Berlinguet,L.,Gaudry,R.,et al.(2003)Glutaric acid andglutarimide.Org.Synth.47.

[3]Vafaeezadeh,M.,and Hashemi,M.M.(2016)A non-cyanide route forglutaric acid synthesis from oxidation of cyclopentene in the ionic liquidmedia.Process Saf.Environ.Prot.100:203-207.

[4]Kruyer,N.S.,and Peralta-Yahya,P.(2017)Metabolic engineeringstrategies to bio-adipic acid production.Curr.Opin.Biotechnol.45:136-143.

[5]Chae,T.U.,Ahn,J.H.,et al.(2019)Metabolic engineering for theproduction of dicarboxylic acids and diamines.Metab.Eng.https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.03.005.

[6]Chung,H.,Yang,J.E.,Ha,J.Y.,et al.(2015)Bio-based production ofmonomers and polymers by metabolically engineered microorganisms.Curr.Opin.Biotechnol.36:73-84.

[7]Zhu,L.W.,and Tang,Y.J.(2017)Current advances of succinatebiosynthesis in metabolically engineered Escherichia coli.Biotechnol.Adv.35:1040-1048.

[8]Kim,H.T.,Khang,T.U.,Baritugo,K.A.,et al.(2019)Metabolicengineering of Corynebacterium glutamicum for the production of glutaricacid,a C5 dicarboxylic acid platform chemical.Metab.Eng.51:99-109.

[9]Skoog,E.,Shin,J.H.,Saez-Jimenez,V.,et al.(2018)Biobased adipicacid－The challenge of developing the production host.Biotechnol.Adv.36:2248-2263.

[10]Sattler,J.H.,Fuchs,M.,Mutti,F.G.,et al.(2014)Introducing an insitu capping strategy in systems biocatalysis to access 6-aminohexanoicacid.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53:14153-14157.

[11]Jorge,J.M.P.,Perez-Garcia,F.,and Wendisch,V.F.(2017)Anewmetabolic route for the fermentative production of 5-aminovalerate fromglucose and alternative carbon sources.Bioresour.Technol.245:1701-1709.

发明内容

针对现有技术中二元羧酸的污染严重，得率低，成本高，难以扩大其工业应用的不足，本发明要解决的问题是提供一种体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法。

本发明所述体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法，步骤是：

(1)以ω-氨基酸为底物，加入ω-氨基酸氧化酶Am-AOX(E.C.1.4.3.6)，黄嘌呤氧化酶XOD(E.C.1.1.3.22)和过氧化氢酶CAT(E.C.1.11.1.6)，建立多酶反应体系，进行纯酶催化反应，得到含二元羧酸的转化液；

(2)将所得的转化液加热使蛋白质变性沉淀，离心去除蛋白质，吸取上清稀释到适于测试的倍数后，用高效液相色谱仪分别测定反应体系中底物和产物的浓度，然后分离、纯化产物得到二元羧酸；

其特征在于：

步骤(1)所述底物ω-氨基酸选4-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸；所述ω-氨基酸氧化酶Am-AOX(E.C.1.4.3.6)来源于马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)DMKU3-1042，其因编号为AP012218.1，优化后的ω-氨基酸氧化酶基因核苷酸长度为2034个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述多酶反应体系中除底物和酶外还含有缓冲液和二价铜离子；所述酶催化反应条件是在37±1℃、pH 7.4±0.2的条件下，水浴摇床150±10转/分钟振荡反应3～30小时；

步骤(2)所述加热的条件是102±1℃煮沸15±2分钟，所述去除蛋白质的离心条件是：14,680±500转/分离心10～15分钟，所述二元羧酸是琥珀酸、戊二酸或己二酸。

上述体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法中：所述多酶反应体系中底物的浓度为10±2g/L，所述ω-氨基酸氧化酶的用量为0.7～3U/mL，所述黄嘌呤氧化酶的用量为0.7±0.1U/mL，所述过氧化氢酶的用量为120±10U/mL；所述缓冲液的浓度为50mM，所述二价铜离子的浓度为0.04mM。

其中：所述缓冲液优选pH值为7.4的PBS缓冲液；所述二价铜离子优选CuSO₄或CuCl₂。

上述体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法进一步优选的实施方式是：

步骤(1)中当底物选4-氨基丁酸且底物的浓度为10g/L；所述ω-氨基酸氧化酶的用量为3U/mL，所述黄嘌呤氧化酶的用量为0.7U/mL，所述过氧化氢酶的用量为120U/mL；所述酶催化反应的条件是在37℃、pH 7.4的条件下，水浴摇床150转/分钟振荡反应30小时，得到含琥珀酸的转化液。

步骤(1)中当底物选5-氨基戊酸且底物的浓度为10g/L；所述ω-氨基酸氧化酶的用量为1U/mL，所述黄嘌呤氧化酶的用量为0.7U/mL，所述过氧化氢酶的用量为120U/mL；所述酶催化反应的条件是在37℃、pH 7.4的条件下，水浴摇床150转/分钟振荡反应30小时，得到含戊二酸的转化液。

步骤(1)中当底物选6-氨基己酸且底物的浓度为10g/L；所述ω-氨基酸氧化酶的用量为0.7U/mL，所述黄嘌呤氧化酶的用量为0.7U/mL，所述过氧化氢酶的用量为120U/mL；所述酶催化反应的条件是在37℃、pH 7.4的条件下，水浴摇床150转/分钟振荡反应30小时，得到含己二酸的转化液。

上述体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法中，所述催化底物ω-氨基酸的测定方法是：将4-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸分别经PITC柱前衍生后采用HPLC以如下方法检测；

(1)PITC柱前衍生：待测样品于102±1℃煮沸15分钟，14,680±500转/分离心10～15分钟；取400μL样品上清、200μL PITC-乙腈溶液(100mM)以及200μL三乙胺-乙腈溶液(1M)震荡混匀，静置5分钟后再次震荡混匀，室温放置衍生1小时；加入800μL正己烷，涡旋震荡1分钟，12000±500转/分离心2分钟萃取；使用1mL注射器吸取下层溶液，经0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测分析，此过程中应避免吸到上层液体。

(2)HPLC检测方法：采用的色谱柱为ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×150mm)，柱温为38℃，流动相的流速为0.6mL/min，进样量10μL，检测器为光电二极管阵列检测器，检测波长设置为254nm，检测时间40分钟；流动相A为pH 6.5的100mM乙酸铵-乙腈溶液(v/v，97:3)，流动相B为乙腈溶液。线性梯度洗脱：0～20分钟流动相B的比例由18％提高至30％，在随后的20分钟内都维持在30％。

上述体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法中，所述催化产物二元羧酸的测定方法是：

所用高效液相色谱仪的型号是Agilent 1100Hewlett-Packard，配备示差折光检测器和Bio-Rad Aminex HPX-87H分析柱(300×7.8mm)，柱温为55℃，流动相10mM H₂SO₄，流速0.4mL/min，进样体积5μL，检测时间40分钟。

本发明公开了一种体外纯酶催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法，是以ω-氨基酸为底物，加入ω-氨基酸氧化酶Am-AOX，黄嘌呤氧化酶和过氧化氢酶，构建多酶反应体系，多酶催化途径包括：由ω-氨基酸氧化酶Am-AOX将ω-氨基酸氧化为二羧酸半醛；由黄嘌呤氧化酶将二羧酸半醛氧化生成二元羧酸。这两步反应都以氧气为直接的电子受体，由ω-氨基酸氧化酶Am-AOX和黄嘌呤氧化酶氧化过程中产生的H₂O₂被过氧化氢酶裂解生成H₂O和O₂(见图1)。本发明所述体外纯酶催化ω-氨基酸生产二元羧酸的反应结果见图3-5。实验显示：当以4-氨基丁酸为底物进行催化反应，催化反应30小时共消耗8.31g/L的4-氨基丁酸，琥珀酸积累8.05g/L，4-氨基丁酸到琥珀酸的整体得率为0.97g/g；当以5-氨基戊酸为底物进行催化反应，催化反应30小时共消耗6.85g/L的5-氨基戊酸，戊二酸积累6.33g/L，5-氨基戊酸到戊二酸的整体得率为0.92g g^-1；当以6-氨基己酸为底物进行催化反应，催化反应30小时共消耗6.40g/L的6-氨基己酸，己二酸积累7.07g/L，6-氨基己酸到己二酸的整体得率为1.10g/g。

本发明具有的突出特点和有益效果是：

(1)本发明设计的体外催化途径能够生产三种重要的二元羧酸：琥珀酸，戊二酸和己二酸，并且该途径还可以应用到其他二元羧酸的生产中。

(2)本发明所述的由ω-氨基酸生产二元羧酸的体外催化反应不需要添加辅酶因子和辅助底物，并且所用酶的数量也少于天然合成途径，生产成本低。

(3)本发明生产二元羧酸的体外催化反应操作过程简单，产物分离方便。

(4)本发明生产二元羧酸的原料利用率高，产物得率高，污染低。

附图说明

图1人工设计的体外酶促级联催化反应转化ω-氨基酸生产二元羧酸示意图；

其中，Am-AOX即为ω-氨基酸氧化酶；XOD即为黄嘌呤氧化酶；CAT即为过氧化氢酶；n＝2,3,4.。

图2 Am-AOX纯酶SDS-PAGE验证

图3体外催化4-氨基戊酸生产琥珀酸过程曲线。

图4体外催化5-氨基戊酸生产戊二酸过程曲线。

图5体外催化6-氨基己酸生产己二酸过程曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。所使用的菌株、材料、试剂等，如无特殊说明，均为从商业途径获得。

实施例1体外催化4-氨基丁酸生产琥珀酸

在本发明中，ω-氨基酸氧化酶Am-AOX来源于马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)DMKU3-1042，基因编号为AP012218.1。以大肠杆菌Escherichia coli BL21为宿主对该基因进行密码子优化，由上海生工生物工程股份有限公司全基因合成密码子优化后的基因，获得E.coli Top10/pETDuet-Am-AOX菌株；提取该菌株中的表达质粒pETDuet-Am-AOX，将pETDuet-Am-AOX转化至表达菌株E.coli BL21中，并进行蛋白质表达与纯化，纯化结果见附图2；优化后的ω-氨基酸氧化酶基因序列长度为2034个碱基，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明中，黄嘌呤氧化酶购买自Sigma公司，产品编号为X4875；过氧化氢酶购买自Worthington公司。

在一个5毫升体系中，使之含有50mM PBS缓冲液(pH 7.4)，3U/mL的ω-氨基酸氧化酶，0.7U/mL的黄嘌呤氧化酶和120U/mL的过氧化氢酶，10g/L的4-氨基丁酸和0.04mM的铜离子(CuCl₂)，在37±1℃，150转/分钟的条件下水浴摇床振荡反应30个小时，得到含琥珀酸的转化液。其中，每催化3小时取样检测4-氨基丁酸的消耗和琥珀酸的生成；将所得的转化液，以102±1℃煮沸15分钟使蛋白质变性沉淀，14,680±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的蛋白质，吸取上清稀释到适于测试的倍数后进行高效液相色谱分析，测定催化体系中底物和产物的浓度。

进一步的，对含琥珀酸的转化液按常规方法分离、纯化，得到产物琥珀酸。

结果显示：催化反应30小时共消耗8.31g/L的4-氨基丁酸，琥珀酸积累8.05g/L，4-氨基丁酸到琥珀酸的整体得率为0.97g/g。

实施例2体外催化5-氨基戊酸生产戊二酸

参照实施例1所述方法制备来源于马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianusDMKU3-1042的ω-氨基酸氧化酶。

黄嘌呤氧化酶购买自Sigma公司，产品编号为X4875；过氧化氢酶购买自Worthington公司。

在一个5毫升体系中，使之含有50mM PBS缓冲液(pH 7.4)，1U/mL的ω-氨基酸氧化酶，0.7U/mL的黄嘌呤氧化酶和120U/mL的过氧化氢酶，10g/L的5-氨基戊酸和0.04mM的铜离子(CuSO₄)，在37±1℃，150转/分钟的条件下水浴摇床振荡反应；反应30个小时，得到含戊二酸的转化液。其中，每催化3小时取样检测5-氨基戊酸的消耗和戊二酸的生成；将所得的转化液，以102±1℃煮沸15分钟使蛋白质变性沉淀，14,680±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的蛋白质，吸取上清稀释到适于测试的倍数后进行高效液相色谱分析，测定催化体系中底物和产物的浓度。

进一步的，对含戊二酸的转化液按常规方法分离、纯化，得到产物戊二酸。

结果显示：催化反应30小时共消耗6.85g/L的5-氨基戊酸，戊二酸积累6.33g/L，5-氨基戊酸到戊二酸的整体得率为0.92g/g。

实施例3体外催化6-氨基己酸生产己二酸

参照实施例1所述方法制备来源于马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianusDMKU3-1042的ω-氨基酸氧化酶。

黄嘌呤氧化酶购买自Sigma公司，产品编号为X4875；过氧化氢酶购买自Worthington公司。

在一个5毫升体系中，使之含有50mM PBS缓冲液(pH 7.4)，0.7U/mL的ω-氨基酸氧化酶，0.7U/mL的黄嘌呤氧化酶和120U/mL的过氧化氢酶，10g/L的6-氨基己酸和0.04mM的铜离子(CuSO₄)，在37±1℃，150转/分钟的条件下水浴摇床振荡反应；反应30个小时，得到含己二酸的转化液。其中，每催化3小时取样检测6-氨基己酸的消耗和己二酸的生成；将所得的转化液，以102±1℃煮沸15分钟使蛋白质变性沉淀，14,680±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的蛋白质，吸取上清稀释到适于测试的倍数后进行高效液相色谱分析，测定催化体系中底物和产物的浓度。

进一步的，对含己二酸的转化液按常规方法分离、纯化，得到产物己二酸。

结果显示：催化反应30小时共消耗6.40g/L的6-氨基己酸，己二酸积累7.07g/L，6-氨基己酸到己二酸的整体得率为1.10g/g。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一种体外催化ω-氨基酸生产二元羧酸的方法

<141> 2019-8-12

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2034

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）DMKU3-1042

<221> ω-氨基酸氧化酶基因核苷酸序列

<400> 1

atgaccaagc acatcttcga cccgatcagc gacgacgaaa tccgtaccac cactaagctg 60

ctgaaggacc tgaacggcga tgctaaggtc catttcgccc agatcgaccg tctggaccca 120

ccaaagaaac aagcgatcga atacctgaac atcgagcgtt acggtggcgg cgatctgcca 180

tacattcctc gtcgtactta cgcatactat tacctgaacg acaagatgcc actgttcaag 240

gctatctgca acgtcagcga gaaccacgta atctgcaacg tggagactcc agagggcact 300

gtcggtccac tgctgcctga tgatatggca aaagcagaag aggcaatcat gaagcaccct 360

atcgtcctgg ctgaaatcgc aaaactgaaa ctggacgacc tgtactacac ccacgcacgt 420

ctgggtaaac tgaaatacaa agtcgtgtgc gagccttgga tgtacggtac ggacggtcct 480

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gagggtctga aaccgctgct gattcagcaa ccggaaggtg cttctttctc tatcgacggt 780

actaaaatcg aatggcaggg ttgggaattc cgcatcgcaa ctaacgtgcg tgaaggtttc 840

gcactgtacg acatccactt caaaggccgt agcatctgct accgtgctag cctggaagaa 900

atgactgtgc cgtacctgga cccgcgtgct ccgtaccatc gtaaacaagc ttttgatctg 960

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gaaaactcca ttaacccggt gaccaacaaa ccggtgggct ataagttcga aatgccggcc 1620

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aaacagattt gggttaccaa atatgcggac gaccgcatgt atgcggcggg cgaattcacc 1740

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cacaatccgg cgctggatgt tccgctggcc aataacaact tcaacaaatc cgtatattat 1980

gaagatgcga ccaaaaacgc ggaaaaaccg tccagcggct gctgcaaaat gtaa 2034