一种co2生物转化定向生产丁二酸的方法
阅读说明：本技术 一种co2生物转化定向生产丁二酸的方法 (CO (carbon monoxide)2Method for directionally producing succinic acid through biotransformation ) 是由 王雯 赵晴 张燚 杨紫怡 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种CO-2生物转化定向生产丁二酸的方法,包括如下步骤：配制产丁二酸纯菌株适宜生长的培养基,接种产丁二酸纯菌株进行培养,得到指数增长期的产丁二酸纯菌；将活性金属催化剂的前驱体进行处理,并研磨得固体催化剂颗粒；向生物发酵培养基中加入底物、酸中和剂和固体催化剂颗粒,得到混合生物发酵培养基；将产丁二酸纯菌接种至混合生物发酵培养基中,在厌氧条件下混和均匀,得转化CO-2生产丁二酸的生物发酵体系；向反应器中通入足量CO-2,在厌氧条件下进行丁二酸的生产。本发明将底物、酸中和剂和催化剂与纯菌发酵耦合形成优化的生物发酵体系,该优化体系能够将能够加快CO-2的固定和利用,同时能够稳定定向生产高浓度丁二酸。(The invention discloses CO 2 The method for producing the succinic acid directionally by biotransformation comprises the following steps: preparing culture medium suitable for growth of pure succinic acid-producing strain, inoculating pure succinic acid-producing strain, and culturing to obtain product with index increasing periodSuccinic acid pure bacteria; treating a precursor of the active metal catalyst, and grinding to obtain solid catalyst particles; adding a substrate, an acid neutralizer and solid catalyst particles into a biological fermentation culture medium to obtain a mixed biological fermentation culture medium; inoculating pure succinic acid-producing bacteria to a mixed biological fermentation culture medium, and mixing uniformly under anaerobic condition to obtain converted CO 2 A biological fermentation system for producing succinic acid; introducing sufficient CO into the reactor 2 The production of succinic acid is carried out under anaerobic conditions. In the invention, the substrate, the acid neutralizer and the catalyst are coupled with pure bacteria fermentation to form an optimized biological fermentation system, and the optimized system can accelerate CO 2 Can stably and directionally produce high-concentration succinic acid.)
技术领域
本发明涉及一种丁二酸生产的方法。更具体地，涉及一种CO2生物转化定向生产丁二酸的方法。
背景技术
目前，日益增长的人口以及不断扩展的工业化导致全球能源的消耗急剧增加，同时导致大量CO2排放，从而引起全球温度升高和冰川融化等严重问题。因此，寻找可再生的能源和减少CO2的排放等问题亟待解决。与常规的物理化学技术相比，通过厌氧微生物发酵技术进行碳的捕获和封存是一种生态友好手段，有效减少大气中CO2的同时可以对CO2进行资源化利用，将其转化为高附加值化学品或者燃料。
丁二酸(简称：SA)是一种重要的四碳化合物，不仅可以用作各种精细化学品的前体，包括1,4-丁二醇，四氢呋喃，γ-丁内酯，四氢呋喃，N-甲基2-吡咯烷酮，2-吡咯烷酮，琥珀酰亚胺，琥珀酸酯等，还在制造聚琥珀酸丁二酯(简称：PBS)，表面活性剂和清洁剂，香料和香精，除草剂和杀真菌剂以及食品添加剂等方面具有巨大潜力。由于其广泛的工业应用，全球对SA的需求已从2014年的3～5万吨/年增长到2020年的预估市场规模超过70万吨/年。目前已开发了生产丁二酸的各种化学技术，包括石蜡氧化，催化氢化和马来酸或马来酸酐的电解还原。但是这些方法会消耗不可再生的石油化学资源，同时会带来严重的环境问题。近年来，由可再生自然资源生物质发酵生产丁二酸受到越来越多的关注。利用可再生生物质作为底物，在温和的发酵条件下定向转化为丁二酸，可以实现较高的转化率和发酵效率。与石化合成工艺相比，生物发酵生产丁二酸更具成本效益且更加环保，可以延缓非生物资源的枯竭和其他环境问题。目前，已筛选出许多可以生产SA的真菌和细菌，包括Saccharomyces cerevisiae，Yarrowia lipolytica，Byssochlamysnivea，Paecilomycesvarioti，Actinobacillus succinogenes,Anaerobiospirillum succiniciproducens,Mannheimia succiniciproducens,Escherichia coli，Corynebacterium glutamicum，Basfia succiniciproducens等。
研究发现，在生物发酵生产丁二酸过程中，底物通过酶水解和糖酵解途径转化为主要中间体烯醇式丙酮酸(简称：PEP)，在高浓度CO2(1mol CO2/1mol葡萄糖)环境下将PEP逐步转化最终合成丁二酸；或者在低浓度CO2(0.1mol CO2/1mol葡萄糖)条件下PEP通过反向三羧酸(TCA)循环转化为丙酮酸，最终形成一元酸和一元醇(乙酸，甲酸，乳酸和乙醇)，决定这2条途径的关键因素是CO2的可利用程度。但CO2在水中的溶解度不高(1.13g/L,37℃),气液传质速率慢，在生物发酵过程中易累积大量的副产物(乳酸，甲酸和乙酸)，造成丁二酸产率低，CO2定向转化效果差等，这使得实现生物发酵生产丁二酸达到工业生产的要求比较困难。
综上所述，需要提供一种优化CO2生物转化定向生产丁二酸的方法，提高其生产丁二酸的产量和产率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种优化CO2生物转化定向生产丁二酸的方法。该方法将特定的底物种类、酸中和剂和催化剂与纯菌发酵耦合形成特定生物发酵体系，该体系能够将CO2定向转化为高浓度的丁二酸，并在特定的底物种类、酸中和剂和催化剂的强化下加速CO2生物转化为丁二酸的代谢速率并提高其选择性。该发酵系统能够维持2-200h的稳定高效运行，催化剂在反应体系中不易失活，也不易造成纯菌株的死亡。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种CO2生物转化定向生产丁二酸的方法，包括如下步骤：
S1、配制产丁二酸纯菌株适宜生长的培养基，接种产丁二酸纯菌株进行培养，得到指数增长期的产丁二酸纯菌；
S2、将活性金属催化剂的前驱体进行处理，并研磨得到固体催化剂颗粒；
S3、向生物发酵培养基中加入底物、酸中和剂和固体催化剂颗粒，得到混合生物发酵培养基；
S4、将产丁二酸纯菌接种至混合生物发酵培养基中，在厌氧条件下混和均匀，得到转化CO2生产丁二酸的生物发酵体系；
S5、向含有生物发酵体系的摇床反应器中通入足量CO2，在厌氧条件下进行丁二酸的生产。
本发明中，术语“指数增长期”是指当微生物在一个密闭系统培养(分批培养)时，根据微生物的生长速度和比生长速度的变化情况，当微生物生长一定阶段后，微生物的比生长速度达到最大，此时称为指数增长期，在指数增长期中若没有抑制或限制微生物生长的因素存在，微生物会保持一个恒定的最大的比生长速度生长，细胞数量呈指数递增。
本发明中，术语“催化剂”是指能够促进CO2生物转化为丁二酸的固体颗粒，是一种混合物而非一种化合物。
本发明中，术语“生物发酵体系”是指反应器中纯菌株、混合生物发酵培养基整体作为“发酵条件”而存在，在本发明中形式上是一种纯菌、混合生物发酵培养基的混合物。
优选的，步骤S1中，所述培养基的配方为每升溶液中含有以下的物质：0.75g磷酸二氢钾，0.75g磷酸氢二钾，0.45g 2-乙烷磺酸，5g酵母提取物，2.5g玉米浆，0.006g亚硒酸钠，1.008g氯化钠，0.008g钨酸钠，0.5g氢氧化钠，1.5g四水合氯化亚铁，0.19g六水合氯化钴，0.1g四水合氯化锰，0.07g氯化锌、0.006g硼酸、0.036g钼酸钠，0.024g六水合氯化镍，0.002g二水合氯化铜，0.5g六水合氯化镁，0.3氯化铵，0.3g氯化钾，0.015g二水合氯化钙，10mg刃天青(氧气指示剂)，0.015g硫化钠，0.024g L(+)-半胱氨酸和0.077g DL-二硫苏糖醇。
优选地，步骤S1中，在接种产丁二酸纯菌株进行培养之前，对所述培养基在90-130℃，0.1-0.25MPa压力下蒸汽灭菌20-30min。
优选地，步骤S1中，所述培养基的pH为6.0-7.5。
优选地，步骤S1中，所述培养基的温度为30-45℃。
根据本发明的某些实施方式，步骤S1中，所述产丁二酸纯菌株可选自现有公知能够进行产丁二酸的纯菌；其培养基成分为能够满足纯菌株的生长和生产丁二酸时的基础营养液和其他成分。
优选地，步骤S1中，所述产丁二酸纯菌株选自德国微生物菌种保藏中心和美国典型培养物保藏中心销售的菌株。一般包括细菌，真菌和基因工程菌：A.succinogenes FZ53，A.succinogenes 130Z，A.succinogenesNJ113，A.succinogenes CGMCC1593，A.succiniciproducens ATCC53488，A.succiniciproducens ATCC29305，M.succiniciproducens MBEL55E，B.succiniciproducens JF4016，C.glutamicum R，M.succiniciproducens PALKG，M.succiniciproducens LPK7(pMS3-fdh2 meq)，E.coliAFP111，E.coliAS1600a，E.coliBE062，E.coliE2，E.coliHX024，E.coliJCL1208，E.coliJW1021，C.glutamicum BOL，C.glutamicum ELB-P，C.glutamicum NC-3-1，C.acetoacidophilum，S.elongatusPCC，Synechocystis sp.PCC 6803，P.kudriavzevii13171，P.kudriavzevii 13723，Y.lipolytica Y-3314，Y.lipolytica PGC010037942。
优选地，步骤S1中，所述接种产丁二酸纯菌株的量v/v为5％-15％，达到指数增长期的时间一般为6-36h。
作为技术方案的进一步改进，步骤S2中，所述处理包括如下步骤：
S2-1、将活性金属催化剂的前驱体在80～200℃条件下干燥去水，得到固体A；
S2-2、将助剂盐溶解到溶剂中，搅拌使其溶解均匀，得到助剂盐溶液B；
S2-3、将溶液B浸渍到固体A粉末上，搅拌，干燥使水分蒸发得到固体C；
S2-4、将固体C在还原气条件下被还原为碳化铁、氧化物或其混合物，压片至20-40目，在200～600℃条件下进行活化，得到固体D；
S2-5、将固体D进行研磨得到固体催化剂颗粒。
优选地，步骤S2-1中，所述活性金属催化剂的前驱体选自Fe2O3、Fe3O4、Co3O4、Al2O3、MoO3、SiO2的一种或几种。
优选地，步骤S2-2中，所述助剂盐包括下列物质中的一种或多种：柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、柠檬酸三锂、硝酸钠、硝酸钾、硝酸锂、硝酸铷、硝酸镁、硝酸铜、硝酸锌、硫酸锌、硫酸锆、硫酸镓、硫酸锰、乙酸锰、乙酸锌、高锰酸钾、高锰酸钠、硝酸锆、硝酸钌、氯化钌、硝酸铂、氯铂酸、硝酸钯、硝酸钨、硝酸镓、硝酸锰、硫酸钠、硫酸钾、硫酸锂、硫酸铷、硫酸镁、硫酸铜；优选地，所述催化剂的助剂盐包括以下一种或多种组成：柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、柠檬酸三锂、硝酸钠、硝酸钾、硝酸锂、硝酸铷、硝酸镁、硝酸铜、硝酸锌、硫酸锌、硫酸锆、硫酸镓、硫酸锰、乙酸锰、乙酸锌、高锰酸钾、高锰酸钠、硝酸锆、硝酸钌、氯化钌、硝酸铂、氯铂酸、硝酸钯。
优选地，步骤S2-2中，所述溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、己烷、环己烷、环己酮、乙醚、环氧丙烷、水、乙二醇中的一种或多种。
优选地，步骤S2-3中，所述干燥的温度为6-200℃，干燥时间为2-20h。
优选地，步骤S2-4中，所述还原气选自以下物质中的一种或多种：H2、CO、CO2、CH4、合成气(H2/CO)。
优选地，步骤S2-4中，所述还原气的气速为20-100mL/min。
优选地，步骤S2-4中，所述还原的时间为6-20h。
优选地，步骤S2-5中，所述研磨得到的固体催化剂颗粒大小为20-500目。
作为技术方案的进一步改进，步骤S3中，所述混合生物发酵培养基的配置方法，具体包括如下步骤：
S3-1、配制生物发酵培养基
配制的生物发酵培养基的配方为每升溶液中含有以下的物质：10g酵母提取物、3g磷酸氢二钾、0.2g氯化镁、0.2g氯化钙、1g氯化钠；
S3-2、将底物加入生物发酵培养基；
S3-3、将酸中和剂加入到发酵培养基，调控发酵过程中pH＝6.8-7.2；
S3-4、将固体催化剂颗粒加入生物发酵培养基中，得到混合生物发酵培养基。
优选地，步骤S3-2中，所述底物选自以下物质中的一种或多种：葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、山梨糖醇、乳糖、甘蔗糖蜜、油棕叶汁、菜籽秸秆、亚硫酸盐废液、生豆角荚、纤维素废料、浮萍、工业大麻、蔗糖渣、木薯蔗渣、油菜籽粉、鲜木薯根。
优选地，步骤S3-3中，所述酸中和剂选自下列物质中的一种或多种：碳酸钾，碳酸镁，碳酸钠，碳酸钙，碳酸氢钠，氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化镁，氢氧化钙，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠。优选地，发酵培养基的酸中和剂包括下列物质中的一种或多种：碳酸镁，碳酸钠，碳酸钙，碳酸氢钠，氢氧化钠，氢氧化镁。
优选地，步骤S3-3中，所述酸中和剂的浓度为5-100g/L。
优选地，步骤S3-4中，所述固体催化剂颗粒在生物发酵培养基中的浓度为2000-100000mg/L。
作为技术方案的进一步改进，步骤S4中，所述混合温度为30-45℃。
优选地，步骤S4中，在震荡速率为150±50rpm的摇床反应器中进行混合。
作为技术方案的进一步改进，步骤S5中，所述摇床反应器为全混合厌氧反应器或半混合浆态床反应器，摇床反应器的震荡速率为150±50rpm。
优选地，步骤S5中，所述丁二酸的生产温度为30-45℃，pH为6.0-7.5。
优选地，步骤S5中，所述生物发酵体系内混合生物发酵培养基体积:顶空体积＝2-5。
本发明步骤S5中，所述丁二酸的生产过程中可能发生以下反应：
C6H12O6+ATP→G6P+ADP
G6P+H2O+2NADP+→RL5P+CO2+2NADPH
RL5P→X5P
RL5P→R5P
X5P+R5P→S7P+GAP
S7P+GAP→E4P+F6P
X5P+E4P→F6P+GAP
ATP→ADP+Pi
G6P→F6P
F6P+ATP→FBP+ADP
FBP→2GAP
GAP+ADP+NAD+→PEP+ATP+NADH+H2O
PEP+CO2+ADP→OAA+ATP
OAA+NADH→MAL+NAD+
MAL→FUM+H2O
FUM+NADH→Succinate+NAD+
PEP+ADP→PYR+ATP
PYR+CoA+NAD+→ACA+CO2+NADH
ACA+Pi→+CoA+Ac-P
Ac-P+ADP→Acetate+ATP
PYR+NADH→Lactate+NAD+
PYR+CoA→Formate+ACA
ACA+2NADH→Ethanol+CoA+2NAD+
上述式中，简称和正式名称对应如下：
G6P：葡萄糖-6-磷酸；
ATP:腺嘌呤核苷三磷酸；
ADP:二磷酸腺苷；
NADP+:烟酰胺腺嘌呤二核酸磷酸；
NADPH:还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
RL5P：5-磷酸核酮糖；
X5P:5-磷酸木酮糖；
R5P:5-磷酸核糖；
S7P:七磷酸庚酯；
E4P:4-磷酸赤藓糖；
F6P:果糖-6磷酸；
FBP:果糖；
GAP：甘油醛-3-磷酸；
PEP:磷酸烯醇式丙酮酸；
OAA:草酰乙酸；
MAL：苹果酸；
FUM：富马酸；
Succinate：丁二酸盐；
PYR：丙酮酸；
CoA：辅酶A；
ACA:乙酰辅酶A；
Ac-P：磷酸乙酰基酯；
Acetate：乙酸；
Lactate：乳酸；
Formate：甲酸；
Ethanol：乙醇。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
1)目前，通过化学催化生产丁二酸的技术一般需要高温高压条件，同时原材料不可再生且价格昂贵，生产过程易排放CO2，造成环境问题。本发明的生物发酵体系反应条件温和、设备结构简单、可以有效利用转化温室气体CO2，生产高附加值化学品丁二酸，且能够高效稳定运行
2)对比目前的生物发酵生产丁二酸技术，丁二酸产量低且选择性差成为生物发酵工业生产丁二酸的主要限速步骤。本发明设计的在混合生物发酵体系中，控制优化条件在指定范围，使得CO2定向生物转化为高产量高选择性的丁二酸。
3)本发明中催化剂作为生物发酵优化条件，可以强化纯菌株利用葡萄糖代谢生产丁二酸的途径。催化剂能够促进对葡萄糖的转化，加速其转化为草酰乙酸或富马酸等中间体的速度，同时提高纯菌株对CO2的利用速率。除此之外，纯菌能够吸附在催化剂表面，提高了纯菌繁殖密度并为纯菌提供附着点，提高特定生物发酵系统的稳定性。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
一种CO2生物转化定向生产丁二酸的方法，具体步骤如下：
1)移取纯菌株A.succinogenes 130Z溶液5mL接入在121℃，20min高压蒸汽灭菌后的生长培养基100mL中培养。所述生长培养基的配方为：0.75g磷酸二氢钾，0.75g磷酸氢二钾，0.45g 2-乙烷磺酸，5g酵母提取物，2.5g玉米浆，0.006g亚硒酸钠，1.008g氯化钠，0.008g钨酸钠，0.5g氢氧化钠，1.5g四水合氯化亚铁，0.19g六水合氯化钴，0.1g四水合氯化锰，0.07g氯化锌、0.006g硼酸、0.036g钼酸钠，0.024g六水合氯化镍，0.002g二水合氯化铜，0.5g六水合氯化镁，0.3氯化铵，0.3g氯化钾，0.015g二水合氯化钙，10mg刃天青(氧气指示剂)，0.015g硫化钠，0.024g L(+)-半胱氨酸和0.077g DL-二硫苏糖醇；
2)控制纯菌株生长培养基的pH为6.8，培养温度为37℃，培养12h达到A.succinogenes 130Z的指数增长期，得到指数增长期的产丁二酸纯菌；
3)称取助剂氯铂酸，溶解于乙二醇中，搅拌使其溶解均匀；
4)称取金属Fe2O3粉末，将步骤1)中得到的溶液滴入Fe2O3中，边滴边搅拌，使其充分混合；
5)待步骤4)中所制得的物料成泥膏状，用保鲜膜封口，在玻璃干燥器中抽真空1h；
6)将步骤5)中所制得的物料转移至干燥箱，在150℃空气氛围下干燥12h；
7)将步骤6)中干燥后的催化剂经压片、研磨、筛分后，在400℃下，利用H2/CO体积比为1:1的合成气还原12h，即可得到1％Pt/Fe2O3无机固体催化剂；
8)在121℃，20min高压蒸汽灭菌后的生物发酵培养基中加入40000mg/L碳酸镁作为pH中和剂，60000mg/L葡萄糖作底物，通入足量的CO2，并接入5％的指数生长期的产丁二酸A.succinogenes 130Z纯菌株；所述生物发酵培养基的配方为每升溶液中含有以下的物质：10g酵母提取物、3g磷酸氢二钾、0.2g氯化镁、0.2g氯化钙、1g氯化钠；pH＝6.8-7.2；
9)将步骤7)中所制得的1％Pt/Fe2O3无机固体催化剂研磨至40目后，添加到步骤8)中所制得发酵培养基中，形成混合发酵培养体系；
10)混合生物发酵培养体系在摇床反应器中反应，将CO2生物转化生产丁二酸。
本实施例中，步骤3)、4)使用的氯铂酸与Fe2O3的质量比为0.03:1；
步骤7)中，所述还原反应后得到的无机固体催化剂中包含Fe2O3、Fe3C、Fe5C2、Fe2C和Pt助剂；
步骤9)中，1％Pt/Fe2O3无机固体催化剂在反应器中的浓度为10000mg/L；
步骤10)中，培养条件为温度37℃，初始pH 7.2；
步骤10)中，摇床反应器震荡速率为150rpm。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表1所示：
表1：反应器中液态物质分析结果
时间h
葡萄糖mg/L
丁二酸mg/L
乳酸mg/L
甲酸mg/L
乙酸mg/L
0
59961.61
0.00
0.00
0.00
0.00
4
52378.32
4866.56
372.88
58.15
441.78
6
47698.52
9891.5
958.22
138.91
778.41
12
26802.9
15450.18
1447.42
250.91
917.92
18
19675.05
23188.42
1888.15
340.65
1110.57
24
11772.14
32250.43
2621.89
407.54
1412.91
36
6101.85
41269.32
3033.50
430
1830.47
48
0.00
53871.89
3405.93
447.6
2301.9
本实施例中，在混合生物发酵体系中添加的催化剂为1％Pt/Fe2O3，反应在48h内将59961.61mg/L葡萄糖消耗完全，反应速率较快。在发酵过程中，主要产物是丁二酸，其他副产物均为一元酸，包括乳酸，甲酸和乳酸。从表中结果可看出丁二酸最终产量高达53871.89mg/L，占产物的总碳比例为90.13％，相比现有的生物发酵的体系(丁二酸的选择性：45～60％)，此混合生物发酵体系可以定向生产高产量的主产物丁二酸，其生产速率更快，选择性也更高。
实施例2
一种CO2生物转化定向生产丁二酸的方法，具体步骤如下：
1)移取纯菌株A.succinogenes 130Z溶液5mL接入在121℃，20min高压蒸汽灭菌后的生长培养基100mL中培养。所述生长培养基的配方为：0.75g磷酸二氢钾，0.75g磷酸氢二钾，0.45g 2-乙烷磺酸，5g酵母提取物，2.5g玉米浆，0.006g亚硒酸钠，1.008g氯化钠，0.008g钨酸钠，0.5g氢氧化钠，1.5g四水合氯化亚铁，0.19g六水合氯化钴，0.1g四水合氯化锰，0.07g氯化锌、0.006g硼酸、0.036g钼酸钠，0.024g六水合氯化镍，0.002g二水合氯化铜，0.5g六水合氯化镁，0.3氯化铵，0.3g氯化钾，0.015g二水合氯化钙，10mg刃天青(氧气指示剂)，0.015g硫化钠，0.024g L(+)-半胱氨酸和0.077g DL-二硫苏糖醇；
2)控制纯菌株生长培养基的pH为6.8，培养温度为37℃，培养12h达到A.succinogenes 130Z的指数增长期，得到指数增长期的产丁二酸纯菌；
3)称取助剂氯铂酸，溶解于乙二醇中，搅拌使其溶解均匀；
4)称取金属Fe2O3粉末，将步骤1)中得到的溶液滴入Fe2O3中，边滴边搅拌，使其充分混合；
5)待步骤4)中所制得的物料成泥膏状，用保鲜膜封口，在玻璃干燥器中抽真空1h；
6)将步骤5)中所制得的物料转移至干燥箱，在150℃空气氛围下干燥12h；
7)将步骤6)中干燥后的催化剂经压片、研磨、筛分后，在400℃下，利用H2/CO体积比为1:1的合成气还原12h，即可得到1％Pt/Fe2O3无机固体催化剂；
8)在121℃，20min高压蒸汽灭菌后的生物发酵培养基中加入40000mg/L碳酸钠作为pH中和剂，60000mg/L葡萄糖作底物，通入足量的CO2，并接入5％的指数生长期的产丁二酸A.succinogenes 130Z纯菌株；所述生物发酵培养基的配方为每升溶液中含有以下的物质：10g酵母提取物、3g磷酸氢二钾、0.2g氯化镁、0.2g氯化钙、1g氯化钠；pH＝6.8-7.2；
9)将步骤7)中所制得的1％Pt/Fe2O3无机固体催化剂研磨至40目后，添加到步骤8)中所制得发酵培养基中，形成混合发酵培养体系；
10)混合生物发酵培养体系在摇床反应器中反应，将CO2生物转化生产丁二酸。
本实施例中，步骤3)、4)使用的氯铂酸与Fe2O3的质量比为0.03:1；
步骤7)中，所述还原反应后得到的无机固体催化剂中包含Fe2O3、Fe3C、Fe5C2、Fe2C和Pt助剂；
步骤9)中，1％Pt/Fe2O3无机固体催化剂在反应器中的浓度为10000mg/L；
步骤10)中，培养条件为温度37℃，初始pH 7.2；
步骤10)中，摇床反应器震荡速率为150rpm。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表2所示：
表2：反应器中液态物质分析结果
本实施例中，在混合生物发酵体系中添加的酸中和剂为碳酸钠，反应在60h内将59761.45mg/L葡萄糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为46871.89mg/L，在总产物中的选择性为73.65％。
实施例3
重复实施实施例2，区别在于，步骤6)中，混合生物发酵体系中的酸中和剂为碳酸钙。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表3所示：
表3：反应器中液态物质分析结果
时间h
葡萄糖mg/L
丁二酸mg/L
乳酸mg/L
甲酸mg/L
乙酸mg/L
0
59982.09
0.00
0.00
0.00
0.00
4
52855.52
1521.68
234.65
358.15
481.81
6
482541.34
13478.27
271.73
1216.12
1487.28
12
343885.07
22902.49
865.19
2651.67
5290.05
18
264550.41
23453.86
4598.52
3705.1
6040.21
24
188753.7
35024.81
4821.61
4236.74
6028.78
36
9983.71
38323.20
5692.77
5200.2
6720.54
48
10547.9
39776.54
7254.56
6313.41
7631.26
60
6547.8
40578.43
8902.56
7954.8
8457.9
72
0.00
42861.49
9595.93
8547.6
9851.9
本实施例中，在混合生物发酵体系中添加的酸中和剂为碳酸钙，反应在72h内将59982.09mg/L葡萄糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为42861.49mg/L，在总产物中的选择性为63.53％。
实施例4
重复实施实施例1，区别在于，步骤6)中，向混合生物发酵体系中添加的酸中和剂碳酸镁的浓度为10000mg/L。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表4所示：
表4：反应器中液态物质分析结果
时间h
葡萄糖mg/L
丁二酸mg/L
乳酸mg/L
甲酸mg/L
乙酸mg/L
0
59695.4
0.00
0.00
0.00
0.00
4
50308.58
2215
543.42
158.15
433.51
6
42844.9
5441.78
1469.98
472.84
1011.82
12
39315.25
12597.77
2482.51
550.91
1545.5
18
28768.66
24682.93
3817.38
583.74
1790.84
24
15458.15
38780.42
5328.43
603.11
2958.28
36
8790.96
42065.54
6479
771.84
3924.75
48
199.63
44353.81
7095.25
865.88
4290.46
60
0.00
46971.89
8695.93
947.6
4351.9
本实施例中，在混合生物发酵体系中添加的酸中和剂碳酸镁浓度为10000mg/L，反应在60h内将59695.4mg/L葡萄糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为46971.89mg/L，在总产物中的选择性为77.76％。
实施例5
重复实施实施例1，区别在于，步骤6)中，向混合生物发酵体系中添加的酸中和剂碳酸镁的浓度为60000mg/L。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表5所示：
表5：反应器中液态物质分析结果
本实施例中，在混合生物发酵体系中添加的酸中和剂碳酸镁浓度为60000mg/L，反应在60h内将59955.4mg/L葡萄糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为49871.89mg/L，在总产物中的选择性为83.99％。
实施例6
重复实施实施例1，区别在于，步骤6)中，向混合生物发酵体系中加入的底物是果糖60000mg/L。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表6所示：
表6：反应器中液态物质分析结果
时间h
果糖mg/L
丁二酸mg/L
乳酸mg/L
甲酸mg/L
乙酸mg/L
0
60055.40
0.00
0.00
0.00
0.00
4
56354.58
2367
443.65
358.25
573.56
6
52284.95
5421.78
1165.25
702.24
807.89
12
49115.25
8575.82
1574.55
1057.54
912.55
18
42758.56
10689.72
2918.98
1359.77
1147.85
24
39488.17
15756.89
4358.63
1423.74
1588.28
36
34490.56
19455.94
6459.24
1721.84
2974.75
48
27999.83
24475.81
7055.25
2485.58
39020.46
60
22478.35
29851.89
8665.93
2957.6
4356.9
72
16475.2
31048.7
9145.7
3578.4
5871.4
84
12785.8
33578.9
10874.6
3874.5
6547.2
96
5524.5
36458.2
11478.2
4027.8
7984.3
108
0.00
38671.89
12695.93
4287.3
8351.9
本实施例中，在混合生物发酵体系中加入的底物是果糖，反应在108h内将60055.40mg/L果糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为38671.89mg/L，在总产物中的选择性为62.23％。
实施例7
重复实施实施例1，区别在于，步骤6)中，混合生物发酵体系中加入的底物是木糖60000mg/L。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表7所示：
表7：反应器中液态物质分析结果
时间h
木糖mg/L
丁二酸mg/L
乳酸mg/L
甲酸mg/L
乙酸mg/L
0
59994.7
0.00
0.00
0.00
0.00
4
55348.58
3255
443.22
0.00
538.51
6
49884.9
5478.78
1469.98
0.00
911.89
12
37314.15
9597.98
2582.51
0.00
1447.5
18
30758.46
12684.93
3811.88
0.00
2790.85
24
25454.25
18730.52
4588.43
0.00
3955.28
36
18790.96
25071.54
5769
0.00
5424.78
48
12579.62
31347.61
6415.25
0.00
3890.46
60
8742.3
36951.87
7895.43
0.00
7351.9
72
4286.1
40451.3
86712.3
0.00
80745.2
84
0.00
41691.89
8999.93
0.00
8964.9
本实施例中，在混合生物发酵体系中加入的底物是木糖，反应在84h内将59994.7mg/L木糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为41691.89mg/L，在总产物中的选择性为70.24％。
实施例8
重复实施实施例1，区别在于，步骤2)中，向混合生物发酵体系中加入的催化剂的金属为Al2O3粉末。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表8所示：
表8：反应器中液态物质分析结果
本实施例中，在混合生物发酵体系中加入的催化剂所使用的金属为Al2O3粉末，反应在48h内将59997.13mg/L葡萄糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为48671.89mg/L，在总产物中的选择性为76.21％。
实施例9
重复实施实施例1，区别在于，步骤1)中，向混合生物发酵体系中加入的催化剂的助剂为硝酸钯。
本实施例发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表9所示：
表9：反应器中液态物质分析结果
时间h
葡萄糖mg/L
丁二酸mg/L
乳酸mg/L
甲酸mg/L
乙酸mg/L
0
58997.9
0.00
0.00
0.00
0.00
4
50308.58
5215
443.42
258.18
233.51
6
42844.9
10441.28
969.58
402.44
811.84
12
39315.25
20547.72
1447.51
530.51
1045.7
18
28768.66
28622.95
2816.35
683.77
1490.74
24
15458.15
35740.45
3328.53
803.15
1658.58
36
8790.96
45075.54
4459
1171.87
2024.25
48
0.00
50691.89
5695.93
1287.3
2357.9
本实施例中，在混合生物发酵体系中加入的催化剂所使用的助剂为硝酸钯，反应在48h内将58997.9mg/L葡萄糖消耗完全。在发酵过程中，主产物丁二酸的产量为46971.89mg/L，在总产物中的选择性为85.30％。
对比例1
重复实施实施例1，区别在于，步骤6)中，在生物发酵体系中不添加酸中和剂。
本对比例生物发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表10所示：
表10：反应器中液态物质分析结果
时间h
葡萄糖mg/L
丁二酸mg/L
乳酸mg/L
甲酸mg/L
乙酸mg/L
0
59982.09
0.00
0.00
0.00
0.00
6
51468.24
37.65
325.99
858.15
410.16
12
43854.52
3222.61
1628.2
1844.13
1984.21
18
38291.34
13824.06
10385.69
2977.31
2068.18
24
26786.07
15114.53
12262.28
4119.62
3674.99
36
16530.41
14899.97
13121.46
5077.05
4719.78
48
12325.56
16219.71
14933.69
6199.46
6384.28
60
8703.4
23896.88
16473.27
7033.18
7281.97
72
0.00
29671.89
18355.93
8647
8351.9
本对比例中，未添加酸中和剂，耗时72h将59982.09mg/L的葡萄糖消耗完毕。与实施例1、4、5相比，最终主产物丁二酸浓度不高(29671.89mg/L)，同时在总产物中的选择性较低：48.26％。
对比例2
重复实施实施例1，区别在于，步骤7)中，向生物发酵体系中不添加制备的固体催化剂。
本对比例生物发酵体系将CO2生物转化为丁二酸的液态物质分析结果如下表1所示：
表11：反应器中液态物质分析结果
本对比例中，在生物发酵体系中未添加固体催化剂，耗时116h将59997.43mg/L的葡萄糖消耗完毕。与实施例8、9相比，最终主产物丁二酸浓度大幅降低(34671.89mg/L)其在总产物中的选择性(58.85％)也低于60％。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
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