阅读说明：本技术 一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产琥珀酸的新方法和应用 (Novel method for producing succinic acid by fermenting straws with Verbena pyricularis and application ) 是由 魏亚琴 王治业 牛永艳 秦鹏 张静荣 于 2019-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术可再生能源领域,具体涉及一株梨囊鞭菌发酵秸秆生产琥珀酸的新方法和应用。本发明公开了一种梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产琥珀酸的方法,所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为：CGMCC NO.18141。本发明所公开的梨囊鞭菌Piromyces CY1可以通过保藏在体外传代存活,发酵秸秆可产生高浓度的琥珀酸,且发酵工艺简单,对设备要求低,便于推广,在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。(The invention relates to the field of biotechnology renewable energy, and particularly relates to a novel method for producing succinic acid by fermenting straws with a strain of Verbena pyricularis and application thereof. The invention discloses a method for producing succinic acid by anaerobic fermentation of straws by using Verbena pyricularis (Piromyces CY 1), wherein the Verbena pyricularis (Piromyces CY 1) is preserved in China general microbiological culture preservation management center, and the preservation numbers are as follows: CGMCC NO. 18141. The invention discloses a penis et testis Pyri Piromyces CY1 which can survive through in vitro passage, the fermented straw can produce high-concentration succinic acid, the fermentation process is simple, the requirement on equipment is low, the popularization is convenient, and the invention has important industrial application value and development prospect in the industrial field.)

一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产琥珀酸的新方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种厌氧发酵秸秆生产琥珀酸的新方法和应用。

背景技术

燕麦是我国的主要粮食作物之一，播种面积广泛，每年伴随产生的秸秆数量也是非常巨大的。目前我国农村的大量水稻秸秆资源完全处于高消耗、高污染、低利用率、低产出状况，燕麦秸秆作为能源物质没有得到合理开发利用。通过厌氧消化处理可将燕麦秸秆进行资源再生，但现有的厌氧消化技术存在技术效率低，推广难度大的问题。

木质纤维素是秸秆的主要成分，木质纤维素的水解是整个厌氧消化中的限速步骤，也是整个技术的难点。木质纤维素素生物质主要由纤维素、半纤维和木质素组成，木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，这些强的化学键抑制水解酶的作用。因此，需要对木质纤维素进行预处理。常见的预处理木质纤维素方法有机械法、热处理法、化学处理，这些都能有效促进厌氧消化，但这些预处理方法成本高，不环保。普通微生物处理也存在较多缺陷，单一微生物处理效果不好，人工构件的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致预处理时间长，转化效率低，目前尚未有完备的方案进行燕麦秸秆的厌氧发酵来生产琥珀酸。

采用厌氧真菌处理燕麦秸秆，是一个较新也较为有效的手段，发明人博士期间研究了牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌的共培养物以及厌氧真菌纯培养物以玉米秸秆、水稻秸秆和小麦秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估厌氧真菌和甲烷菌共培养物以及厌氧真菌纯培养物的降解秸秆的功效，研究结果显示：高效降解三大秸秆的P属厌氧真菌纯培养物Piromyces Yak18 以小麦秸秆为底物进行厌氧发酵，7天培养期内琥珀酸的最高产量为0.09mM，以玉米秸秆为底物进行厌氧发酵，7天培养期内琥珀酸的最高产量为0.11mM，以水稻秸秆为底物，7天培养期内琥珀酸的最高产量为0.04mM；而高效降解三大秸秆的N属厌氧真菌纯培养物(N.frontalis)Yak16也分别以三大秸秆为底物， 7天培养内，以玉米秸秆为底物进行发酵所产琥珀酸的产量达到最高产量仅为0.21mM，高于以小麦秸秆和水稻秸秆为底物所产的琥珀酸。本发明从犏牛瘤胃中分离出来的厌氧真菌Piromyces CY1，以燕麦秸秆为底物进行发酵生产琥珀酸，最高产量达到了4.9mM，取得了意想不到的效果。

发明内容

本发明中厌氧发酵使用的菌种，是从青藏高原的甘肃省天祝县安远镇南泥湾村乌鞘岭牧场的全放牧犏牛瘤胃内容物中分离的梨囊鞭菌纯培养物Piromyces CY1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.18141，保藏日期为2019年7月9日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类名为：Piromyces CY1。

本发明具体公开了梨囊鞭菌Piromyces CY1发酵秸秆产琥珀酸的方法，具体包括如下步骤：

(1)Piromyces CY1纯培养物菌剂的制备

将Piromyces CY1纯培养物菌液以10％v/v接种量接种到液体基本培养基中，加入1％w/v干燥粉碎的秸秆作为底物，同时加入复合抗生素传代培养，置 39℃厌氧培养72h即得到高活力菌剂。

(2)发酵生产琥珀酸

吸取步骤(1)制备的菌剂，按10％v/v接种量接入以1％w/v秸秆为底物的与步骤(1)相同的液体基本培养基中，同时加入复合抗生素，39℃厌氧培养7天。

优选的，所述的液体基本培养基配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO₃ 7.0g，1.0g/L刃天青1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g， 4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。

优选的，盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄ 3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，MgSO₄·2H₂O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。

优选的，盐溶液II包括4g K₂HPO₄，蒸馏水定容至1000mL。

优选的，所述的步骤(1)中加入的秸秆为小麦秸秆。

优选的，所述的步骤(2)中加入的秸秆为燕麦秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆的任一种。

优选的，所述步骤(2)中加入底物后除氧，然后高温高压灭菌。

优选的，所述的复合抗生素为青霉素，硫酸链霉素和氯霉素，在发酵过程中添加复合抗生素，可防止共培养物体系不受细菌和甲烷菌污染，提高厌氧发酵效率。

优选的，所述的复合抗生素中青霉素和硫酸链霉素在厌氧培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL，氯霉素在培养基终浓度为50μg/mL。

本发明的有益效果是：①本发明所公开的梨囊鞭菌Piromyces CY1发酵秸秆产琥珀酸的产量显著提高，尤其是以燕麦秸秆为底物进行厌氧发酵，所产生的琥珀酸的浓度为4.9mM；②本发明中采用的梨囊鞭菌可以通过保藏在体外传代存活，发酵燕麦秸秆可产生高浓度琥珀酸，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景；③通过天祝放牧犏牛瘤胃梨囊鞭菌厌氧发酵燕麦秸秆可产生高浓度琥珀酸，可进一步提高燕麦秸秆的使用率，显著提高经济效益。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明所请求保护的技术方案进行说明，但本发明所请求保护的范围并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的厌氧培养基如下：

液体基本培养基的配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO₃ 7.0g，1.0g/L 刃天青1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心 20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至 1000mL。

盐溶液I包括NaCl 6g，(NH₄)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄ 3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g， MgSO₄·2H₂O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。

盐溶液II包括4g K₂HPO₄，蒸馏水定容至1000mL。

分离纯化培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆，然后除氧后灭菌。

琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡萄糖和20g/L琼脂，然后除氧后灭菌。

秸秆培养基：在液体基本培养基中分别添加1％w/v的粉碎风干的燕麦秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆，不加葡萄糖，然后除氧后灭菌。

传代培养基：在液体基本培养基中添加1％w/v的粉碎风干的小麦秸秆，然后除氧后灭菌。

除氧方法：将液体基本培养基分装到亨氏厌氧管或厌氧瓶中，厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO₂的抽气装置进行培养基除氧。首先真空泵抽出管中气体达到负压时培养基颜色改变，然后充入高纯CO₂。每管抽气充气3次，其中第1次约15min，其余2次每次5min，最后1次充气后用无菌株针再放气使得厌氧管内外压平衡，然后于121℃高温高压湿热灭菌20min后备用。

实施例一、梨囊鞭菌Piromyces CY1菌剂的制备

吸取1mL梨囊鞭菌Piromyces CY1培养物接种到20mL体积的亨氏厌氧管中的以风干粉碎的小麦秸秆为底物的9mL厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，使青霉素钠和硫酸链霉素在厌氧培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000 IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL。39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。

实施例二、梨囊鞭菌Piromyces CY1发酵燕麦秸秆生产琥珀酸的方法

1.发酵秸秆生产琥珀酸的方法

在100mL体积厌氧发酵瓶中盛90mL液体基本培养基，分别以1.0g粉碎风干后的燕麦秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆为底物，然后除氧后再灭菌。把传代培养72h的梨囊鞭菌Piromyces CY1用无菌注射器吸取10mL分别接种到上述加有燕麦秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，使其在厌氧培养基溶液的终浓度为青霉素1600IU/mL和硫酸链霉素2000IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL，39℃厌氧培养7天。共设3个平行实验，隔24h测定发酵液中琥珀酸的产量。

2.琥珀酸的测定方法

(1)标准溶液：琥珀酸标准品分别用水配成1mg/mL的标准储备液，然后稀释、配制成不同浓度的标准溶液。

(2)样品处理：取样品溶液适量置于玻璃瓶中，然后进行仪器测定。

(3)仪器参数：

超高压液相色谱条件：色谱柱(Waters Acquity TM BEH C18柱(100×2.1mm， 1.7μm)；流动相A为水，B为乙腈，0→3min，5％→10％(B)；3→5min，10％→50％ (B)；5→7min，50％→99％(B)；柱温40℃；流速0.4mL/min；进样量5.0μL。质谱条件：电喷雾离子化负离子检测方式；气帘气(CUR)20mL/min；碰撞气(CAD) 10mL/min；离子喷射电压(IS)4500v；雾化气温度(TEM)550℃；GAS1 50mL/min； GAS2 50L/min。其他条件如下：

实验结果显示，梨囊鞭菌Piromyces CY1高效降解燕麦秸秆的同时产生高浓度琥珀酸，显著高于以前文献报道的梨囊鞭菌降解各种秸秆所产琥珀酸的产量的几十倍，也显著高于梨囊鞭菌Piromyces CY1降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆所产生的琥珀酸，具体结果如下表：

表7天培养期间梨囊鞭菌Piromyces CY1降解四类秸秆所产琥珀酸产量

梨囊鞭菌纯培养物Piromyces CY1培养物在7天内降解燕麦秸秆产生的琥珀酸产量达到最高浓度为:4.9mM。

通过以上实施例我们可以看到：犏牛瘤胃梨囊鞭菌Piromyces CY1降解燕麦秸秆的同时产生高浓度的琥珀酸，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。