提高微生物生产有机酸效率的外源添加物及其应用
阅读说明：本技术 提高微生物生产有机酸效率的外源添加物及其应用 (Exogenous additive for improving efficiency of producing organic acid by microorganisms and application thereof ) 是由 佟毅 徐晴 章佳慧 吴娜 欧文 李义 彭超 陶进 于 2021-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高微生物生产有机酸效率的外源添加物及其应用,该微生物为根霉菌,在根霉菌发酵生产有机酸过程中,取多肽类物质加至根霉菌发酵培养基,用于提高根霉菌发酵生产有机酸的效率。多肽类物质改变根霉菌发酵培养基的碳氮源组成和比例,本发明通过外源添加缩短发酵周期,显著提高有机酸生产效率。(The invention discloses an exogenous additive for improving the efficiency of producing organic acid by microorganisms and application thereof. The polypeptide substance changes the composition and proportion of carbon and nitrogen sources of the rhizopus fermentation medium, and the invention shortens the fermentation period by exogenous addition and obviously improves the production efficiency of organic acid.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种提高微生物生产效率的外源添加物及其应用，具体地说是一种提高微生物生产有机酸效率的外源添加物及其应用。
背景技术
有机酸是指广泛存在于生物中的含有羧基的酸性有机化合物(除氨基酸)，包括苹果酸、富马酸和乳酸等。这些有机酸多参与动植物代谢的生命过程，能够作为代谢的中间产物，或者具有显著的生物活性，是有机合成和医药产品开发的重要原料，在食品、药品及化工等领域有着广泛用途，具有很大的市场应用价值。
目前，传统生产有机酸的方法仍是化学合成法，其原料来源为石油基化合物，不仅资源紧张，且生产过程会带来一定的环境问题。由于大多数有机酸是微生物代谢途径中的中间产物，利用微生物以可再生生物质资源为原料发酵生产有机酸的工艺极具发展前途。根霉菌因其发酵过程所需的营养源简单，可显著降低生产成本，被视为生产有机酸的理想微生物。
但利用根霉菌发酵生产有机酸还存在发酵周期较长，生产效率低的问题，现有的解决这一问题的方法主要是借助基因编辑内源改造根霉菌，受有机酸在食品行业应用的限制，通过分子生物学等基因编辑手段内源改造根霉菌解决有机酸生产效率的方法并不理想。
在部分微生物发酵过程中，加入外源添加物可有效提高生产效率，该方法不通过基因编辑，且成本低廉，但目前还未有报道通过该方法来提高根霉菌生产有机酸的效率。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种提高微生物生产有机酸效率的外源添加物，通过分析、筛选确定提高根霉菌生产有机酸效率的多肽类物质。
本发明的另一个目的，是提供上述提高微生物生产有机酸效率的外源添加物的应用，在根霉菌发酵生产有机酸过程中，添加特定浓度多肽类物质来改变根霉菌发酵培养基营养成分组成，通过调控代谢网络进而提高有机酸生产效率。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种提高微生物生产有机酸效率的外源添加物，该微生物为根霉菌，该外源添加物为多肽类物质。
作为一种限定，所述根霉菌为米根霉或少根根霉，均为根霉属真菌。
作为另一种限定，所述有机酸为苹果酸或富马酸。
其中，所述有机酸还包括乳酸等能经根霉菌发酵生产的有机酸。
作为第三种限定，所述多肽类物质为弹性蛋白肽、蚕丝蛋白肽或胶原三肽。
本发明还提供了上述提高微生物生产有机酸效率的外源添加物的一种应用，它是在根霉菌发酵生产有机酸过程中，用于添加至根霉菌发酵培养基。
在根霉菌发酵生产有机酸过程中，根霉菌经种子培养后，再接种至根霉菌发酵培养基发酵生产有机酸；种子培养基培养的条件为30-35℃下培养24h，搅拌速率为200rpm。
本发明的种子培养基和发酵培养基应理解为现有技术中灭菌并冷却的根霉菌适宜的生长或发酵的培养基，培养基均含该种根霉菌生长或发酵所必需的营养物质，包括碳源、氮源、无机盐及水分。
作为一种限定，外源添加物和根霉菌发酵培养基的质量体积比为1-5g:1L。
作为另一种限定，所述根霉菌发酵培养基为液体培养基。液体培养基可直接作为发酵液进行发酵生产。
作为再一种限定，所述根霉菌发酵的条件是：温度为30-35℃，时间为36-72h，搅拌速率为180-220rpm。
发酵的条件在生产中可结合本领域公知常识，具体根霉属真菌的特性进行调整，例如在最适温度下发酵，以达到更佳的效果。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明采用非基因工程方法，通过外源添加一定浓度的多肽类物质，改变了根霉菌发酵培养基中碳氮源的组成和比例，显著增强糖酵解途径，一定程度上缩短目标产物发酵周期，提高了根霉菌发酵生产有机酸的效率；
该方法步骤简单，操作方便，仅需在根霉菌发酵培养基中添加低成本的多肽类物质，适于大范围绿色高效工业生产有机酸。
下面结合附图及具体实施例对本发明作详细说明。
附图说明
图1为实施例7中通过外源添加多肽类物质提高微生物生产有机酸效率的验证实验结果图；
图2为实施例7中通过外源添加多肽类物质提高微生物生产有机酸效率的验证实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明采用的菌种是工业生产中常用的具有典型代表菌种少根根霉NRRL 1526和米根霉ATCC 20344，可从商业途径购得。
实施例1一种通过外源添加弹性蛋白肽提高根霉菌生产L-苹果酸效率的方法
本实施例中的方法包括依次进行的以下步骤：
(1)培养基的配制：
种子培养基配制：混匀葡萄糖20kg、尿素2kg、KH2PO4 0.3kg、MgSO4·7H2O 0.5g、ZnSO4·7H2O 0.02kg、FeSO4·7H2O 0.01kg、CuSO4·5H2O 0.03kg和1000L水；
发酵培养基配制：混匀葡萄糖80kg、(NH4)2SO4 0.2kg、KH2PO4 0.6kg、ZnSO4·7H2O0.02kg、FeSO4·7H2O 0.01kg、MgSO4·7H2O 0.5kg、CaCO3 60kg和1000L水；
将上述培养基115℃灭菌30min，冷却，即得种子培养基和发酵培养基备用。
(2)种子培养：
将少根根霉NRRL 1526在固体培养基培养后，取无菌水刮洗，稀释至浓度为1×107个/mL，得少根根霉NRRL 1526孢子悬浮液。
向种子培养基中接种入少根根霉NRRL 1526孢子悬浮液1L，30℃、200rpm培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：向发酵培养基中添加3kg弹性蛋白肽并使其浓度为3g/L，得到改进的发酵培养基，标记为P1，接入种子液5L，发酵条件为温度35℃，搅拌速率200rpm，使培养基P1的残糖量至个位数时终止发酵，得到L-苹果酸发酵液。
实施例2-3通过外源添加多肽类物质提高根霉菌生产L-苹果酸效率的方法
实施例2-3分别为一种通过外源添加多肽类物质提高根霉菌生产L-苹果酸效率的方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数、多肽类物质种类及用量不同，具体详见表1：
表1实施例2-3参数一览表
实施例2-3其它部分的内容，与实施例1相同。
实施例4一种通过外源添加弹性蛋白肽提高根霉菌生产富马酸效率的方法
本实施例中的方法包括依次进行的以下步骤：
(1)培养基的配制：
种子培养基配制：混匀葡萄糖20kg、尿素1kg、KH2PO4 0.3kg、MgSO4·7H2O 0.25g、ZnSO4·7H2O 0.066kg、FeSO4·7H2O 0.01kg和1000L水；
发酵培养基配制：混匀葡萄糖80kg、(NH4)2SO4 0.2kg、KH2PO4 0.15kg、ZnSO4·7H2O0.05kg、FeSO4·7H2O 0.068kg、MgSO4·7H2O 0.1kg、CaCO3 60kg和1000L水；
将上述培养基115℃灭菌30min，冷却，即得种子培养基和发酵培养基备用。
(2)种子培养：
将米根霉ATCC 20344在固体培养基培养后，取无菌水刮洗，稀释至浓度为1×107个/mL，得米根霉ATCC 20344孢子悬浮液。
向种子培养基中接种入米根霉ATCC 20344孢子悬浮液1L，35℃、200rpm培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：向发酵培养基中添加4kg弹性蛋白肽并使其浓度为4g/L，得到改进的发酵培养基，标记为P1，接入种子液5L，发酵条件为温度35℃，搅拌速率200rpm，使培养基P1的残糖量至个位数时终止发酵，得到L-苹果酸发酵液。
实施例5-6通过外源添加多肽类物质提高根霉菌生产富马酸效率的方法
实施例5-6分别为一种通过外源添加多肽类物质提高根霉菌生产富马酸效率的方法，它们的步骤与实施例4基本相同，不同之处仅在于工艺参数、多肽类物质种类及用量不同，具体详见表2：
表2实施例5-6参数一览表
实施例5-6其它部分的内容，与实施例4相同。
实施例7通过外源添加多肽类物质提高微生物生产有机酸效率的验证实验
记录实施例1-6中发酵培养的时间(残糖量至个位数的时间)，检测发酵培养过程中葡萄糖含量变化，计算生产有机酸效率。
对照A组：该组为实施例1-3的对照组，采用与实施例1部分相同的方法发酵生产有机酸，区别仅在于发酵培养基中不添加多肽类物质。
对照B组：该组为实施例4-6的对照组，采用与实施例4部分相同的方法发酵生产有机酸，区别仅在于发酵培养基中不添加多肽类物质。
比较实施例1-6与对照组A、B有机酸产量及生产效率，来验证外源添加多肽类物质对根霉菌生产有机酸效率的提高作用。
其中，对照组A和实施例1-3的结果见图1和表3；对照组B和实施例4-6的结果见图2和表4。
表3有机酸产量及生产效率结果表
组别
对照组A
实施例1
实施例2
实施例3
多肽类物质
无
弹性蛋白肽
蚕丝蛋白肽
胶原三肽
L-苹果酸产量(g/L)
20.86
21.95
21.58
20.12
L-苹果酸生产效率(g/L/h)
0.29
0.61
0.60
0.48
如图1和表3所示，对照组A发酵时间72h，实施例1-3发酵时间分别是36h、36h及42h，发酵培养基外源添加多肽类物质后，发酵时间均显著缩短；L-苹果酸生产水平如表3所示，相较于对照组，发酵终点L-苹果酸产量无显著差异，但生产效率显著提高，其中，实施例1提高了110.34％，实施例2提高了106.90％，实施例3提高了65.52％。
表4有机酸产量及生产效率结果表
组别
对照组B
实施例4
实施例5
实施例6
多肽类物质
无
弹性蛋白肽
蚕丝蛋白肽
胶原三肽
富马酸产量(g/L)
25.62
26.75
27.13
24.68
富马酸生产效率(g/L/h)
0.36
0.64
0.75
0.51
如图2和表4所示，对照组B发酵时间72h，实施例4-6发酵时间分别是42h、36h及48h，发酵培养基外源添加多肽类物质后，发酵时间均显著缩短；富马酸生产水平如表3所示，相较于对照组，发酵终点富马酸产量无显著差异，但生产效率显著提高，其中，实施例4提高了77.78％，实施例5提高了108.33％，实施例6提高了41.67％。
结果表明，通过外源添加多肽类物质可显著提高微生物生产有机酸效率。
实施例8-12通过外源添加多肽类物质提高微生物生产有机酸效率的方法
实施例8-13分别为一种通过外源添加多肽类物质提高微生物生产有机酸效率的方法，实施例8-10的步骤与实施例1或4基本相同，实施例11-13的步骤与4基本相同，不同之处仅在于具体参数不同，具体详见表5：
表5实施例8-13参数一览表
对比例8’-13’：设计与实施例8-13的方法一一对应的对比例8’-13’，区别仅在于对比例8’-13’均不添加多肽类物质，其它参数及方法与各自的对照实施例相同，例如，对比例8’与实施例8的区别仅在于不添加蚕丝蛋白肽，其余参数及方法均相同。
记录各组发酵培养过程中产物变化，计算生产有机酸效率，结果如表6所示：
表6有机酸生产效率结果表
由表6结果可知，相较于对比例，实施例8-13有机酸生产效率高出40％以上，结果表明通过外源添加多肽类物质可显著提高微生物生产有机酸效率。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。
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