阅读说明：本技术 一种落叶松针叶高效离体再生方法 (High-efficiency in-vitro regeneration method for larch needles ) 是由 朱木兰 郑珂媛 王可佳 闫学彤 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种落叶松针叶高效离体再生方法,其以落叶松肥厚的针叶为起始材料,经培养产生大量的不定芽,能够在短时间内获得大量落叶松再生植株,植株表型一致性高,而且这种种苗的发生不受季节限制。可以以此再生系统作为转基因的受体系统进一步制备转基因植株,使之既能保持亲本的遗传表型,又具有所转入的外源目的基因的性状。通过建立以落叶松针叶为起始外植体的离体再生方法,对开展以落叶松为代表的针叶树遗传改良、新品种(系)培育和优质种苗繁殖等研究,对林业经济可持续发展和缩小林业基础研究领域与发达国家间的差距,具有深远意义。(The invention discloses a method for regenerating needle leaves of larch in vitro efficiently, which takes the needle leaves with the thick larch as a starting material, generates a large amount of adventitious buds through culture, can obtain a large amount of regeneration plants of the larch in a short time, has high plant phenotype consistency, and is not limited by seasons. The regeneration system can be used as a transgenic receptor system to further prepare transgenic plants, so that the transgenic plants can not only keep the genetic phenotype of parents, but also have the characters of the transferred exogenous target genes. By establishing the in vitro regeneration method taking the larch needles as the initial explant, the method has profound significance for developing researches on genetic improvement, new variety (line) cultivation, high-quality seedling propagation and the like of the needle trees represented by the larch, and for sustainable development of forestry economy and shortening the gap between the basic research field of forestry and developed countries.)

一种落叶松针叶高效离体再生方法

技术领域

本发明涉及一种植物再生和快速技术领域，具体涉及落叶松的离体再生。

背景技术

落叶松(Larix Mill)属松科(Pinaceae)落叶松属(Larix)，是一种落叶乔木。其分布广泛、成林快、适应性强且病虫害少，在林业生产中受到重视且应用很广泛。同时，落叶松木材具有纤维长，耐腐朽，抗压及抗弯曲等优点，所以，落叶松不仅可以作为优质的建筑用材，亦可作为高档打印纸的基础原料。落叶松本属18种，主要分布于北半球温带山区、寒温带的平原及高山气候区，我国有10种，主要分布于东北大、小兴安岭、华北、西北及西南高山带，常成大面积纯林或混交林。

然而，落叶松具有高度的杂合性，有性繁殖后代的变异较大，其育种周期长且见效慢，后代性状不能够进行定向改良。由于离体再生具有速度快、周期短、高效、稳定等特点，因此落叶松的遗传改良与无性系繁殖一直受到各国林业决策部门的重视与林木育种工作者以及森林经营者的特别关注(吴丽君.针叶树离体培养研究进展[J].福建农业学报,2006,21(4):415-419；吴克贤,李伟,徐妙珍,等.长白落叶松组织培养的研究[J].林业科学,1996,32(2):125-133；张素清.落叶松属树种组织培养的研究进展[J].辽宁林业科技，2015，1：56-58)。但对于落叶松的组织培养一直没有太大的突破，近些年有研究人员对此进行了探索，例如张莉以成熟合子胚为材料,对杂种落叶松和长白落叶松进行了离体再生及其内源激素含量变化研究(张莉.长白落叶松离体再生体系的建立[J/OL].山东林业科技,2019(02):17-22.；张莉.落叶松高效离体再生体系建立及内源激素变化研究[D].东北林业大学,2016)。郑武林比较研究了马尾松(Pinus massoniana Lamb.)成熟合子胚和下胚轴再生性能的基础上，以马尾松下胚轴为外植体，研究了影响马尾松下胚轴离体再生的多种因素，建立了马尾松下胚轴离体再生体系(郑武林.马尾松与落叶松高效离体再生体系建立[D].江西农业大学,2014.)；祝朋芳等以日本落叶松嫩茎为外植体进行离体培养,探讨了各因素对诱导腋芽分化的影响并进行了扩繁继代的研究，结果表明基本培养基以ZN及SH最适；细胞***素以KT最适,其次为2ip(祝朋芳,陈长青,张惠华,罗凤霞,孙晓梅.日本落叶松的离体培养和植株再生[J].辽宁农业科学,2002(01):21-23.)

目前的研究主要合子胚或下胚轴为外植体，其来源易于受限制，并且再生效果有待提高，实用性还不够强，尚不能推广应用。由此可知，目前仍然没有找到有效的再生体系，一直是需要克服的难题。因此有必要建立快速繁殖体系以达到缩短育种周期、定向改良性状的目的。

发明内容

为了尽快实现以落叶松针叶为起始外植体的高效离体再生体系的建立，本发明人对落叶松的离体再生进行了研究，建立了以针叶为外植体的高效离体再生方法。

本发明提供一种落叶松针叶高效离体再生方法，其是取带芽的茎段接种于附含有0.5-3mg/l BA，优选1-2mg/l BA的MS培养基上，培养获得肥厚的针叶，以此作为起始外植体。进一步地，所述带芽的茎段是取自幼嫩的落叶松枝条。

在优选方式中，带芽的茎段在培养基上培养12-30天，最优选14-28天。

外植体对某些植物尤其是木本植物的再生体系的建议至关重要，本发明人在研发落叶松的离体再生体系过程，尝试多种外植体的形式，例如以直接取落叶松上的针叶作为外植体，实验证明其活力不够，再生效果非常差，不能够建立有效的再生体系。经过摸索分析，最终采取增强针叶活力的办法，最终获得较好的再生效果。进一步地，本发明的采用不定芽的分化诱导和伸长阶段的基础培养基是在DCR培养基的基础上，添加了L-苯丙氨酸、色氨酸、L-丝氨酸三种氨基酸(在本发明中称为LYS培养基)。在优选的实施方式中，三种氨基酸的添加量分别为0.3-0.8mg/l、0.2-0.4mg/l、0.1-0.3mg/l，更优选的添加量为0.4-0.6mg/l、0.25-0.35mg/l、0.15-0.25mg/l，最优选的添加量为0.5mg/l、0.3mg/l、0.2mg/l。

进一步地，外植体的愈伤组织的诱导阶段培养基中添加的激素配方为0.5－3mg/lNAA，0.1－0.5mg/l BA，优选为0.15－2.5mg/l NAA，0.2－0.4mg/l BA。

更进一步地，对不定芽的分化诱导采用上述LYS培养基，并添加的激素配方为0.5－3mg/l NAA，0.1－0.5mg/l BA，0.001-0.01mg/l TDZ，优选为0.15－2.5mg/l NAA，0.2－0.4mg/l BA，0.004-0.006mg/l TDZ。对芽丛的获得采用上述LYS培养基，并添加的激素配方为0.5－3mg/l BA，0.1－0.5mg/l NAA，150-350mg/l香蕉汁，优选为0.15-2.5mg/lBA，0.3-0.4mg/l NAA，200-300mg/l香蕉汁。另外，生根培养阶段采用上述LYS培养基，添加激素配方为0.5－5mg/l IBA，优选为2－4mg/l IBA。

在诱导分化产生不定芽是再生中的关键环节，其分化条件包括培养基的选择和激素配方需要进行深入研究才能成功，这也是众多木本植物再生效果不好或不能成功的一个环节之一。本发明人通过大量的实验探索，通过添加各种氨基酸和不同组合，确定添加L-苯丙氨酸、色氨酸、L-丝氨酸三种氨基酸，配合激素配比，而不添加氨基酸的诱导分化得到的愈伤组织易碎不易于产生不定芽，添加上述氨基酸能够很好的解决这一问题，最终获得较好的诱导分化效果而言。

在优选的实施方式中，芽诱导分化步骤分阶段进行，首先将所述外植体接入含有0.5－3mg/l NAA，0.1－0.5mg/l BA，优选为0.15－2.5mg/l NAA，0.3－0.4mg/l BA的LYS培养基中，在针叶伤口部位诱导出愈伤组织；再次愈伤组织转入含有0.5－3mg/l NAA，0.1－0.5mg/l BA，0.001-0.01mg/l TDZ,优选为0.15－2.5mg/l NAA，0.3－0.4mg/l BA，0.004-0.006mg/l TDZ的LYS培养基上继续培养至诱导出形态清晰的不定芽；随后将不定芽转接入含有0.5－3mg/l BA，0.1－0.5mg/l NAA，150-350mg/l香蕉汁，优选为0.15－2.5mg/l BA，0.3－0.4mg/l NAA，200-300mg/l香蕉汁的LYS培养基上培养获得芽丛；继续在含有0.05－0.3mg/l BA，0.01－0.05mg/l NAA，150-350mg/l香蕉汁，优选为0.1－0.2mg/l BA，0.03－0.04mg/l NAA，200-300mg/l香蕉汁的LYS培养基上培养使芽伸长。其中，香蕉汁就是取香蕉肉榨出的汁液，可以按常规方法获取，简易的方法是将香蕉肉打碎，通过过滤纱布榨取出汁液备用。

在分化诱导和生根培养过程中，光照培养16h/d，培养温度为25±2℃，优选光照强度为50-70μmol.m-2.s-1，更优选60μmol.m-2.s-1。

更进一步地，在所述方法还包括将生根苗进行耐受培养后，进行移载，获得落叶松再生植株。在优选实施方式中，所述耐受培养是将生根苗连同培养基、培养瓶一起转入27-20±2℃、光照16h/d，光照强度70-90μmol.m-2.s-1的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入10-20ml无菌水或去离子水，炼苗5-8天。

所述移载是将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩，优选重量配比为2-4∶4-8∶0.5-2的基质中，最优选重量配比为3∶6∶1的基质中，于28±2℃、自然光照的大棚中生长。

在一个更

具体实施方式

中，本发明的一种落叶松针叶高效离体再生方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取材：温室大棚内的幼嫩落叶松枝条；

(2)消毒：取幼嫩的落叶松枝条用清洗干净，吸干材料表面水分，用酒精消毒，再用升汞消毒，切取为留1-1.5cm带芽的茎段备用；

(3)将步骤(2)中所得的茎段接种于含有0.5-3mg/l BA，优选为1.5mg/l BA的MS培养基上，培养2-4周后，获得肥厚的针叶，以此作为起始外植体；

(4)将步骤(3)所得的针叶接入含有0.5－3mg/l NAA，0.1－0.5mg/l BA，优选为2mg/l NAA，0.3mg/l BA的LYS中，培养2-4周后，针叶伤口部位诱导出愈伤组织，继续培养4-8周后，愈伤组织膨大，其中光照条件为60μmol.m-2.s-1，16h/d培养，培养温度为25±2℃；

(5)将步骤(4)获得的愈伤组织转入含有0.5－3mg/l NAA，0.1－0.5mg/l BA，0.001-0.01mg/l TDZ，优选为2mg/l NAA，0.3mg/l BA，0.005mg/l TDZ的LYS培养基上培养3-4周后，诱导出形态清晰的不定芽，其中光照培养条件为60μmol.m-2.s-1，16h/d，培养温度为25±2℃；

(6)将步骤(5)获得的不定芽转接入含有0.5－3mg/l BA，0.1－0.5mg/l NAA，150-300mg/l香蕉汁，优选为2mg/l BA，0.3mg/l NAA，250mg/l香蕉汁的LYS培养基上,培养2-3周后获得芽丛；

(7)将步骤(6)获得的芽丛转入含有0.05－0.3mg/l BA，0.01－0.05mg/l NAA，150-300mg/l香蕉汁，优选为0.2mg/l BA，0.03mg/l NAA，250mg/l香蕉汁的LYS培养基上培养2-3周后，使芽明显伸长，光照条件为60μmol.m-2.s-1，16h/d，培养温度为25±2℃；

(8)将步骤(7)获得的伸长芽切除形态学下端叶片后，转入含有0.5－5mg/l IBA，优选为3mg/l IBA的LYS培养基中培养2-4周后诱导生根，光照条件为60μmol.m-2.s-1，16h/d，培养温度为25±2℃；

(9)将步骤(8)获得的生根苗连同培养基、培养瓶一起转入28±2℃、光照条件为80μmol.m-2.s-1，16h/d的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入无菌水或去离子水，炼苗5-8天；

(10)将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在28±2℃、自然光照的大棚中生长，至成为与自然生长小苗一致的落叶松再生植株。

其中，所述落叶松培养基(LYS)的制备方法为：按照下表配制基本培养基，pH5.8，121℃灭菌15-25分钟。

本发明的离体再生方法适用于各个品种的落叶松，优选是长白落叶松、日本落叶松、日本长白杂交落叶松等。

本发明公开的落叶松针叶高效离体再生方法，一方面以落叶松肥厚的针叶为起始外植体材料，因而使得整个再生体系能够有效的基础。另一方面，在诱导分化方面，经过大量研究筛选，在培养基中添加特定的三种氨基酸解决愈伤组织易碎的问题，而且外植体诱导产生愈伤组织的比率很高，再配合合理的激素配方，使得上述外植体经培养能够产生大量的不定芽，在此基础上进一步采取分阶段的诱导分化和不定芽和伸长，使得分化和不定芽伸长更有效。通过本发明的方法，能够在短时间内生产大量的落叶松优质种苗，而且这种种苗的发生不受季节限制，可以常年生产。由此获得大量落叶松再生植株表型一致性高，可以以此再生系统作为转基因的受体系统进一步制备转基因植株，使之既能保持亲本的遗传表型，又具有所转入的外源目的基因的性状。通过建立以落叶松针叶为起始外植体的离体再生系统，对开展以落叶松为代表的针叶树遗传改良、新品种(系)培育和优质种苗繁殖等研究，对林业经济可持续发展和缩小林业基础研究领域与发达国家间的差距，具有深远意义。尤其是本发明落叶松高效的再生体系的建立具有首创性，更具有开创性的意义。

附图说明

图1针叶伤口愈伤组织。

图2膨大的愈伤组织。

图3不定芽。

图4丛芽。

图5伸长的从芽。

图6生根的再生小苗。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例

本实施例按下述步骤进行：

(1)LYS培养基的制备：按照表1配制基本培养基，pH5.8，121℃灭菌15-25分钟。不定芽的诱导、伸长和生根均使用该培养基。

表1本实施例采用的LYS培养基的组成成分一览表

(2)取材：温室大棚内的幼嫩长白落叶松枝条。

(3)消毒：取幼嫩的长白落叶松枝条用洗洁精清洗后，自来水冲干净，报纸吸干材料表面水分，在超净工作台上用回收酒精消毒40秒，再用70％酒精消毒30-90秒，0.1％升汞消毒5分钟，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干材料表面水分，切取为留1-1.5cm带芽的茎段备用。本实施例重复三次，每次试验采用外植体100个，以统计实验结果。

(4)将步骤(2)中所得的茎段接种于附含有1.5mg/l BA的MS培养基(MS culturemedium)上，培养2-4周后，获得肥厚的针叶，以此作为起始外植体。

(5)将步骤(3)所得的针叶接入附含有2mg/l NAA，0.3mg/l BA的LYS中，培养2-4周后，针叶伤口部位诱导出愈伤组织(图1)继续培养4-8周后，愈伤组织膨大(图2)。光照(60μmol.m-2.s-1)16h/d培养，培养温度为25±2℃。

(6)将步骤(4)获得的愈伤组织转入附含有2mg/l NAA，0.3mg/l BA,0.005mg/lTDZ的LYS培养基上培养3-4周后，诱导出形态清晰的不定芽(图3)。光照培养(60μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度为25±2℃。

(7)将步骤(5)获得的不定芽转接入附含有2mg/l BA，0.3mg/l NAA，250mg/l香蕉汁的LYS培养基上,培养2-3周后获得芽丛(图4)

(8)将步骤(6)获得的芽丛转入附含有0.15mg/l BA，0.03mg/l NAA，250mg/l香蕉汁的LYS培养基上培养2-3周后，可观察到芽明显伸长(图5)。光照培养(60μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度为25±2℃。

(9)将步骤(7)获得的伸长芽切除形态学下端叶片后，转入附含有3mg/l IBA的LYS培养基中培养2-4周后诱导出根(图6)。光照培养(60μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度为25±2℃。

(10)将步骤(8)获得的生根苗连同培养基、培养瓶等一起转入28±2℃、光照(80μmol.m-2.s-1)16h/d的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入10-20ml无菌水或去离子水，炼苗5-8天。

(11)将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在28±2℃、自然光照的大棚中生长良好，成为与自然生长小苗一致的落叶松再生植株。

研究结果表明，外植体经过诱导约95％能够产生愈伤组织，每个外植体产生的愈伤组织平均可分成约6个愈伤组织，平均每个愈伤组织产生有效芽约20个；不定芽的生根率平均约40％；移栽成活率达到100％。最终平均每片针叶外植体能产生再生植株约50株。其效果非常显著，具有实际推广应用价值。