具有抑制凝血酶活性的药物组合物及其用途
阅读说明：本技术 具有抑制凝血酶活性的药物组合物及其用途 (Pharmaceutical composition with thrombin activity inhibition function and application thereof ) 是由 高文远 王娟 姚陆 刘静静 许馨丹 贺军平 于 2019-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了具有抑制凝血酶活性的药物组合物及其用途,该药物组合物,包括如下组份：三七不定根粉末、西洋参提取物、黄芪提取物、川芎提取物、丹参提取物和当归提取物。本发明利用培养的三七不定根作为药物组合物主要组份,与其他组份配比的药物组合物具有抑制凝血酶活性,舒张血管和抗疲劳作用,能够应用在抑制凝血酶活性,舒张血管和抗疲劳的药物的制备中,为三七药物开发来源提供了一条新途径。(The invention discloses a pharmaceutical composition for inhibiting thrombin activity and application thereof, wherein the pharmaceutical composition comprises the following components: notoginseng radix adventitious root powder, radix Panacis Quinquefolii extract, radix astragali extract, rhizoma Ligustici Chuanxiong extract, Saviae Miltiorrhizae radix extract and radix Angelicae sinensis extract. The invention utilizes the cultured adventitious roots of the pseudo-ginseng as the main component of the pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition which is matched with other components has the functions of inhibiting thrombin activity, relaxing blood vessels and resisting fatigue, can be applied to the preparation of drugs for inhibiting thrombin activity, relaxing blood vessels and resisting fatigue, and provides a new way for developing pseudo-ginseng drugs.)
技术领域
本发明属生物医药领域，具体涉及一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物。
背景技术
三七别称山漆、滇三七、参三七、田七、金不换、南国神草等。三七药用历史悠久，三七皂苷和人参皂苷是其主要的活性成分，有抗肿瘤、抗氧化、促进血液循环、改善睡眠、增强免疫力、改善神经系统等功效。因皂苷活性的多样性，近年来，三七被广泛地应用于各类保健产品及药品中。市场需求逐年加大，市场前景越来越广阔。但受限于三七种植不能连作的特性，三七宜种土地枯竭，一定程度上限制了三七的进一步发展与应用。西洋参对中枢神经系统、心血管系统等具有保护作用。黄芪有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压等作用。川芎具有活血行气，祛风止痛等作用。丹参具有祛瘀、生新、活血、调经等效用。当归具有补血和血，调经止痛，润燥滑肠、抗癌、抗老防老、免疫之功效。
不定根由栽培根诱导而来，与栽培根有相同/相似的基因型，有效成分也接近。不定根的组织培养还具有其他优点：(1)生产周期短，短时间内可以获得大量组织及活性成分；(2)不受季节及地域限制，可以实现规模化生产；(3)一定程度上缓解大田种植不当对环境的破坏等。但目前，尚未有直接利用三七不定根并组成具有抑制凝血酶活性的药物组合物的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物。
本发明的第二个目的是提供一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物在制备抑制凝血酶活性药物中的用途。
本发明的第三个目的是提供一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物在制备促进血管舒张药物中的用途。
本发明的第四个目的是提供一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物在制备抗疲劳药物中的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物，包括如下组份：三七不定根粉末、西洋参提取物、黄芪提取物、川芎提取物、丹参提取物和当归提取物。
优选地，上述组份按重量计，三七不定根粉末为12-18份、西洋参提取物为3-5份、黄芪提取物为4-6份、川芎提取物为2-5份、丹参提取物为3-6份和当归提取物为2-4份。
最好是，三七不定根粉末为15份、西洋参提取物为4份、黄芪提取物为5份、川芎提取物为3份、丹参提取物为4份、当归提取物为3份。
上述药物组合物，所述三七不定根粉末是用下述方法制成：
(1)三七不定根的诱导；
(2)三七不定根的驯化培养及筛选：将步骤(1)获得的三七不定根转接到驯化培养基上进行驯化继代，根据根系分枝多少筛选根系，并进行活性成分含量测定，筛选出根系分枝在3-5个以上，且三七皂苷和人参皂苷总含量高于15mg/g干重的稳定根系在120-150rpm，23-27℃下培养6-7周；
所述驯化培养基为11g/L SH+30g/L蔗糖+1mg/L NAA+3mg/L IBA，余量为水；
(3)三七不定根的反应器培养：将步骤(2)筛选后的三七不定根接种于含有驯化培养基的气升式反应器中，通气量为0.1vvm，室温培养8-10周；
(4)三七不定根的粉末制备：将步骤(3)获得的三七不定根50-60℃烘干粉碎后，过100-200目筛，即得三七不定根粉末。
上述药物组合物在制备抑制凝血酶活性药物中的用途。
上述药物组合物在制备促进血管舒张药物中的用途。
上述药物组合物在制备抗疲劳药物中的用途。
本发明的优点
本发明利用培养的三七不定根作为药物组合物主要组份，与其他组份配比的药物组合物具有抑制凝血酶活性，舒张血管和抗疲劳作用，能够应用在抑制凝血酶活性，舒张血管和抗疲劳的药物的制备中，为三七药物开发来源提供了一条新途径。
附图说明
图1为实施例4制备的具有抑制凝血酶活性的药物组合物对凝血酶活性的影响。
图2为实施例4制备的具有抑制凝血酶活性的药物组合物对大鼠肠系膜上动脉血管舒张活性的影响。
图3为实施例4制备的具有抑制凝血酶活性的药物组合物对大鼠下丘脑5-HT的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
三七不定根粉末，是用下述方法制成：
(1)三七不定根的诱导：将新鲜采集的三七根清洗干净，用体积浓度为75％乙醇水溶液消毒，在洁净台内切成1-1.5cm2小片，接种到愈伤诱导培养基中，23-27℃避光培养3-4周可见愈伤组织；将愈伤组织转接到不定根诱导培养基上继续诱导，25℃避光培养3-4周形成不定根；
愈伤诱导培养基：MS+3％蔗糖+3mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA固体培养基；
不定根诱导培养基：MS+3％蔗糖+1.0mg/L KT+2.0mg/L IBA固体培养基；
(2)三七不定根的驯化培养及筛选：将步骤(1)获得的三七不定根转接到驯化培养基上进行驯化继代，根据根系分枝多少筛选根系，并进行活性成分含量测定，筛选出根系分枝在3-5个以上，且三七皂苷和人参皂苷总含量高于15mg/g干重的稳定根系在120-150rpm，23-27℃下培养6-7周；
所述驯化培养基为11g/L SH+30g/L蔗糖+1mg/L NAA+3mg/L IBA，余量为水；
(3)三七不定根的反应器培养：将步骤(2)获得的筛选后的三七不定根接种于含有驯化培养基的气升式反应器中，通气量为0.1vvm，室温培养8-10周；
(4)三七不定根的粉末制备：将步骤(3)获得的三七不定根50-60℃烘干粉碎后，过100-200目筛，即得三七不定根粉末。
西洋参提取物为市售：总皂苷含量大于等于80％。
黄芪提取物为市售：纯度大于等于60％。
川芎提取物为市售：纯度大于等于75％。
丹参提取物为市售：纯度大于等于85％。
当归提取物为市售：纯度大于等于80％。
各实施例的重量份可以是克，千克或其它重量单位。
各实施例的：
愈伤诱导培养基：MS+3％蔗糖+3mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA固体培养基；
不定根诱导培养基：MS+3％蔗糖+1.0mg/L KT+2.0mg/L IBA固体培养基；
驯化培养基为11g/L SH+30g/L蔗糖+1mg/L NAA+3mg/L IBA，余量为水；
实施例1
三七不定根粉末，是用下述方法制成：
(1)三七不定根的诱导：将新鲜采集的三七根清洗干净，用体积浓度为75％乙醇水溶液消毒，在洁净台内切成1-1.5cm2小片，接种到愈伤诱导培养基中，25℃避光培养3.5周可见愈伤组织；将愈伤组织转接到不定根诱导培养基上继续诱导，25℃避光培养3.5周形成不定根；
(2)三七不定根的驯化培养及筛选：将步骤(1)获得的三七不定根转接到驯化培养基上进行驯化继代，根据根系分枝多少筛选根系，并进行活性成分含量测定，筛选出根系分枝在3-5个以上，且三七皂苷和人参皂苷总含量高于15mg/g干重的稳定根系在140rpm，25℃下培养6.5周；
(3)三七不定根的反应器培养：将步骤(2)获得的筛选后的三七不定根接种于含有驯化培养基的气升式反应器中，通气量为0.1vvm，室温培养9周；
(4)三七不定根的粉末制备：将步骤(3)获得的三七不定根55℃烘干粉碎后，过200目筛，即得三七不定根粉末。
实施例2
三七不定根粉末，是用下述方法制成：
(1)三七不定根的诱导：将新鲜采集的三七根清洗干净，用体积浓度为75％乙醇水溶液消毒，在洁净台内切成1-1.5cm2小片，接种到愈伤诱导培养基中，23℃避光培养4周可见愈伤组织；将愈伤组织转接到不定根诱导培养基上继续诱导，25℃避光培养3周形成不定根；
(2)三七不定根的驯化培养及筛选：将步骤(1)获得的三七不定根转接到驯化培养基上进行驯化继代，根据根系分枝多少筛选根系，并进行活性成分含量测定，筛选出根系分枝在3-5个以上，且三七皂苷和人参皂苷总含量高于15mg/g干重的稳定根系在120rpm，23℃下培养7周；
(3)三七不定根的反应器培养：将步骤(2)获得的筛选后的三七不定根接种于含有驯化培养基的气升式反应器中，通气量为0.1vvm，室温培养8周；
(4)三七不定根的粉末制备：将步骤(3)获得的三七不定根50℃烘干粉碎后，过100目筛，即得三七不定根粉末。
实施例3
三七不定根粉末，是用下述方法制成：
(1)三七不定根的诱导：将新鲜采集的三七根清洗干净，用体积浓度为75％乙醇水溶液消毒，在洁净台内切成1-1.5cm2小片，接种到愈伤诱导培养基中，27℃避光培养3周可见愈伤组织；将愈伤组织转接到不定根诱导培养基上继续诱导，25℃避光培养4周形成不定根；
(2)三七不定根的驯化培养及筛选：将步骤(1)获得的三七不定根转接到驯化培养基上进行驯化继代，根据根系分枝多少筛选根系，并进行活性成分含量测定，筛选出根系分枝在3-5个以上，且三七皂苷和人参皂苷总含量高于15mg/g干重的稳定根系在150rpm，27℃下培养6周；
(3)三七不定根的反应器培养：将步骤(2)获得的筛选后的三七不定根接种于含有驯化培养基的气升式反应器中，通气量为0.1vvm，室温培养10周；
(4)三七不定根的粉末制备：将步骤(3)获得的三七不定根60℃烘干粉碎后，过200目筛，即得三七不定根粉末。
实施例4
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物，按重量包括15份三七不定根粉末(实施例1制备)、4份西洋参提取物、5份黄芪提取物、3份川芎提取物、4份丹参提取物和3份当归提取物。
实施例5
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物，按重量包括12份三七不定根粉末(实施例2制备)、3份西洋参提取物、4份黄芪提取物、2份川芎提取物、3份丹参提取物和2份当归提取物。
实施例6
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物，按重量包括18份三七不定根粉末(实施例3制备)、5份西洋参提取物、6份黄芪提取物、5份川芎提取物、6份丹参提取物和4份当归提取物。
上述各药物组合物还可以加入药学上的赋形剂微晶纤维素。
实施例7
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物抑制凝血酶活性作用
所用浓度为1mg/mL(0.9％NaCl水溶液)凝血酶溶液，药物组合物(实施例4制备)三七不定根粉末(实施例1制备，图中简称三七不定根)、西洋参提取物(图中简称西洋参)、黄芪提取物(图中简称黄芪)、川芎提取物(图中简称川芎)、丹参提取物(图中简称丹参)、当归提取物(图中简称当归)配制为浓度10mg/mL的母液(5％DMSO溶解后用0.9％NaCl水溶液配制)，凝血酶发色底物S-2238作为底物，浓度为10mg/mL(0.9％NaCl水溶液)，小鼠血浆SBJ-O0042购买于南京森贝伽生物科技有限公司。
将药物组合物50μL，50％小鼠血浆30μL和凝血酶溶液30μL加入96孔板中混匀，25℃孵育10min。继续加入S-2238溶液75μL，25℃混匀继续孵育10min，以30μL的0.9％NaCl水溶液代替凝血酶溶液作为空白对照，肝素为阳性对照。
在微孔板分光光度计(Multiskan FC,Thermo scientific)405nm波长下测定吸光值。每一浓度6组生物平行。
不同浓度药物组合物及各组份提取物对凝血酶活性的影响如图1所示，药物组合物能显著抑制凝血酶活性，相对于对照组，抑制率为12.1％(a,b,c，各组间在p＜0.05上的差异显著性)，由此药物组合物具有抑制凝血酶活性。在2到10mg/mL的浓度范围内，药物组合物抑制凝血酶活性的能力随剂量增加而增强，在5mg/mL时抑制率变化最显著；浓度继续增加，抑制率变化不大，因此优选浓度为5mg/mL。见图1。
实施例8
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物促进血管舒张的作用
取雄性鼠龄3±0.5周原发性高血压大鼠(SHR)，均购于北京华阜康生物科技股份有限公司。随机分8组/6只，分别为SHR组，SHR+药物组合物组(实施例4制备)，SHR+三七不定根粉末(实施例1制备)，SHR+各组份提取物(西洋参提取物、黄芪提取物、川芎提取物、丹参提取物、当归提取物)。SHR+药物组合物组，SHR+三七不定根粉末和SHR+各组份提取物组，每日给予药物组合物，三七不定根粉末和各组份提取物溶液灌胃一次，剂量100mg/kg体重，共进行6周，SHR组给予等体积生理盐水作为对照。进行肠系膜上动脉血管舒张试验。
药物组合物对大鼠肠系膜上动脉血管舒张活性的影响如图2所示，SHR+药物组合物相对于对照组(SHR组，血管舒张度32.26％)和各组份组，血管舒张度提高到59.87％，出现显著改善(a,b,c，各组间在p＜0.05上的差异显著性)，由此药物组合物有促进血管舒张的作用。
实施例9
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物的抗疲劳作用
取SPF级雄性SD大鼠54只，均购于北京华阜康生物科技股份有限公司。随机分9组/6只。药物组合物组(实施例4制备)和各组份组，每日给予药物组合物，各组份溶液灌胃一次，剂量50mg/kg体重；模型组(等容量生理盐水)和空白组(等容量生理盐水)，空白组灌胃1h后放回，其他组进行中强度水平跑台运动，共进行14天，进行脑组织取材和匀浆制备样品。5-羟色胺(5-HT)测定采用岛津液相LC-2030C(Shimadzu,Kyoto,Japan)，色谱柱Kromasil C18(4.6×250mm,5μm)进行定量分析。
与空白组(230.21ng/g)比较,模型组下丘脑5-HT含量(478.3ng/g)有显著性升高；药物组合物处理后，大鼠下丘脑5-HT含量(336.87ng/g)较模型组有显著的降低(a,b,c，各组间在p＜0.05上的差异显著性)，而各组份组下丘脑5-HT含量均高于药物组合物组，且与药物组合物处理组相比，具有显著差异(图3)。5-HT可抑制中枢神经、激发倦怠、食欲不振、睡眠紊乱等疲劳症状,由此药物组合物具有抗疲劳的作用。
实验证明，实施例5和实施例6的一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物抑制凝血酶活性作用、促进血管舒张的作用、抗疲劳作用与实施例4效果相似。
实施例7
一种具有抑制凝血酶活性的药物组合物片剂的制备
将实施例4获得的药物组合物粉碎后，按以下处方加入片剂辅料：药物组合物2g，微晶纤维素100g，交联聚维酮XL40g，硬脂酸镁20g，充分混匀后压片400片。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
还可以按常规技术手段制成胶囊剂或胶丸。