具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供具有促进干细胞定向分化心肌细胞作用的中药复合物，包括：海龙、鹿茸、海马、人参、黄芪、淫羊藿、紫河车、丹参、绞股蓝和天山雪莲。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，该中药复合物中，海龙、鹿茸、海马、人参、黄芪、淫羊藿、紫河车、丹参、绞股蓝和天山雪莲的质量均相同。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，海龙、鹿茸、海马、人参、黄芪、淫羊藿、紫河车、丹参、绞股蓝粉和天山雪莲均采用各自对应的中药粉。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，取各中药粉海龙粉、鹿茸粉、海马粉、人参粉、黄芪粉、淫羊藿粉、紫河车粉、丹参粉、绞股蓝粉和天山雪莲粉分别溶于DMSO中制成储存液使用。

使用液相色谱质谱联用法对具有促进干细胞定向分化心肌细胞作用的中药复合物进行药物分析，本发明获取到了能够促进干细胞定向分化心肌细胞作用的单体成分，因此，本发明还提供具有促进干细胞定向分化心肌细胞作用的中药有效组分组合物，包括：淫羊藿苷、黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、PLGF₂、丹酚酸B、鞘氨醇-1-磷酸、鹿茸多肽、海龙提取物和海马提取物。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，制备所述海龙提取物的方法包括：海龙干燥后切碎打粉，过80目筛备用。称取2份海龙粉末，一份用水煎煮升温回流提取3次，合并3次提取液备用；另一份用75％乙醇回流提取3次，合并3次提取液备用；将水提和醇提后剩余药渣中加入蛋白酶水解后灭酶，用350目滤布过滤出滤液备用；将水提液、醇提液、酶解液混合后低温真空浓缩、过滤、喷雾干燥、粉碎混合过筛包装即成。

制备所述海马提取物的方法包括：海马干燥后切碎打粉，过80目筛备用。称取2份海马粉末，一份用水煎煮升温回流提取3次，合并3次提取液备用；另一份用75％乙醇回流提取3次，合并3次提取液备用；将水提和醇提后剩余药渣中加入蛋白酶水解后灭酶，用350目滤布过滤出滤液备用；将水提液、醇提液、酶解液混合后低温真空浓缩、过滤、喷雾干燥、粉碎混合过筛包装即成。

本发明还提供具有促进干细胞定向分化心肌细胞作用的化合物，该化合物是在使用液相色谱质谱联用法对具有促进干细胞定向分化心肌细胞作用的中药复合物进行药物分析时获得的全新的化合物，所述化合物来自于鹿茸多肽、海龙提取物和海马提取物的混合物，所述化合物为环烯醚萜苷Scropolioside D新的同分异构体，其分子式为C₃₄H₄₂O₁₇，结构如下所示：

本发明还提供所述的中药复合物、所述的中药有效组分组合物和/或所述的化合物在制备促进干细胞定向分化心肌细胞的药物或试剂盒中、及科学研究中的用途。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：本发明中所用的试剂：

表1.免疫荧光检测所用抗体清单

SMA:smooth muscle actin；Cyto C:Cytochrome C；c-TNI:cardiac Troponin I.

Matrigel基质胶，购于美国BD公司，作用：促进细胞贴壁。

Trizol裂解液(公司：Invitrogen，型号：15596-026)。

DMEM无糖培养基(公司：GIBCO，货号：11966-025)。

Y27632因子，凋亡抑制剂，购于美国SIGMA公司，作用：抑制细胞凋亡。

E8干细胞培养基，购于美国StemCell公司，作用：iPS细胞维持培养。

mTeSR干细胞培养基，购于美国StemCell公司，作用：iPS细胞扩增培养。

CHIR99021，小分子诱导分化剂，购于美国SIGMA公司，作用：诱导iPS向中胚层分化)CDM培养基，用RPMI 1640培养基，该RPMI 1640培养基购于美国GIBCO公司，作用：分化培养基的溶剂。

Pen/Strep，青链霉素，购于美国GIBCO公司，作用：抗菌。

MEM NEAA，非必需氨基酸溶液，购于美国GIBCO公司，作用：细胞培养添加剂。牛血清白蛋白BSA，购于美国SIGMA公司，作用：细胞培养添加剂。

AA2P抗坏血酸，购于美国SIGMA公司，作用：细胞分化液添加剂。

MTG硫代甘油，购于美国SIGMA公司，作用：细胞分化液添加剂，现配现用。

bFGF人碱性成纤维细胞生长因子，购于美国Pepro Tech公司，作用：诱导iPS向中胚层进一步分化。

IWP2，Wnt抑制剂，购于美国SIGMA公司，作用：诱导iPS向心肌中胚层分化。

KOSR，血清替代物，购于美国GIBCO公司，作用：细胞培养添加物。

Cyto C一抗，细胞色素C抗体；购买公司：Proteintech；货号：66264-1-Ig。

表2.Q-PCR检测所用引物序列信息

一、Saponin⁺中药复合方Mix优化诱导hiPS分化心肌细胞的实验研究：

①制备方法：

(1)1g海龙粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g鹿茸粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；0.5g海马粉中加入5mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g人参粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g黄芪粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g淫羊藿粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g紫河车粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g丹参粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g绞股蓝粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液；1g天山雪莲粉中加入10mL的DMSO配制为100mg/mL储存液。

(2)将上述储存液各取1mL充分混匀(共10mL)，以10:1000加入对应培养基中进行干预，即1mL培养基中加入10μL中药Mix。

②实验流程与结果：

本章节基于心脏胚胎发育的理论基础和前人的研究方法，摸索并整合出能稳定分化出可搏动心肌细胞的标准诱导方案，并在iPS向心肌细胞分化的不同时间节点(中胚层形成期、心肌中胚层形成期、心肌祖细胞形成期)施加本团队独特制备的Saponin⁺中药复合方Mix，构建出一套高分化率、高成熟度的中药辅助诱导心肌细胞定向分化的优化方案。

在优化后的iPS定向分化心肌细胞标准方案基础上，施加本团队独特制备的Saponin⁺中药复合方Mix，综合运用Q-PCR和流式细胞术检测法，摸索出Saponin⁺中药复合方Mix的最佳干预时间节点。

(1)实验分组：

本实验对iPS向心肌细胞分化过程中关键的三个时间点，即分化第3天(中胚层形成期)、分化第5天(心肌中胚层形成期)、分化第7天(心肌祖细胞形成期)进行Saponin⁺中药干预效果摸索，共分为4组：1)标准诱导无中药组；2)中药day3增效诱导组；3)中药day5增效诱导组；4)中药day7增效诱导组。

(2)实验操作：

1)将连续传代至少5代次的iPS细胞以2×10⁶个/mL密度接种于预铺Matrigel基质胶的六孔板内，每孔加2mL含10μM因子Y27632的E8干细胞培养基过夜，次日换不含Y27632的mTeSR干细胞培养基，之后每日换液一次；

2)待六孔板内iPS细胞密度达到100％刚好铺满单层时开始进行连续15天的心肌细胞定向分化。分化第1天：吸弃mTeSR干细胞培养基，用DPBS缓冲液清洗3遍后吸干，加入含10μM CHIR99021小分子诱导分化剂的CDM培养基(用RPMI 1640培养基)、Pen/Strep、MEMNEAA、BSA、AA2P、MTG；分化第2天：吸弃CHIR99021-CDM培养基，用DPBS缓冲液清洗3遍后吸干，加入含5ng/mL小分子bFGF的CDM培养基；分化第3天：吸弃bFGF-CDM培养基，用DPBS缓冲液清洗3遍后吸干，中药day3增效诱导组在CDM培养基中添加1％的中药复合物Mix，其余中药诱导组不添加中药Mix；分化第4天：吸弃半量旧CDM培养基，加入半量含5μM小分子IWP2的CDM培养基，中药day3增效诱导组需要继续添加1％的中药复合物，其余中药诱导组不添加中药；分化第5天：中药day5增效诱导组在旧培养基中添加1％的中药复合物，其余中药诱导组不再添加中药；分化第6天：吸弃IWP2-CDM培养基，用DPBS缓冲液清洗3遍后吸干，加入新鲜的CDM培养基，中药day3和day5增效诱导组需要继续添加1％的中药复合物，中药day7增效诱导组不添加中药；分化第7天：吸弃半量的CDM培养基，加入半量含3％KOSR的RPMI-1640培养基，三个中药增效诱导组均添加1％的中药复合物；分化第8天：吸弃旧培养基，完全换为含3％KOSR的RPMI-1640培养基，三个中药增效诱导组均添加1％的中药复合物；此后以同样配方每3天换一次液，一直维持到分化第15天心肌细胞成熟。

3)观察各组iPS细胞分化关键时间点的细胞形态学变化并采集代表性图像，收集分化第15天的心肌细胞进行特异性标记基因检测，包括未分化的干细胞标记物(Nanog，Oct3/4,Fgf4(成纤维生长因子4)，Esg1，Dppa2(发育多能性相关基因2)，and Dppa4(发育多能性相关基因4))和心肌特异性标记物(c-TnI(心肌肌钙蛋白)，TNNT-2(骨骼肌快肌肌钙蛋白T-2)，Nkx2.5，GATA4(GATA结合蛋白-4)，CX43(缝隙连接蛋白-3)，and Mef2C(肌细胞增强因子2C))，结合心肌细胞搏动状态对比，找出最佳的中药复合物干预节点。具体操作方法如下：①提取总RNA：每孔加入1mL的Trizol裂解液裂解细胞后4℃条件下以10,000rpm离心10min，取上清转入无RNA酶的离心管中，每管加0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒后室温孵育5min。4℃离心15min，取样品中的水相部分，加入1倍体积的70％乙醇后转入吸附柱中离心50秒，弃废液，加500μL去蛋白液后离心50秒，弃废液，加入700μL漂洗液后离心1min，弃废液，加500μL漂洗液离心1min，弃废液。根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50μL无RNA酶水后离心1min，取洗脱液待用。②总RNA纯度和浓度测定：取2μL RNA，加98μL无RNA酶水，紫外分光光度计测A260/A280检测RNA纯度。计算总RNA的浓度(μg/μL):A260×稀释倍数为50倍×40/1000。③引物设计及稀释：由北京欧林格生物公司合成引物，以GAPDH做内参。④反转录：取1μg RNA，加入无RNA酶水配成9.5μL反应体系A，反转录仪中70℃反应10min；将2μL dNTP，0.5μL Rnasin，4μL MgCl₂，1μL AMV，2μL 10×Buffer，1μL OligdT混合10min后，全部加入反应体系A中，轻轻离心至管底，放入反转录仪以42℃60min→95℃5min→4℃5min反转录为cDNA。⑤实时荧光PCR扩增：cDNA加80μL无RNA酶水稀释5倍后加入2μL上下游混合引物、10μL稀释后的cDNA、13μL PCR Mix，混匀后RNA仪中以95℃10min，95℃30秒，55℃1min，72℃1min共40个循环进行扩增。⑥数据处理：以2^-△△Ct表示干预组待测基因相对于空白对照组待测基因表达量的倍数。

4)用流式细胞术检测标准诱导组和最佳中药Mix诱导组的心肌细胞分化率(c-TNI标记心肌细胞占比即为心肌细胞分化率)，最终整合形成稳定且重复性好的中药Mix辅助诱导iPS定向分化心肌细胞优化方案。流式技术检测心肌细胞分化率的具体操作方法如下：①消化收集标准诱导组和中药诱导组分化第15天的细胞，制成单细胞悬液；②350g共5min离心收集细胞，弃培养基；③加入2mL DPBS缓冲液重悬细胞后，500g共5min离心收集细胞；④细胞计数后，取出已经调整浓度至1x10⁷的100μL细胞悬液，加入c-TNI直标抗体，4℃避光孵育30min；⑤加入2mL的DPBS缓冲液，1mL枪头轻轻吹打混匀之后，500g离心5min，弃上清；⑥350g共5min离心收集细胞，弃培养基；⑦加入500μL的DPBS缓冲液，流式细胞仪上机检测。

2.2.3统计学处理

用SPSS 24.0统计软件对各组实验数据进行方差齐性检验，多样本总体均数比较采用单因素方差分析，所有数据都用均数±标准差表示，统计结果显示P＜0.05时差异有统计学意义。

iPS分化心肌细胞的优化方案探索(中药干预节点优选)研究结果：

各实验组均以100％起始密度进行同步分化，分化第3天，中药day3增效诱导组相较其他实验组可见细胞增殖明显，细胞向中心聚集并相互挤压覆盖。分化至第5天，中药day3增效诱导组细胞进一步快速增殖，中药day5增效诱导组也出现小幅的细胞增殖和堆叠，另两组细胞增殖不明显。分化至第7天，中药day3和day5组细胞增殖显著，标准诱导组和中药day7增效诱导组细胞也有一定数量的细胞增殖和聚集，但与中药day3和day5组相比尚有差距。分化至第15天，各组细胞均可见成片搏动，但搏动频率相差较大，中药day3增效诱导组在分化第7天首次起跳，分化15天后以98次/分的频率收缩且搏动有力，各视野下搏动同步、节律整齐；中药day5增效诱导组在分化第8天首次起跳，以90次/分搏动，各区域搏动同频，部分区域细胞未见搏动；中药day7增效诱导组和标准诱导组均在分化第10天首次起跳，搏动幅度相似，频率约为80次/分，部分区域细胞未见搏动(图1)。综合明场下细胞状态观察，中药day3增效诱导组和中药day5增效诱导组均可选，其中前者为最优选。

进而本发明对分化第15天的细胞进行Q-PCR检测，发现未分化干细胞特异性标记基因(Nanog、Oct3/4、Fgf4、Esg1、Dppa2和Dppa4)的mRNA表达在中药day3增效诱导组显著低于其他组(^*P＜0.05)。相反，成熟心肌细胞特异性标记基因(c-TNI、α-actinin、TNNT-2、CX43、Nkx2.5、GATA4和Mef2C)的mRNA表达量在中药day3增效诱导组中高于其他组别(^*P＜0.05)。由此，本发明将分化第3天确定为开始Saponin⁺中药复合物Mix干预诱导分化的最佳时间(图2)。

确定了中药Mix优化诱导的最佳干预节点后，本发明用流式细胞术计算了c-TNI特异性标记的心肌细胞占比，以对比分析标准诱导和中药Mix优化诱导方案的hiPS-CMs分化率，结果显示，在分化第15天时，中药Mix辅助诱导组的心肌细胞分化率为92.3％，标准诱导组的心肌细胞分化率为35.9％，中药Mix辅助诱导iPS定向分化心肌细胞的分化率是不加中药组的3倍(图3)

虽然目前iPS分化心肌细胞的现有方案可重复性好、分化稳定性高，但心肌细胞分化率仍不尽如人意，要获得大量高纯度的成熟hiPS-CMs仍存在困难。此外本发明观察到一个现象，标准诱导的hiPS-CMs在离开细胞培养箱一段时间后，其搏动频率会明显变慢且节律紊乱，由此本发明大胆猜测，hiPS-CMs移植入心脏后出现心律失常并发症除了移植细胞与宿主心肌细胞之间电连接异常有关，是否还与移植入体内的心肌细胞自身电信号不稳定有关？进而，本发明创新性探索在标准诱导方案中融入中医药元素，尝试通过添加中药复合物Mix来实现定向诱导高分化率、高稳定性和高成熟度心肌细胞的目的。

本发明认为中医填精养心法与干细胞分化形成成熟心肌细胞的过程具有内在的一致性，从胚胎发生学上看，干细胞基本符合中医元精的所有功能特征，是元精在机体微观层面的存在形式。元精化生元气，元精体现物质结构，元气体现代谢和能量传递功能，干细胞分化并形成成熟心肌细胞产生能量代谢的过程即为元精化生元气的过程。在此思路指引下，本发明以填精养心作为基本思路，结合临床应用经验，筛选出填精益气中药组成了本团队独特制备的Saponin⁺中药复合方Mix用于hiPS-CMs的优化诱导。本发明前期通过预实验已初步摸索出此中药Mix作用于iPS细胞分化过程的无毒性浓度，下一步的优化研究本发明固定中药配比，对中药干预时间点进行细化摸索。通过在中胚层期、心肌中胚层期和心肌祖细胞期添加最优配比的中药Mix，本发明发现在中胚层形成初期至心肌祖细胞分化成熟全程添加中药Mix，并在心肌细胞维持培养期撤除中药复合物，可快速稳定分化出比标准诱导方案高3倍分化率的成熟自主搏动心肌细胞，成功建立了中药辅助诱导hiPS-CMs的优化方案。此优化方案的重要优势在于不需要外源性支持细胞(如内胚层样细胞)共培养且可重复性好，分化出的心肌细胞纯度和成熟度高、肌丝肌节清晰完整。

二、Saponin⁺中药复合方Mix的有效组分筛选及优化——创制中药Compound单体组合物诱导hiPS分化心肌细胞的探索性研究：

使用液相色谱质谱联用法对Saponin⁺中药Mix进行药物分析，色谱分离在WatersAcquity UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm，Milford,MA,USA)上进行，LC与质谱仪的连接通过电喷雾电离(ESI)接口实现。由0.1％甲酸(A)和ACN(B)组成的流动相按如下程序梯度输送：0-15min，30％-75％B；15-20分钟，75％-100％B；20.1-25分钟，30％B，流速为0.25mL/min。将进样体积设置为5.0μL，并将柱烘箱保持在40℃，出口依次连接DAD模块和IT-TOF-MS。LCMS溶液软件(Shimadzu版本3)用于数据处理，定义分子量公式计算的质量公差为±10ppm。

如图4的LC-IT-TOF-MS鉴定出Saponin+中药复合方Mix中主要单体成分为淫羊藿苷、黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、PLGF2(重组人胎盘生长因子-2)、丹酚酸B、鞘氨醇-1-磷酸、以及环烯醚萜苷Scropolioside D的同分异构体，其为全新的化合物，分子式为C₃₄H₄₂O₁₇，其结构见下及图5所示：

次要单体成分为下表：

在此基础上，本发明进一步优化Saponin⁺中药复合方Mix的组成和配比，将筛选出已明确的主要中药单体组分替换Mix中对应的中药全体，进而整合出简化后的中药单体组合物Compound，中药Compound具体配制如下：

淫羊藿苷20μg/mL，黄芪甲苷20μg/mL，人参皂苷Rg1 20μg/mL，PLGF₂ 5ng/mL，丹酚酸B10μg/mL，鞘氨醇-1-磷酸2nM，鹿茸多肽100μg/mL，海龙提取物100μg/mL，海马提取物100μg/mL，其中鹿茸多肽、海龙和海马提取物的混合液中含环烯醚萜苷Scropolioside D新的同分异构体。

将以上浓度的中药Compound加入hiPS定向诱导心肌细胞的分化过程中，对比标准诱导(不加中药Compound诱导)和中药Compound优化诱导出的hiPS-CMs在基因层面和功能结构层面的区别和机制，本发明分别把hiPS标准诱导到第5天、标准诱导到第15天、中药Compound优化诱导到第5天、中药Compound优化诱导到第15天的细胞RNA提取出来进行全转录组mRNA测序，结果如图6显示：

①心肌细胞早中期成熟标记物GATA4和Nkx2.5较分化前升高情况如下：

可见中药Compound优化诱导的心肌细胞早中期成熟标记物从分化第5天开始就已逐渐优于标准诱导组，心肌细胞发育成熟速度更快、成熟度更高。

②心肌细胞分化末期成熟标记物α-MHC和c-TNI较分化前升高情况如下：

可见中药Compound优化诱导的心肌细胞晚期成熟标记物从分化第7天开始就已逐渐优于标准诱导组，在分化第15天时心肌细胞成熟程度远高于标准诱导组，表现出了中药Compound强劲的促心肌细胞分化能力。

进而本发明通过MEA微阵列检测心肌细胞电生理功能，钙瞬变检测心肌细胞收缩功能，线粒体荧光探针检测心肌细胞线粒体结构，免疫荧光检测线粒体膜电势、钙水平及细胞色素C，对比标准诱导与中药Compound优化诱导的心肌细胞结构和功能差异，初步明确中药Compound优化诱导hiPS-CMs可能的增效潜力和机制。

①标准和中药Compound优化诱导的hiPS-CMs细胞纯化和再接种

(1)hiPS-CMs细胞纯化：

1)待心肌细胞分化完成，对心肌细胞进行纯化处理，以DMEM无糖培养基(公司：GIBCO，货号：11966-025)+5mM乳酸钠配制心肌细胞纯化液。

2)待心肌细胞稳定搏动1-2天后，吸走旧的心肌细胞培养基，加入DPBS缓冲液清洗一次，更换为心肌细胞纯化液进行纯化。

3)将细胞置于5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养3天，过程中无需换液。纯化结束后，加入DPBS缓冲液清洗一次去除死细胞，更换为含3％KOSR的RPMI1640培养基，维持培养。

4)3天后，可观察到细胞恢复搏动，细胞纯度变高，可根据细胞状态和纯化效果，分多次进行纯化，直至细胞贴壁良好，单个细胞轮廓清晰可见，即完成纯化。

(2)hiPS-CMs细胞再接种：

1)以高糖DMEM+20％FBS+Y27632配制心肌细胞接种液待用。

2)在超薄玻璃底的细胞培养皿中加入1mL的Matrigel基底胶铺板，铺好胶后直接放置37℃细胞培养箱1小时后可用。

3)取出分化好的心肌细胞，吸走旧培养基，加入DPBS缓冲液清洗一次。

4)加入人心肌细胞消化液使之完全覆盖皿底，37℃孵育20min，显微镜下观察到大部分细胞相互分离，且呈现“圆形”，表明细胞消化时间理想。加入等体积含血清的培养基终止消化，用移液器轻柔吹打，制成单细胞悬液，将细胞悬液转至15mL离心管中，200g离心5min。

5)弃上清，用心肌细胞接种液重悬细胞，轻柔吹打混匀后接种到预铺胶的玻璃底细胞培养皿中，水平十字振动使细胞分布均匀。

6)置入5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养24h，次日更换为含3％KOSR的RPMI1640培养基，维持培养至细胞稳定后可进行免疫荧光检测。注：心肌细胞因传代操作暂时停止搏动，一般1-3天后恢复正常。

②标准和中药Compound优化诱导的hiPS-CMs细胞外电生理信号检测

(1)提前一天用Matrigel基底胶对MEA电极板进行铺底，每孔5μL。

(2)次日把分化完毕、维持培养的心肌细胞温和消化后进行细胞计数，以每孔2×10⁴个/mL的密度将心肌细胞接种到预包被的MEA电极板，接种每孔前，吸去孔中预先孵育的Matrigel基底液，并取5μL细胞悬液小心接种到电极板上，注意接种前将细胞悬液吹匀。

(3)全部接种结束后，将电极板放入细胞培养箱，4-6h后取出，观察，此时细胞已经开始贴壁，向每孔补充心肌细胞接种液300μL，放入细胞培养箱中培养，次日换为含3％KOSR的心肌细胞培养液维持培养，之后隔日换液。

(4)接种细胞7天后，待心肌细胞开始稳定搏动后，上机检测心肌细胞的基础电信号(Baseline)，进而每组各取2孔加100nM异丙肾上腺素(ISO)，2孔加10μM利多卡因(Lidocaine)，加药后10min检测心肌细胞场电位信号，分析数据。

③标准和中药Compound优化诱导的hiPS-CMs细胞内钙瞬变信号检测

将纯化后再接种于玻璃培养小皿的hiPS-CMs与HEPES缓冲盐配制的2μM Fluo-4AM溶液在37℃的条件下培养30min，进而吸弃染液，用DPBS缓冲液冲洗细胞3次，每次10min，避光并使用电动倒置荧光显微镜和延时记录系统在37℃下记录自发的Ca²⁺瞬变。每个培养皿中至少记录6个视野，每个视野记录时长至少持续1分钟。Ca²⁺瞬变的大小以标准荧光强度的变化即△F/F0表示，其中F0表示静息状态的荧光强度，所有数值计算时均减去背景荧光。

④标准和中药Compound优化诱导的hiPS-CMs线粒体结构和功能检测

(1)MTG标记的线粒体结构检测：

将低密度纯化后再接种于玻璃培养小皿的hiPS-CMs细胞的培养基置换为含有100nM线粒体绿色荧光探针(MTG)和2μg/mL Hoechst 33342的培养基，置于37℃培养箱中孵育30min后，使用共聚焦显微镜随机选取6个视野拍照，两组细胞中，每组3个样本，分别进行高分辨率成像，对单个线粒体进行识别和分析。

(2)Rhod-2线粒体钙水平荧光成像：

在低密度纯化后再接种于玻璃培养小皿的hiPS-CMs细胞培养基中，加入1μM的Rhod-2/AM后置于37℃培养箱中孵育45min，用DPBS缓冲液清洗1次，换上含有5μg/mL的Hoechst 33342和100nM MTG的心肌细胞培养基，置于37℃培养箱中继续培养30min。荧光显微镜下采集405、488和555nm激发波下的数据，用Image Pro Plus软件测定Rhod-2的荧光强度，并与MTG标记的线粒体平均荧光强度进行比较，其比值代表线粒体钙含量的大小。

(3)TMRE线粒体膜电势荧光成像：

将低密度纯化后再接种于玻璃培养小皿的hiPS-CMs细胞的培养基置换为含有5nM线粒体膜电位敏感荧光团(TMRE)、100nM MTG和2μg/mL Hoechst 33342的培养基，置于37℃培养箱中孵育30min后，使用荧光显微镜随机选取6个视野拍照，两组细胞中，每组3个样本，TMRE荧光在546nm处激发，并通过590nm屏障滤光片收集荧光。用Image Pro Plus软件测定TMRE的荧光强度，并与MTG标记的线粒体平均荧光强度进行比较，其比值代表线粒体膜电位的平均大小。

(4)线粒体细胞色素C免疫荧光成像：

1)取出低密度纯化后再接种于玻璃培养小皿的hiPS-CMs细胞，弃掉孔内培养基，用DPBS缓冲液轻柔清洗3次，每次3min。

2)每皿加入1mL预冷的4％多聚甲醛，常温固定20min后，用DPBS缓冲液轻柔清洗3次，每次3min。

3)每皿加入1mL含0.2％Triton X-100的PBS，冰上静置10min后，用DPBS缓冲液轻柔清洗3次，每次3min。

4)每皿加入1mL含1％BSA的PBS，室温封闭1h。

5)将Cyto C一抗以1:100的比例稀释后，取出500μL滴加在培养皿中，令抗体全面覆盖细胞面，4℃孵育过夜。

6)吸出皿中的一抗孵育液，用DPBS缓冲液轻柔清洗3次，每次3min。

7)滴加1:50配制的荧光素二抗工作液，37℃孵育30min(注意避光)。

8)用DPBS缓冲液轻柔清洗3次，每次3min。每孔加入500μL的DAPI染色液，室温染色5min。

9)用DPBS缓冲液轻柔清洗3次，每次3min。取一张洁净载玻片，中心位置滴加50μL抗荧光淬灭封片剂，晾干液体后于荧光显微镜下进行图片采集，用Image Pro Plus软件对Cyto C的荧光强度进行定量比较分析。

统计学处理

用SPSS 24.0统计软件对各组实验数据进行方差齐性检验，多样本总体均数比较采用单因素方差分析，所有数据都用均数±标准差表示，统计结果显示P＜0.05时差异有统计学意义。

结果

①中药Compound优化诱导的hiPS-CMs电生理灵敏度和稳定性优于标准诱导组

本发明用含有乳酸钠的无糖培养基对标准诱导和中药优化诱导的hiPS-CMs进行纯化后，比较它们在基础条件下、100nM异丙肾上腺素(ISO)和10μM利多卡因(Lidocaine)处理后的电生理功能。MEA微矩阵电极系统记录了两组心肌细胞搏动信号的传播情况，在基础条件下，标准诱导和中药优化诱导的hiPS-CMs具备相似的电信号顺序激活一般模式，均从右上向左下传播，但中药Compound诱导组完成一次顺序激活的时间为12.32ms，短于标准诱导的13.95ms，显示出更优异的电兴奋传播速度。两组细胞在施加ISO干预后，均显著缩短了顺序激活时长，中药Compound诱导组在加速和强化电信号传播的同时，还能保持传播方向上的稳定性，而标准诱导组与其自身基线水平相比，呈现出不稳定的电传播变化，传播方向从右下向左上出现整体逆转。当在细胞中添加Lidocaine抑制电兴奋后，两组细胞的正常电传播均被打断，电传播信号无法测及，说明两组细胞对电兴奋抑制剂的敏感性良好(图7)。

在心肌细胞场电位检测中也得到类似的观察结果，本发明发现在基线水平下，两组细胞搏动节律均匀齐，但中药Compound诱导组心肌细胞搏动振幅大且均等，而标准诱导组振幅小、变化缺乏同步性。施加ISO激活后，两组细胞搏动频率均增快，其中标准诱导组频率增快的同时出现振幅明显减小且变化不规则，而中药Compound诱导组却能在基本保持振幅不变的基础上增加心肌收缩频率。当施加Lidocaine抑制两组细胞自发搏动后，标准诱导组的hiPS-CMs搏动消失检测不到信号，而中药Compound诱导组则在频率减慢、振幅减小的同时，尚能基本维持每次搏动振幅的同步改变，可见中药Compound诱导的hiPS-CMs在对药物反应的灵敏性和耐受性方面优于标准诱导组(图8)。

本发明进一步检测了hiPS-CMs的去极/复极时相，发现基线水平下，标准诱导组的去极和复极电压低于中药Compound诱导组，时相也比中药Compound诱导组短。经ISO激活后，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs去极化和复极时间明显缩短，而标准诱导的hiPS-CMs则表现出紊乱的去极和复极过程。在Lidocaine抑制hiPS-CMs的收缩性后，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs仍然可以发出微弱的电信号，维持基础电压差，但在标准诱导的hiPS-CMs中没有检测到去极/复极信号(图9)。

此外，本发明还对hiPS-CMs场电位和去极/复极的核心指标进行了量化统计。结果表明，在搏动周期上，基线条件下的两组细胞差别不大，但施加ISO干预后，中药Compound诱导的hiPS-CMs搏动周期明显缩短，施加Lidocaine则延长了中药Compound诱导组hiPS-CMs的搏动周期，而这种变化在标准诱导组并不明显，无论是出现激活还是抑制反应，均呈现不规则和紊乱的变化状态。在去极/复极时相量化中本发明发现，标准诱导组受ISO干预变化不显著，Lidocaine能完全打消标准诱导的hiPS-CMs正常去极化和复极化过程，而中药Compound优化诱导的hiPS-CMs能敏锐感知ISO的正向激活作用，显著缩短去极/复极时相，且在Lidocaine抑制电活动的环境下，仍能小幅延长去极/复极时相并保证电活动的基本稳定(图10)。

由此可见，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs具有较强的药物敏感性和耐受性，其电生理传导功能较标准诱导的hiPS-CMs更加成熟和稳定。

②标准和中药Compound优化诱导的hiPS-CMs细胞内钙瞬变信号对比

钙瞬变是hiPS-CMs自发搏动过程中产生收缩和舒张反应的基础，本发明用Fluo-4作为标记来追踪钙离子的瞬变情况(图11)。△F/F0代表标准化后的荧光强度改变比例，统计结果显示，在未受到额外刺激的情况下，基线水平的中药Compound优化诱导hiPS-CMs荧光强度变化幅值(△F/F0)明显大于标准诱导组。观测两组细胞基础条件下自发钙瞬变的频次，发现中药Compound优化诱导的hiPS-CMs与标准诱导组相比，中药Compound诱导组的自发钙瞬变频率显著增加(0.63±0.03vs.0.47±0.01，P<0.05，n＝6)。

③中药Compound优化诱导的hiPS-CMs线粒体结构功能成熟度优于标准诱导组

本发明用共聚焦显微镜对比观查了hiPS-CMs的线粒体结构，可见MTG标记的两组hiPS-CMs线粒体均紧密分布在细胞核周围，线粒体局部放大后发现，标准诱导的hiPS-CMs线粒体多呈短圆点和杆状，而中药Compound优化诱导的hiPS-CMs线粒体形态延展和连续性好，呈丝状、长线状和网状，线粒体结构分化得更加系统和完善(图12)。

为进一步研究两组hiPS-CMs线粒体结构差异带来对应功能上的差别，本发明用TMRE标记了线粒体膜电势，并用Rhod-2标记了线粒体钙，与MTG线粒体定标进行双染，用荧光显微镜拍照后进行荧光定量分析。结果发现，在不添加外源性刺激的基线水平，标准诱导组和中药Compound诱导组hiPS-CMs之间的线粒体膜电势水平相当，TMRE/MTG比值定量分析未见统计学差异(P＞0.05)。但中药Compound优化诱导的hiPS-CMs线粒体钙水平则显著低于标准诱导组(P＜0.05)，在定量分析中可见中药Compound诱导的hiPS-CMs线粒体钙积累有明显减少的趋势(图13)。

进而本发明把两组hiPS-CMs封片固定到玻璃培养皿中，用免疫荧光染色法观测细胞色素C的含量和释放情况。荧光定量分析发现，与标准诱导的hiPS-CMs相比，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs红色荧光强度更高，线粒体内有更多的细胞色素C积累(P<0.05)，但两组均未观察到细胞色素C从线粒体释放到细胞质中的现象(图14)。

讨论

心肌细胞的成熟包括结构成熟和功能成熟，结构成熟的标志是肌丝肌节的形成，功能成熟的特点则反映在心肌细胞的收缩性、兴奋性和传导性的完善程度。随着分化成熟度的增加，心肌细胞会逐步退出细胞循环而丧失增殖能力，这给本发明一个启示：iPS定向分化心肌细胞的优化诱导从心肌细胞成熟前的增殖期切入会有更大的拓展空间。本发明在上一章节的研究中将本团队自主研制的中药Compound在中胚层形成早期即进行持续8天的辅助诱导，成功建立了高分化率、高纯度和高稳定性的心肌细胞优化诱导方案。为探究中药Compound优化诱导与标准诱导的hiPS-CMs成熟度上的差异，本章节将两组分化15天的心肌细胞在电生理特性、亚细胞结构和功能三个维度进行了对比研究。

在电生理功能研究中，本发明选用了MEA标测技术对hiPS-CMs的收缩性、传导性和兴奋性进行了系统比较，同步记录了多个心肌细胞的整体电信号兴奋传导、兴奋起源、传播方向和传导速度等信息，并对单个心肌细胞进行了场电位信号描记和去极/复极化过程的定量分析，发现基线水平下，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs具有更强的搏动收缩振幅、更快的兴奋传导速度和更规则的自发搏动节律，中药Compound优化诱导和标准诱导的hiPS-CMs在基线水平施加肾上腺素(电兴奋剂)或利多卡因(电抑制剂)干预后，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs在整体电信号传递和单个细胞的场电位响应方面均比标准诱导的hiPS-CMs具有更强的敏感性、稳定性和耐受性，从整体和单个心肌细胞电生理特性的综合表现来看，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs具备更完善的细胞间电结构连接和更成熟的电生理功能。

Ca²⁺是心肌细胞中的重要离子，除了参与动作电位形成之外，其介导的兴奋-收缩耦联是心肌细胞收缩搏动的始动环节。心肌细胞膜去极化后，L型钙通道打开，使得胞内Ca²⁺快速释放和增加，Ca²⁺浓度瞬时升高形成的时空效应即为钙瞬变。钙瞬变检测到的荧光强度变化反映了心肌细胞收缩强度，荧光从峰值回落到基线的时间反映心肌细胞的舒张功能。中药Compound优化诱导的hiPS-CMs自主收缩强度优于标准诱导组，本发明考虑其胞内钙瞬变可能存在差异，进而本发明用激光扫描共聚焦显微镜对hiPS-CMs钙瞬变相关指标进行检测，以评价胞内钙循环状态。本发明发现，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs只需要释放少量的钙就可以在基础状态下完成一次强有力的自发收缩，且收缩频次高于标准诱导组，这从钙循环的角度部分解释了同等条件下，中药Compound优化诱导组的心肌细胞收缩性优于标准诱导组的原因。

心肌细胞要维持规律的收缩，除了要有稳定的电信号传递，还有赖于充足的能量供给。心肌细胞是全身细胞中线粒体最丰富的细胞群，线粒体氧化磷酸化产生的ATP有90％都用于保障心肌细胞持续收缩产生的能量消耗，此外还有报道显示，线粒体有一定的调节心肌分化和胚胎期心脏发育的作用。由此本发明考虑，既然中药Compound优化诱导的hiPS-CMs在收缩力上相对标准诱导组有明显优势，那么本发明添加的中药Compound除了促进电生理发育成熟，是否还通过促进hiPS-CMs线粒体成熟而起作用？进而本发明用免疫荧光染色法对hiPS-CMs的线粒体进行了结构和功能相关检测，结果发现，在中药Compound优化诱导的hiPS-CMs中，大部分的线粒体结构呈现线状、分枝状甚至是网状，线粒体基质较为紧密，而标准诱导组的hiPS-CMs线粒体则以点状和颗粒状居多。本发明知道，小鼠胚胎的线粒体在第9.5天是点状和小圆状不完整的，发育到第13.5天，线粒体才开始出现分枝、丝状和网状结构，可见中药Compound优化诱导的hiPS-CMs线粒体结构分化成熟过程与胚胎期线粒体的发育成熟过程更为相似。在功能层面，线粒体呼吸氧化过程中会将电化学势能储存于线粒体内膜，形成线粒体膜电位，线粒体膜电位是产生ATP的前提，膜电位越高，产生的能量也就越多，而心肌细胞损伤凋亡过程中一个重要的变化就是线粒体膜电位的崩塌。本发明对比了中药Compound优化诱导和标准诱导的hiPS-CMs胞内线粒体膜电势的大小，发现中药Compound优化诱导的hiPS-CMs线粒体膜电势稍高于标准诱导组，但定量统计未见显著性差异，说明二者在能量代谢的能力上差别不大，细胞状态很好，但可能中药Compound优化诱导组在线粒体膜能量储备上会稍有优势。此外，线粒体钙也是评价线粒体功能的一个关键要素，线粒体的钙离子输送量是衡量所产能量带动心脏跳动强度的重要指标。线粒体过度摄入钙，出现钙累积甚至钙超载，会促发细胞衰老和死亡，很多老年退行性病变就与细胞中线粒体钙超载相关。本发明对中药Compound优化诱导和标准诱导的hiPS-CMs线粒体钙进行定量分析发现，中药优化诱导的hiPS-CMs具备更少的钙累积，侧面说明其胞内钙的自稳态调节更优异，细胞衰老和损伤更少。相反的，若细胞存在损伤，损伤的线粒体片段化会导致线粒体细胞色素C释放到胞质中，引发细胞凋亡。通过对中药Compound优化诱导和标准诱导的hiPS-CMs线粒体细胞色素C进行检测，两组细胞均未见细胞色素C释放到胞质中，其中中药Compound优化诱导的hiPS-CMs线粒体细胞色素C富集更多，说明中药复合物的辅助诱导不仅可以减少有害物质的积累，还可以对防止细胞凋亡起到一定的保护作用。

总之，本发明通过添加自主研制的中药Compound成功构建的高分化率和高敏感性的hiPS-CMs，为药物代谢、毒性检测和新药研发提供了理想的体外实验模型，同时也是未来开展重大疑难性心脏疾病病因学研究的最优工具。此外，中药Compound优化诱导的hiPS-CMs稳定的电生理功能和成熟的超微结构，在体内移植治疗修复损伤心肌方面具有巨大的治疗潜力，可为慢性心脏疾病的临床防治提供全新的治疗思路与方法，有广阔的推广和应用前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京中医药大学

<120> 中药复合物、中药有效组分组合物、化合物及其应用

<130> 2020

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

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