阅读说明：本技术 一种针对脊柱损伤修复的纳米氢氧化镁区域性涂布聚乳酸-己内酯支架的制备及应用 (Preparation and application of nano magnesium hydroxide regional coating polylactic acid-caprolactone scaffold for repairing spinal injury ) 是由 关燕清 杨波 班晴 陈吾雅 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种针对脊柱损伤修复的纳米氢氧化镁区域性涂布聚乳酸-己内酯支架的制备及应用。本发明构建了一种Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架,在PCL-PLA材料管内部加载有纳米氢氧化镁。本发明通过用纳米氢氧化镁修饰聚乳酸-聚己内酯的方法构建一种新型的仿生骨组织工程支架。该支架具有良好的力学性能,并可以对骨细胞、神经细胞的良好促生长作用,提供了一种新的,无毒副作用的细胞修复方法,为脊柱损伤的治疗能够做出贡献,可以推动骨组织工程的进步与发展。(The invention discloses preparation and application of a nano magnesium hydroxide regional coating polylactic acid-caprolactone stent aiming at spinal injury repair. The invention constructs a Mg-PCL-PLA bionic bone tissue scaffold, and nano magnesium hydroxide is loaded in the PCL-PLA material tube. The invention constructs a novel bionic bone tissue engineering scaffold by a method of modifying polylactic acid-polycaprolactone by using nano magnesium hydroxide. The scaffold has good mechanical property, can play a role in promoting growth of bone cells and nerve cells, provides a new cell repair method without toxic and side effects, can contribute to treatment of spinal injury, and can promote progress and development of bone tissue engineering.)

一种针对脊柱损伤修复的纳米氢氧化镁区域性涂布聚乳酸- 己内酯支架的制备及应用

技术领域

本发明涉及仿生骨组织技术领域，更具体地，涉及一种针对脊柱损伤修复的纳米氢氧化镁区域性涂布聚乳酸-己内酯支架的制备及应用

背景技术

骨组织是人类重要的组成部分之一，各种骨组织疾病对广大患者造成了严重的生理及心理上的创伤：骨折是最常见的骨组织损伤，传统的骨损伤治疗方法由于治疗周期长，治疗过程痛苦等原因，对人们造成了极大的不便；此外，骨癌等重大疾病依然威胁着人类的身心健康。特别是脊柱损伤对广大患者造成了极大的生理及心理上的创伤。

骨组织疾病带来的危害，骨组织工程作为一种前沿的治疗骨组织相关疾病的方法越来越受到人们的重视，加速了骨组织工程的发展，在此大背景下，骨组织工程因具有治疗骨相关损伤或疾病的巨大潜力，而成为修复损伤器官的前沿方法，具有一定的潜力。通常而言，骨组织工程的研究包含三大元素：支架、细胞和生长因子，目前，仿生骨组织工程支架的研究是较为活跃的领域之一。

目前应用于组织工程的生物材料不论是天然的还是人工合成的均不能满足理想细胞外基质材料的要求，存在一定的缺陷，如体内降解速率过快或过慢、机械强度不足、生物相容性不佳、引起炎症等。如何扩大组织工程支架材料的来源，经济又方便地满足患者要求，已成为待解决的课题。

生物可降解高分子是当今材料科学领域的研究热点，聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)均为美国食品与药物管理局批准的可用于临床的聚酯类的可降解高分子聚合物，PCL-PLA材料具有良好的生物降解速率与生物相容性，有一定的机械强度。生物可降解聚合物纳米复合材料是近年来发展起来的一种新型复合材料，这种材料以生物可降解高分子聚合物为基础，再使用纳米材料对其修饰，可被广泛应用于多领域的研究中。纳米材料的渗入，进一步提高了复合材料的各项功能。

镁元素参与调节多种生命活动，在体内起到极其重要的作用，例如：镁离子作为一种内源性保护因子参与脑组织中重要的细胞代谢和功能调节，而且对神经细胞具有明显的保护作用；镁能参与机体内一些神经疾病的预防及治疗；镁元素能增强bMSCs向软骨分化，对患有炎症的骨组织起到补充软骨细胞的作用；一定浓度的镁离子(6～10mM)促进了成骨细胞的活力和分化。

镁资源丰富、价格低廉，是重量最轻的材料之一，密度与人骨密质骨密度(1.75g/cm³)相当，约为1.47g/cm³，其优势在于较高的比刚度和比强度，以及理想的可加工性和塑韧性。镁金属和镁合金的弹性模量约为4SGPa，与硬骨组织相接近，与骨组织具有合适的力学性能。此外，镁也是少数能在体内降解的金属之一。

基于镁与人体力学性能的匹配，上世纪40年代将镁合金作为植入材料应用于整形修复和外科手术中。但当时制造出的镁合金在人体生理环境中的腐蚀速率过快，并产生大量的氢气，对成骨、破骨等细胞产生负面影响，限制了镁合金作为骨植入材料的应用，因此被随后出现的不锈钢所取代。90年代起，随着人们对镁合金的不断深入研究，在控制合金的耐蚀性能和力学性能的技术方面得到很大的提高，同时通过表面处理进一步改善了镁合金的耐腐蚀性能及抗菌性，使镁合金及含镁材料有望重新广泛应用于医用植入材料。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种针对脊柱损伤修复的纳米氢氧化镁区域性涂布聚乳酸-己内酯支架的制备及应用。

首先使用化学沉淀法制备纳米氢氧化镁粒子，用纳米氢氧化镁粒子材料修饰聚乳酸-己内酯(PCL-PLA)材料，构建外部是PCL-PLA、内部为纳米氢氧化镁涂布层的新型Mg-PCL-PLA管状支架，进一步发现该支架促进bMSCs及PC12生长及分化的效应。

本发明的第一个目的是提供一种Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架。

本发明的第二个目的是提供一种Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架的制备方法。

本分明的第三个目的是提供所述制备方法制备得到的Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架。

本发明的第四个目的是提供所述所述Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架在制备恢复骨组织损伤、促进细胞生长、促进细胞活力、促进细胞增殖和/或促进细胞分化的组织替代物、药物筛选和/或病例模型研究中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明首先通过化学沉淀法制备纳米氢氧化镁；再将其涂布到聚乳酸-聚己内酯材料上，进行修饰；再通过物理方法制备出管状的Mg-PCL-PLA仿生骨组织工程支架。支架制备完毕后，对其进行多种手段的理化表征，包括热重分析、红外光谱检测、粒径分析、X射线衍射能谱(XRD)、等。证明了Mg-PCL-PLA仿生骨组织工程支架制备成功。

其后，进行生物学效应实验，首先进行体外实验，在支架的上接种骨髓间充质干细胞(bMSCs)并接枝生长因子，对支架促进干细胞增殖、分化的效果进行评价。接着，在支架的含镁区域接种已分化的鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12，PC12细胞在经神经生长因子诱导分化后，能具有神经细胞的特征，现广泛应用于神经生理及神经药理学的研究中)，并对支架促进神经细胞生长的效果进行评价，结果显示该仿生支架对在其上培养的bMSCs具有良好的促生长、分化作用，在其上培养的PC12也同样显示出生长有利性。

因此本发明要求保护一种Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架，在PCL-PLA材料管内部加载有纳米氢氧化镁。

优选地，纳米氢氧化镁的加载量为0.604～0.942g/cm²。

更优选地，纳米氢氧化镁的加载量为0.759g/cm²。

优选地，纳米氢氧化镁平均粒径为100～150nm。

更优选地，纳米氢氧化镁平均粒径为120nm。

进一步优选地，所述Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架为在PCL-PLA材料管内部加载有纳米氢氧化镁，加载量为0.759g/cm²，纳米氢氧化镁平均粒径为120nm。

一种Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架的制备方法，在PCL-PLA材料管内部涂布纳米氢氧化镁的。

优选地，纳米氢氧化镁的涂布量为0.6～1.2g/cm²。

优选地，纳米氢氧化镁通过化学沉淀法制备得到。

更优选地，纳米氢氧化镁的制备方法包括以下步骤：

S1.0.2～1.5mol/L MgCl₂溶液、PEG2000和80～90％乙醇混合，得到混合溶液，，其中MgCl₂溶液、PEG2000和85％乙醇的用量比为：15～50ml：1～1.5g：15～25ml；

S2.将S1中的混合溶液、25～28％氨水和90～95％的乙醇混合，搅拌，其体积比为30～75ml：10～20ml：5～15ml；

S3.离心，收集沉淀，洗涤沉淀，干燥。

优选地，步骤S1中，MgCl₂浓度为0.5mol/L。

优选地，步骤S1中，使得混合溶液中乙醇浓度为85％乙醇。

优选地，步骤S1中，MgCl₂溶液、PEG2000和85％乙醇的用量比为：20ml：1～1.5g：20ml。

优选地，步骤S2中，氨水为26％氨水。

优选地，步骤S2中，乙醇为95％乙醇。

优选地，步骤S2中，S1中的混合物、氨水和乙醇的体积比为40：15：10。

优选地，步骤S2中，所述搅拌为磁力搅拌。

优选地，步骤S2中，搅拌的条件为50～80℃下搅拌0.5～3h。

更优选地，步骤S2中，搅拌的条件为60℃下搅拌1.5h。

优选地，步骤S3中，所述洗涤沉淀为用水洗涤沉淀3次。

优选地，步骤S3中，所述干燥为真空干燥不少于24h。

进一步，最优选地，所述纳米氢氧化镁的制备方法包括以下步骤：

S1.0.5mol/L MgCl₂溶液、PEG2000和85％乙醇混合，得到混合溶液，，其中MgCl₂溶液、PEG2000和85％乙醇的用量比为：20ml：1～1.5g：20ml；

S2.将S1中的混合溶液、26％氨水和95％乙醇混合，搅拌，其体积比为40：15：10；

S3.离心，收集沉淀，洗涤沉淀3次，真空干燥24h。

任一所述制备方法制备得到的Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架。

任一所述Mg-PCL-PLA仿生骨组织支架在制备恢复骨组织损伤、促进细胞生长、促进细胞活力、促进细胞增殖和/或促进细胞分化的组织替代物、药物筛选和/或病例模型研究中的应用。

优选地，所述骨组织损伤为脊柱损伤。

优选地，所述细胞包括但不限于鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12、骨髓间充质干细胞bMSCs等各种细胞和细胞系。

优选地，细胞分化为bMSCs向成骨细胞分化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过用纳米氢氧化镁修饰聚乳酸-聚己内酯的方法构建一种新型的仿生骨组织工程支架。该支架具有良好的力学性能，并可以对骨细胞、神经细胞的良好促生长作用，提供了一种新的，无毒副作用的细胞修复方法，为脊柱损伤提供一种新的，无毒副作用的治疗方法，可以推动骨组织工程的进步与发展。

附图说明

图1为Mg-PCL-PLA支架制备及后续研究示意图。

图2为氧化镁纳米管的与透射电镜(TEM)实验。

图3为氧化镁纳米粒的选区电子衍射图谱。

图4为氢氧化镁纳米粒的粒径分析。

图5为支架的红外光谱。

图6为支架的热重分析。

图7为白光干涉实验构建支架3维图像。

图8为支架表面粗糙度计算。

图9为支架扫描电镜检测。

图10为单位体积支架上纳米镁的加载量。

图11为支架的拉伸与压缩实验。

图12为PC12接种支架6天后的DAPI染色结果图。

图13为培养6天后支架上PC12、bMSCs细胞计数结果。

图14为培养6天后PC12的增长率。

图15为免疫印迹方法检测BMP-2，β-actin蛋白的表达情况。

图16为支架上BMP-2，β-actin蛋白的表达量。

图17为SD大鼠脊柱损伤模型的建立。

图18为SD大鼠尾部X光检测。

图19为SD大鼠血常规检测。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1、细胞株

大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)、鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)由中山大学医学院动物中心提供，经本实验室传代培养。

2、主要试剂

MgCl₂·6H₂O；PEG2000；无水乙醇(分析纯)；超纯水；铬黑T；乙二胺四乙酸二纳；NaCl；NaOH；浓盐酸；氮气(N₂)；PBS溶液；75％酒精；氨水；聚乳酸聚己内酯支架材料(PCL-PLA)购自济南岱罡生物科技有限公司；I型胶原纤维(ColⅠ)、胰酶、低糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；24孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。

3、仪器

德国LEO公司场发射扫描电镜:LEO 1530VP,Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO₂培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

4、统计学分析

本实验采用spss19.0统计软件进行方差分析，分析函数为LSD和Duncan，P<0.05表示差异显著。

实施例1纳米氢氧化镁的合成及表征

一、实验方法

通过化学沉淀法制备纳米氢氧化镁，利用化学沉淀法构建纳米氢氧化镁材料，并将其涂布于PCL-PLA支架材料的一面，并将该涂布面作为支架内表面卷曲与支架内部，构建成管状Mg-PCL-PLA支架材料。冷冻保存，进行后续实验，流程见图1。

具体操作方法为：

(1)用MgCl₂·6H₂O配成0.5mol/L的溶液；

(2)将20ml的0.5mol/L MgCl₂溶液、1～1.5g PEG2000、85％乙醇20ml进行混合处理，得到混合物；

(3)向混合物中分别加入26％氨水15ml和95％乙醇10ml，在60℃下磁力搅拌1.5h；

(5)将搅拌充分的液体进行离心水洗(重复3次)，离心水洗后，真空干燥24h，收集所得粉末备用。

透射电镜检测纳米氢氧化镁，具体操作方法为：

将纳米氢氧化镁样品固定于样品台上，置于透射电镜样品室，将样品室抽真空，进行观测。

二、实验结果

纳米氢氧化镁粒子透射电镜实验的结果如图2所示，本方法所制备的纳米氢氧化镁成球形结构，透射电镜下，纳米氢氧化镁粒子分散、质地均匀，平均粒径约为120nm。粒子电子密度低，呈半透明状，也有少数呈现出不规则的球形。

纳米氢氧化镁粒子的SEAD检测实验的结果如图3所示，电子束经过粒子晶体后，其衍射图样为正六边形。这一结果表明，本方法所制备得到的晶体为单晶，晶型为正六面体。

纳米氢氧化镁粒径分析实验的结果如图3所示，纳米氢氧化镁粒子的平均粒径主要集中在100～150nm之间，此结果与TEM结果相吻合。

实施例2纳米氢氧化镁对PCL-PLA材料的修饰及表征

一、实验方法

(1)纳米氢氧化镁对PCL-PLA材料的修饰

PCL-PLA基础支架的准备：将支架裁剪成1cm×1cm大小的正方形备用。

纳米氢氧化镁的区域性涂布，取少量实施例1制备的纳米氢氧化镁；将粘稠状纳米氢氧化镁沉淀涂布在正方形的PCL-PLA支架上；用物理方法将已经涂布了纳米氢氧化镁的正方形支架以及未涂布纳米氢氧化镁的空白支架制备成管状结构，使Mg-PCL-PLA管状支架内部含纳米氢氧化镁而外部不含镁材料，纳米氢氧化镁涂布量约为0.7～0.8g/cm²。

(1)红外光谱

将各试样和KBr在干燥机中进行干燥处理，将1～2mg试样与200mg纯KBr混合并研磨均匀，并将混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响。将混合物置于模具中，在油压机上用5-10MPa压力将混合物压成透明薄片，上机待定；同时，将空白支架与经过修饰的支架进行干燥处理，上机测定。

(2)白光干涉

支架制备完毕后，通过扫描白光干涉仪(BMT EXPERT,German)对其表面形貌进行检测和分析。

(3)扫描电镜

将空白支架及修饰后的支架进行自然风干，将风干后的支架样品黏贴固定于样品台上并做喷金处理，将样品置于扫描电镜样品室内，将样品室抽成真空，进行扫描电镜观察。

(4)纳米氢氧化镁加载量分析

将使用酸碱滴定法来检测支架中纳米氢氧化镁的加载量。将待检测的Mg-PCL-PLA支架与适量蒸馏水(浸没支架)置于烧杯中，高温加热、搅拌使支架完全溶解。用标准的HCl与NAOH溶液调节待测溶液pH≈10。加入1～2滴标准铬黑T溶液作为指示剂(制备铬黑T标准溶液时，铬黑T先与氯化钠以1:100的比例充分混合、研磨充分)，此时待测溶液呈***。随后，用0.02mol/L乙二胺四乙酸二纳溶液滴定待测溶液，当溶液由***变为蓝色且一定时间内颜色不褪去时，停止滴定，记录乙二胺四乙酸二纳溶液消耗的量。根据乙二胺四乙酸二钠消耗的量计算出单位支架中纳米氢氧化镁的加载量。

(5)力学检测

我们分别采用国家质量检验标准GB/T 18258-2000和GBT 531.1-2008的方法对支架进行拉伸实验和压缩实验。

(6)Mg-PCL-PLA支架的热重分析

通过热重分析仪(TGA,TG209F1，NETZSCH，Germany)对Mg-PCL-PLA支架的热稳定性进行检测和分析。检测温度范围为25℃～800℃。

二、实验结果

(1)红外光谱

为进一步了解支架修饰的结果，采用红外光谱实验对支架进行表征。Mg-PCL-PLA新型仿生支架与空白PCL-PLA支架的红外光谱图如图5所示，经纳米氢氧化镁修饰后的PCL-PLA支架在3679.19cm^-1、2856.18cm^-1处较空白的PCL-PLA支架出现了两个明显的吸收峰。这两个吸收峰与Mg(OH)₂的特征峰极为相似。因此，认为纳米氢氧化镁已成功修饰在了PCL-PLA支架上，Mg-PCL-PLA新型仿生骨组织工程支架构建成功。

(2)热重分析

Mg-PCL-PLA仿生支架与空白PCL-PLA的热重分析实验的结果图如图6所示，Mg-PCL-PLA新型仿生骨组织工程支架和空白支架的热重分析结果并没有太大的差别。由此我们可以认为Mg-PCL-PLA仿生骨组织工程支架的稳定性并没有在修饰过程中被改变。Mg-PCL-PLA仿生骨组织工程支架在25～38℃的热稳定性较好，新型支架的质量及性质不会因机体内温度的影响而发生较为明显的变化，支架可以稳定植入机体内。

(3)白光干涉

通过白光干涉实验表征了纳米氢氧化镁修饰对PCL-PLA本体支架表面形貌的影响。如图7数据所示，PCL-PLA支架本体表面形貌较为复杂，支架具有明显的孔洞结构，且具有明显的塌陷(黑色)。支架本体厚度约为1μm，而表面具有很明显的突起，这使得支架整体粗糙度较大，平均Ra值约为90nm，而平均Ry值约为1.5μm。其后，纳米氢氧化镁对支架的修饰引起了支架形貌明显的变化，我们可以理解为该修饰：1.填补了支架的空洞；2.抬高了支架表面；以及3.增加了支架整体厚度。从实验结果来看，整体支架变得平整，表面颜色区别不大(白色)；整体厚度增加至2.5μm以上；而Ra和Ry值分别降低至～10nm和～0.5μm(见图8)。对比于PCL-PLA空白支架，上述数值在统计学上具有显著性差异，修饰效果明显。

(4)扫描电镜

为了进一步确定支架材料修饰后的细微结构变化，采用扫描电镜对支架进行表征，其结果与白光干涉实验中微米级或毫米级的观测数据相符，证明纳米氢氧化镁颗粒能填补PCL-PLA支架的空洞、抬高支架的表面并增加了支架的厚度，同时，该纳米材料也能使支架表面变得更为平整。

如图9所示，空白PCL-PLA支架为单层薄片结构，片层表面光滑，层厚度为200nm，同时，它具有非常明显的孔洞，孔径大小不均一。修饰了纳米氢氧化镁后，上述薄层的厚度明显增加，空洞数量明显减少。并且，纳米氢氧化镁在片层原本平滑的表面上形成了颗粒状的突起，粒径与之前的粒径检测数据相符，约为100nm。

这些结果表明，氢氧化镁纳米管确实可对PCL-PLA支架进行修饰，且修饰过程明显引起了支架形貌的变化，弥补了支架的缺陷，并可能为后续细胞的培养和生长提供更为理想的支架微环境。

(5)纳米氢氧化镁加载量分析

为确定每单位体积支架上加载的纳米氢氧化镁的总量，采用酸碱滴定实验的方法来进行测量，酸碱滴定实验结果如图10所示，每平方厘米Mg-PCL-PLA支架上纳米氢氧化镁的加载量为0.759g。支架上修饰加载的纳米氢氧化镁的量达到了能激发成骨细胞活力，促进成骨细胞生长分化的标准。

(6)力学检测

为了检测支架的力学性能，对支架进行拉伸和压缩实验。支架的拉伸实验显示，Mg-PCL-PLA承受拉力的能力相比PCL-PLA有所下降(图11a)。支架的压缩实验显示，在一定的压缩应变范围内，Mg-PCL-PLA载荷(压缩应力)要高于PCL-PLA，Mg-PCL-PLA的硬度有所提升(图11b)，Mg-PCL-PLA载荷的最大值为6.50911N。Mg-PCL-PLA新型仿生骨组织工程支架具有良好的应力承力性能，能稳定应用于承力部位的骨组织损伤的修复治疗。

实施例3 Mg-PCL-PLA支架对PC12及bMSCs的生物学效应

一、细胞培养

PC12、bMSCs由中山大学医学院动物中心提供。在24孔细胞培养板中分别放入实施例2制备的PCL-PLA支架与Mg-PCL-PLA支架。此外，设置一种没有支架的对照组。细胞在培养瓶中融合培养至80％后，以1.75×10⁴/孔的密度接种至24孔板上，培养2、4、6天，以进行后续实验。其它细胞培养条件为：含10％新生牛血清的低糖DMEM培养基，37℃，5.0％CO₂。

二、PC12的DAPI染色

1、实验方法

24孔板中的细胞培养后，用PBS溶液摇床清洗两种支架及空白对照3次，每次5min。随后，我们采用4％多聚甲醛固定细胞30min。PBS清洗后，用0.2％Triton X-100透化细胞20min；PBS再次清洗后，DAPI染液孵育5min，PBS清洗，镜检。

2、实验结果

待PC12细胞密度长到90％时，将培养瓶中的细胞分别接种到Mg-PCL-PLA新型仿生骨组织工程支架与空白PCL-PLA支架上，同时设置没有接种支架的对照组，培养6天后，用DAPI染色对支架上的细胞进行DAPI染色观察，其结果如图12所示，两种支架以及空白对照上都生长有细胞，其中，相比于空白对照组及PCL-PLA支架，Mg-PCL-PLA支架上细胞生长更密集，细胞核形态更良好，Mg-PCL-PLA支架对细胞的生长促进作用要更明显。

从DAPI染色的结果可知，PCL-PLA支架以及Mg-PCL-PLA支架确实有促进PC12细胞生长的作用，其中，Mg-PCL-PLA促进细胞生长的效果最好。

对接种在支架上的细胞进行细胞计数，结果如图13所示，在Mg-PCL-PLA支架上培养6天后，单位支架面积PC12细胞数已达6.35×10⁴个。同时，接种在支架上的bMSCs也同样显示出生长有利性，在该支架上培养6天后，单位面积bMSCs细胞数已达6.95×10⁴个。

三、MTT法检测细胞增殖

1、实验方法

在支架上接种细胞并培养48h，提前4h加入20μl MTT。继续培养细胞4h，吸取废液，用PBS清洗支架两遍，加入100μl DMSO，处理10min，使用酶标仪检测吸光度。

2、实验结果

为了检测各支架上PC12细胞生长状况，在培养细胞2天后，通过MTT实验分析细胞的存活率，结果如图14所示，PCL-PLA支架及Mg-PCL-PLA支架上细胞的增长倍数均大于空白对照组。Mg-PCL-PLA支架上细胞增长接近3倍，Mg-PCL-PLA支架上培养的细胞显示出更高的细胞活力和增殖能力。

四、免疫印迹(Western Blot)检测bMSCs向成骨细胞分化

1、实验方法

收获各支架处理不同时间后的bMSCs，加入等量的提取缓冲液(125mM Tris·Cl，pH6.8，2％SDS，4M尿素，20％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于碎冰上超声波破碎细胞。破碎后4℃，12000r/min离心10min，取上清液，即蛋白悬液，-20℃低温保存。

绘制考马斯亮蓝标准曲线，然后将蛋白抽提悬液进行蛋白定量，以浓度最低管为基准确定蛋白上样量，加入等体积的2×SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液(100mM Tris·Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，2％β-巯基乙醇)混合，100℃变性10min，吹打均匀后取适当体积的样品进行SDS-PAGE不连续电泳分离。3％浓缩胶恒压80V电泳30min，10％分离胶恒流120V电泳约70min，取其中一块凝胶用于转膜，另一块凝胶用考马斯亮蓝R-250染色1h，脱色后可见光下观察并照相。

不同蛋白经10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，以300mA恒流电转移1h到硝酸纤维素(NC)膜上；将转移后的凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，观察转膜效果；封闭液(3％牛血清蛋白)中4℃浸泡过夜，然后与一抗(1：500)室温中反应2h，用TBS(20mmol/L Tris·Cl，150mmol/L NaCl，pH8.0)洗膜3次，每次10min。与碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG酶标抗体(anti-IgG AP conjugate,1:10000)室温中反应2h，然后用TBS洗膜4次，每次5min，最后用NBT/BCIP进行显色，染色至条带呈现，即用200μL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)和50ml PBS终止染色。该膜上若无显色带为阴性，有显色带则为阳性。

2、实验结果

为评价支架促进bMSCs向成骨细胞分化的效果，进行了Western blotting实验，相关蛋白表达情况如图15所示，Mg-PCL-PLA支架上细胞表达的BMP-2以β-actin蛋白的量要明显多于空白对照实验组以及PCL-PLA支架实验组。这一结果显示，bMSCs在Mg-PCL-PLA支架上已开始向成骨细胞分化且分化速度较快。

对支架上细胞表达的相关蛋白进行定量分析，分析结果如图16，Mg-PCL-PLA支架上BMP-2蛋白表达水平明显提高且表达量约为对照组的2倍。同时，β-actin蛋白也在支架上呈现高表达。

实施例4 Mg-PCL-PLA支架对SD大鼠脊柱损伤修复效应

一、实验方法

1、SD大鼠培养及鼠脊柱损伤模型的建立

四周龄SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供。在标准SPF级饲养条件下饲养至八周龄，而后进行手术造模。

SD大鼠术前禁食12h，进行体重称量，并以2％戊巴比妥钠液2ml/kg麻醉大鼠。在标准无菌操作手术台对已麻醉的SD大鼠进行手术。用75％酒精对大鼠尾部进行消毒后，用手术器械暴露大鼠尾椎骨并制造大小约为1cm×2mm×0.5cm的伤口，随后用75％的酒精消毒并进行缝合，建立损伤模型。

2、支架的植入

两种支架材料：PCL-PLA、Mg-PCL-PLA制备成2.2.3所述管状后，植入到大鼠尾椎的损伤部位，并设置一空白对照组(进行手术但不植入支架)。术后培养28天后，进行后续实验。

3、SD大鼠X光检测及血液分析

术后培养28天后，对大鼠尾部进行X光(uDR 580I,United Imaging,China)检测。收集SD大鼠术后12h的血液样本，将样品送至武汉塞维尔生物进行血常规检测。

二、实验结果

如图17所示，损伤模型建立之后，SD大鼠尾部活动的活跃程度较造模前降低。

支架的植入术后SD大鼠28D后，对其尾部进行X光检测，结果见图18。结果显示，对照组、PCL-PLA组SD大鼠尾椎骨相比Mg-PCL-PLA组，骨组织出现肿大，骨周围出现一定的重影，这是由于手术或损伤引起的尾部炎症及免疫反应造成的，后续血液检测的结果也与此特征相符合。此外，从对照组(无支架植入)结果显示，大鼠尾椎骨出现一定的畸形，损伤处尾椎骨相比正常骨有一定的弯曲，同时，该对照组大鼠尾部缝合处损伤愈合较慢，且在X光结果中出现一个缺口。Mg-PCL-PLA组的尾椎骨经术后28D恢复后，已与正常尾椎骨无异，且没有引发该处的炎症或急性的免疫反应，Mg-PCL-PLA的无毒副作用得到体现。综上，Mg-PCL-PLA支架对SD大鼠尾部脊柱损伤的促进愈合效果要优于PCL-PLA支架及无支架组。

在SD大鼠手术12h后，收集三组大鼠血液，进行血常规检测，结果显示(见图19)，对组及PCL-PLA组大鼠在手术12h后，其血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞含量均高于Mg-PCL-PLA组。这表明，前两组大鼠在术后12h内，尾椎损伤处出现炎症及其后续出现的免疫反应，这都不利于损伤尾椎的快速修复。而Mg-PCL-PLA组血液中各细胞水平稳定，说明该组大鼠尾椎损伤处没有引起炎症等现象，证明了Mg-PCL-PLA仿生支架无毒副作用的特性。

综上所述，Mg-PCL-PLA新型仿生骨组织工程支架显示出良好的修复骨组织损伤的效果，为脊柱损伤提供一种新的，无毒副作用的治疗方法。