阅读说明：本技术 一种1，8-萘酰亚胺衍生物及其应用 (1, 8-naphthalimide derivative and application thereof ) 是由 曾淑兰 张国海 彭艳 潘成学 李平平 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种1,8-萘酰亚胺衍生物及其应用。该衍生物对非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、人膀胱癌细胞T24以及人乳腺癌细胞MCF-7的具有显著的抑制活性,其中对非小细胞肺癌细胞株NCI-H460的抑制活性显著优于氨萘非特,且其对人正常细胞WI-38的毒副作用较氨萘非特更小,有望开发成靶向治疗药物。本发明所述1,8-萘酰亚胺衍生物的结构如下式(I)所示：<Image he="600" wi="516" file="DDA0002211332700000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses a 1, 8-naphthalimide derivative and application thereof. The derivative has obvious inhibition activity on non-small cell lung cancer cell strains NCI-H460, human bladder cancer cell T24 and human breast cancer cell MCF-7, wherein the inhibition activity on the non-small cell lung cancer cell strains NCI-H460 is obviously better than amonafide, and the toxic and side effect on human normal cells WI-38 is smaller than that of the amonafide, so that the derivative is expected to be developed into a targeted therapeutic medicament. The structure of the 1, 8-naphthalimide derivative is shown as the following formula (I):)

一种1，8-萘酰亚胺衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及一种1，8-萘酰亚胺衍生物及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

萘酰亚胺类衍生物具有独特的平面刚性结构，使其拥有较强的嵌入DNA的能力，越来越多的研究显示萘二甲酰亚胺及其衍生物具有很好的抗肿瘤活性，其对DNA分子具有较高的亲和力，能通过***作用与DNA结合。

已有的研究表明，1,8-萘酰亚胺衍生物具有重要的抗肿瘤活性，其衍生物氨萘菲特(amonafide)和米托萘胺(mitonafide)已进入II期临床试验阶段，但由于二者表现出较大的毒副作用，使得它们的应有受到了严重限制。因此，我们期望合成得到既具有显著生物活性、毒副作用更小的新型萘酰亚胺类化合物。目前尚未见有在1,8-萘酰亚胺荧光团的缺电子4位上引入芳基硫化物的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种活性更好且活性更低的1，8-萘酰亚胺衍生物及其应用。

本发明涉及具有下述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

上述式(I)所示化合物的化学名称为N-(2-N，N-二甲氨基)乙胺基-6-(4-氟苯亚磺酰基)-1,8-萘二甲酰亚胺，分子量为：410.46。

上述式(I)所示化合物的制备方法主要包括以下步骤：取如下式(II)所示化合物和N,N-二甲基乙二胺置于有机溶剂中反应，反应结束后回收溶剂，即得目标化合物粗品；

本发明所述制备方法中，所述的有机溶剂具体可以是选自乙醇、甲醇、二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和石油醚(PE)中的一种或两种以上的组合。当有机溶剂的选择为上述两种以上物质的组合时，它们的配比可以为任意配比。所述有机溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，以1mmol的式(II)所示化合物为基准计算，所有参加反应的原料共用5-10mL的有机溶剂来溶解。

本发明所述制备方法中，所述的反应可以在不加热或加热条件下进行，优选在不加热条件下进行。反应是否完全可以通过TLC跟踪检测。

本发明所述制备方法中，式(II)所示化合物和N,N-二甲基乙二胺的用量比为化学计量比，在实际的实验操作中，通常取式(II)所示化合物和N,N-二甲基乙二胺的物质的量之比为：1：1.5-3。

本发明所述制备方法制得的是式(I)所示化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高式(I)所示化合物的纯度。通常采用硅胶柱层析来进行纯化，具体是将制得的目标化合物粗品经硅胶柱层析，用由体积比为5-20：1的乙酸乙酯(EA)和甲醇组成的洗脱剂洗脱，洗脱液蒸除溶剂，得到纯化后的目标化合物。

本发明所述制备方法中涉及的原料式(II)所示化合物化学名称为6-(4-氟苯亚磺酰基)-1,8-萘二甲酰亚胺，可参考现有文献合成，也可自行设计路线合成。优选按以下方法进行制备：

1)取4-氯-1,8-萘二甲酸酐和对氟苯硫酚置于第一溶剂中，在体系呈碱性条件下于加热条件下反应，回收溶剂，所得反应物进行酸化，有沉淀析出，收集沉淀，得到化合物2；

2)取化合物2和间氯过氧苯甲酸(m-CBPA)置于第二溶剂中，于不加热条件下反应，反应物用饱和NaHCO3溶液洗涤后，用萃取剂萃取，收集有机相，回收溶剂，得到化合物3即式(II)所示化合物。

上述式(II)所示化合物制备方法的步骤1)中，所述的第一溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺；通过向体系中加入弱碱性物质(如碳酸氢钠或碳酸钠等)调节体系呈碱性，以有利于反应的进行；反应通常在40℃至第一溶剂的回流温度下进行，反应还优选在搅拌条件下进行，通过TLC跟踪检测反应是否完全；反应完成后，采用酸液(通常为稀盐酸溶液，如5v/v％盐酸溶液)中各体系中的碱性，使体系维持在pH值为7左右。该步骤所得的产物可经过进一步纯化(如重结晶，重结晶的溶剂可以是乙醇等常用溶剂)后再用于后序操作。

上述式(II)所示化合物制备方法的步骤2)中，所述的第二溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺；反应通常在常温下进行，通过TLC跟踪检测反应是否完全；反应完成后，最好是采用饱和NaHCO3溶液洗涤除去体系中可能存在的酸；所述的萃取剂优选为二氯甲烷。该步骤所得产物为式(II)所示化合物的粗品，优选是将其经硅胶柱层析纯化(先用由乙酸乙酯和石油醚按1：2-50的体积比组成的混合溶剂洗脱，再用由二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇按9:3:1的体积比组成的混合溶剂洗脱，收集二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇组成的混合溶剂洗脱下来的洗脱液)后再用于后序操作。

上述式(II)所示化合物制备方法各步骤中涉及的各种反应，原料的摩尔比为化学计量比。

本发明还包括上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备抑制人肺癌细胞、膀胱癌细胞或乳腺癌细胞药物中的应用。

本发明还提供一种药物组合物，该药物含有治疗上有效剂量的上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明提供了一种结构新颖的1，8-萘酰亚胺衍生物，申请人的体外试验表明，该衍生物具有显著生物活性，特别是对非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、人膀胱癌细胞T24以及人乳腺癌细胞MCF-7均具有极为显著的抑制活性，而且对人正常细胞WI-38的毒副作用较氨萘非特更小，有望开发成靶向治疗药物。

附图说明

图1为式(I)所示化合物(即空白组)作为荧光探针在激发波长405nm，发射波长498nm的荧光光谱谱图；

图2为式(I)所示化合物与GSSG结合(即实验2组)作为荧光探针在激发波长405nm，发射波长498nm的荧光光谱谱图；

图3为式(I)所示化合物与GSH结合(即实验1组)作为荧光探针在激发波长405nm，发射波长498nm的荧光光谱谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：式(II)所示化合物的制备

按下述合成路线制备式(II)所示化合物：

具体的制备方法包括以下步骤：

1)在电磁搅拌下依次向250mL的圆底烧瓶中加入4-氯-1,8-萘二甲酸酐(2.32g,10mmol)、DMF(30mL,28.35g)、NaHCO₃(0.84g)和对氟苯硫酚(1.59mL,15mmol),加热回流反应10h(TLC监测反应,展开剂：V_EA:V_PE＝1:4)。冷却,减压除去溶剂,用5％的HCl溶液酸化,得到黄色沉淀,过滤,用乙醇重结晶得到1.62g化合物2,产率69.8％；

2)在电磁搅拌下向盛有DCM(10mL)溶剂的圆底烧瓶中依次加入化合物2(0.30g,0.93mmol)与1.5当量的m-CBPA(纯度85％,0.28g,1.40mmol)常温反应5h(TLC监测反应,展开剂:V_EA:V_PE＝1:2),用饱和NaHCO₃溶液洗涤(4×15mL),二氯甲烷(DCM)萃取,收集有机相，干燥,过滤,减压除去溶剂,用硅胶柱层析纯化(先用由乙酸乙酯和石油醚按1：50的体积比组成的混合溶剂洗脱，再用由二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇按9:3:1的体积比组成的混合溶剂洗脱，收集二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇组成的混合溶剂洗脱下来的洗脱液),得到0.81g化合物3(淡黄色固体)即式(II)所示化合物。

对本实施例所得化合物3进行核磁共振氢谱和核磁共振碳谱分析，数据分别如下所示：

1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.80(d,J＝7.7Hz,1H),8.68(d,J＝7.3Hz,1H),8.59(dd,J＝11.4,8.5Hz,2H),7.89(t,J＝8.4Hz,1H),7.72(dd,J＝8.7,5.0Hz,2H),7.15(t,J＝8.4Hz,2H).

13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.8(d,J＝228.1Hz),159.6,159.5,149.7,139.2(d,J＝3.1Hz),133.4(d,J＝121.4Hz),130.5,129.5,128.7,128.1,128.0,127.7,124.1,120.6(d,J＝190.7Hz),117.4,117.3.

因此，可确定上述淡黄色固体的结构如下述式(II)所示：

由此，确定其为式(II)所示化合物，化学名称为6-(4-氟苯亚磺酰基)-1,8-萘二甲酰亚胺。

实施例2：式(I)所示化合物的制备

在电磁搅拌下向盛有乙醇(20mL)的圆底烧瓶中依次加入式(II)所示化合物(0.27g,0.59mmol，按实施例1所述方法制得)和N,N-二甲基乙二胺(0.12mL,0.71mmol)，常温反应2h(TLC监测反应,展开剂:V_EA:V_MeOH＝4:1),减压除去溶剂,上硅胶柱层析(洗脱剂:V_EA:V_MeOH＝10:1),得到0.21g淡黄色固体，产率77.8％。

对本实施例所得淡黄色固体进行核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和电喷雾质谱分析，数据分别如下所示：

¹H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.75(d,J＝7.7Hz,1H),8.62(d,J＝7.3Hz,1H),8.48(dd,J＝8.0,4.5Hz,2H),7.80(t,J＝7.6Hz,1H),7.69(dd,J＝8.7,5.0Hz,2H),7.12(t,J＝8.4Hz,2H),4.31(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(t,J＝6.8Hz,2H),2.33(s,6H).

¹³C NMR(125MHz,CDCl3)δ:165.5,163.5,163.3,147.5,139.7(d,J＝3.2Hz),131.2(d,J＝125.0Hz),128.6,128.1(d,J＝17.3Hz),127.9(d,J＝9.1Hz),127.5,125.2,123.8,123.6,117.2,117.0,56.9,53.3,45.7,38.3.

电喷雾质谱：ESI-MS m/z:411.1173[M+H]+.

因此，可确定上述淡黄色固体即为目标产物N-(2-N，N-二甲氨基)乙胺基-6-(4-氟苯亚磺酰基)-1,8-萘二甲酰亚胺，其化学结构式如下式(I)所示：

实验例1：式(I)所示化合物的荧光测定

本实验使用荧光分光光度计检测式(I)所示化合物作为荧光探针在激发波长405nm，发射波长498nm的荧光强度以及式(I)所示化合物作为荧光探针分别与GSH(还原型谷胱甘肽)、GSSG(氧化型谷胱甘肽)孵育后在同等条件下的的荧光强度。

实验分组情况为：

实验组，包括2个小组，具体如下：

实验1组：即式(I)所示化合物+GSH，以式(I)所示化合物终浓度为5μmol/L，终浓度为10μmol/L，共孵育1h。

实验2组：即式(I)所示化合物+GSSG，以式(I)所示化合物终浓度为5μmol/L，GSSG终浓度为10μmol/L，共孵育1h。

空白组：即CON组，以式(I)所示化合物终浓度为5μmol/L。

实验结果：式(I)所示化合物本身显示微弱荧光，与还原型谷胱甘肽反应后，荧光强度可增加40％，与氧化型谷胱甘肽反应后无明显变化。

各组测定结果如图1-3所示，其中图1为式(I)所示化合物的荧光光谱谱图，图2为实验2组(即式(I)所示化合物+GSSG)的荧光光谱谱图，图3为实验1组(即式(I)所示化合物+GSH)的荧光光谱谱图。

为了充分说明本发明所述目标化合物(即式(I)所示化合物，N-(2-N，N-二甲氨基)乙胺基-6-(4-氟苯亚磺酰基)-1,8-萘二甲酰亚胺)在制药中的用途，申请人对其进行了体外抗肿瘤活性实验。

1、细胞株与细胞培养

本实验选用人肺癌细胞HCC-827、H1299、NCI-H460、A549，人胃癌细胞MGC-803、人膀胱癌细胞T24、人卵巢癌细胞SKOV3、人肝癌细胞株Hep G2、人乳腺癌细胞MCF-7以及人正常细胞WI-38、LO2共11种细胞株。

HCC-827、H1299、NCI-H460、A549、人正常细胞LO2等肿瘤细胞株均培养在含10wt％小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养；人胃癌细胞MGC-803、人膀胱癌细胞T24、人卵巢癌细胞SKOV3、人肝癌细胞株Hep G2、人乳腺癌细胞MCF-7以及人正常细胞WI-38细胞株则培养在含10wt％小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养液内。

2、待测化合物的配制

所用的目标化合物为按本发明实施例4制得，纯度≥99％,将其DMSO储液(浓度为0.001mol/L)通过培养基依次稀释成五个浓度梯度，分别为20、10、5、2.5、1.25μmol/L，其中助溶剂DMSO终浓度≤1％。首先测试20μmol/L的目标产物对于肿瘤细胞增殖的抑制率，视为初筛结果；再分别测试不同梯度浓度下目标产物对各种肿瘤细胞的增殖抑制程度，用以拟合计算半数抑制浓度，即IC50值。

3、细胞生长抑制实验(MTT法)

(1)取对数生长期的细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔180μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

(2)5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物20μL，每个浓度梯度设5个复孔；

(3)5％CO2，37℃孵育48h，倒置显微镜下观察；

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h；

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为630nm测定各孔的光密度值；

(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。

(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

利用公式：

计算化合物对细胞生长的抑制率，进一步通过SPSS软件对五个浓度梯度的抑制率数据进行拟合，求出化合物对不同细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀值，单位μmol/L)，化合物对于不同肺细胞株的IC₅₀值如表1所示，对胃癌、肝癌、乳腺癌等其他肿瘤细胞株和人正常细胞株的IC₅₀值如表2所示。

表1：本发明所述化合物对肺癌细胞株及其肺正常细胞株的IC50值(μM)

表2：本发明所述化合物所述对其他肿瘤细胞株及其正常肝细胞株的IC50值(μM)

注：“-”表示未检测。

从体外抗肿瘤活性测试结果来看，本发明所述目标化合物对肿瘤细胞株具有较为显著的抑制作用，特别是对非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、人膀胱癌细胞T24以及人乳腺癌细胞MCF-7的选择抑制作用更为明显，其中对非小细胞肺癌细胞株NCI-H460的抑制活性显著供优于氨萘非特，且其对人正常细胞WI-38的毒副作用较氨萘非特更小，有望开发成靶向治疗药物。

综上所述，本发明所述的1,8-萘酰亚胺衍生物总体表现出了较好的体外抗肿瘤活性，同时对其进行荧光测定结果也显示该衍生物呈现良好的GSH指示作用，故有希望开发为抗肿瘤药物或指示剂。