一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针及其制备方法和应用

文档序号：1793118 发布日期：2021-11-05 浏览：20次 >En<

阅读说明：本技术 一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针及其制备方法和应用 (Two-photon fluorescent probe with response to formaldehyde positioned by endoplasmic reticulum as well as preparation method and application of two-photon fluorescent probe ) 是由强涛涛王宝帅高晓阳胡伟梁天宇于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针及其制备方法和应用,属于分析化学技术领域。所述内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针的结构式如下：其制备工艺简单,产物收率高。本发明的内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针能够实现内质网定位及甲醛响应,进而达到研究甲醛对内质网应激的目的。因此本发明解决了特定细胞器靶向性差和生物样品损伤大的问题,能够应用于检测内质网甲醛含量。(The invention discloses a two-photon fluorescent probe with an endoplasmic reticulum positioned formaldehyde response and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of analytical chemistry. The structural formula of the two-photon fluorescent probe responding to the endoplasmic reticulum positioning formaldehyde is as follows: the preparation process is simple and the product yield is high. The two-photon fluorescent probe for endoplasmic reticulum positioning formaldehyde response can realize endoplasmic reticulum positioning and formaldehyde response, and further achieve the purpose of researching the stress of formaldehyde on endoplasmic reticulum. The present invention thus addresses the problem of poor targeting of particular organelles and biological samplesThe method has the problem of large damage, and can be applied to detecting the content of the endoplasmic reticulum formaldehyde.)

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

皮革制品包括真皮和人造皮革，现如今已经广泛应用于生活的方方面面，包括服饰，家具以及部分护具等。然而，皮革中残留物如甲醛(FA)等却严重影响人类的生活健康。

有研究证明，人体可通过呼吸作用将强挥发性的甲醛输送至有较大需氧量的大脑组织中，产生中枢神经氧化损伤。作为细胞内蛋白质合成的主要器官，氧化性的损伤可导致内质网形态发生不规则改变，进而导致蛋白质合成异常，或者蛋白质的正确折叠受到干扰，引起内质网应激，并有可能造成神经退行性疾病如阿兹海默症和帕金森综合症。原位检测神经细胞内质网内甲醛水平并以此判断不同皮革制造工艺引起的内质网应激对实现神经退行性疾病的致病机制和早期诊断具有十分重要的作用。

但是内质网位于细胞内部，如何实现实时动态的分析内质网甲醛含量成为摆在技术人员面前的技术难题。荧光成像技术尤其是基于小分子的双光子共聚焦技术具有包括原位实时分析，微创，生物损伤小，高的信噪比以及分子易于修饰等诸多优势，使其在进行活体甲醛含量的评估中大放异彩。最重要的是，共聚焦成像技术高的时空分辨率使得该工具更有可能在亚细胞器水平探索甲醛与神经细胞内质网应激的关系研究以及对神经退行性疾病的早期诊断提供可靠帮助。

现阶段的甲醛探针由于缺少内质网靶向性和双光子特性，一方面对生物样品损伤较大，不利于活体成像研究。另一方面无法对甲醛引起的内质网应激进行评估，也就无法实现对神经退行性疾病致病机制和早期诊断的研究。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针及其制备方法和应用，解决了特定细胞器靶向性差和生物样品损伤大的问题，为探究内质网氧化应激和神经退行性疾病的关系提供了一个合理工具。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针，其结构式如下：

本发明公开了一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)将4-甲苯磺酰氯与乙二胺均匀分散于溶剂A中进行取代反应，取代反应结束后将所得取代产物混合物经分离纯化后，得到化合物1；(2)将化合物1与4-溴-1,8-萘酐均匀分散于溶剂B中，在条件a中进行取代反应，取代反应结束后将所得产物混合物经分离纯化后，得到化合物2；(3)将化合物2与水合肼均匀分散于溶剂C中进行取代反应，反应结束后将所得产物混合物经分离纯化后，得到内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针SKD-1-HCHO。

优选地，步骤(1)中，4-甲苯磺酰氯与乙二胺的摩尔比为1：5～20。

优选地，步骤(2)中，化合物1与4-溴-1，8-萘酐的摩尔比为1:1～3。

优选地，步骤(3)中，化合物2与水合肼的摩尔比为1:1～3。

优选地，步骤(1)中，取代反应的温度为30～50℃。

优选地，步骤(2)中，取代反应的温度为70～90℃。

优选地，步骤(3)中，取代反应的温度为70～90℃。

优选地，步骤(1)中，溶剂A为二氯甲烷；步骤(2)中，溶剂B为乙醇或甲醇；步骤(3)中，溶剂C为乙醇或甲醇；

优选地，步骤(2)中，条件a为惰性气氛保护反应。

本发明公开了上述一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针或采用上述制备方法制得的一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针在检测内质网甲醛含量中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针。其中，萘酰亚胺荧光团作为探针的双光子荧光团，由于其独特的双光子性质，解决了对生物样品损伤大的问题；对甲苯磺酸作为内质网的定位基团，能够实现对细胞内特定细胞器的精准定位，解决了探针靶向性差的问题；肼作为甲醛分子的识别域，通过肼基与甲醛的取代反应生成腙，能过实现对甲醛分子的准确识别。因此，本发明所述内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针，能够在减少样品损伤的同时，实现内质网内甲醛精准的检测。解决了现有荧光探针受限于特定细胞器靶向性差和生物样品损伤大的问题。甲醛作为一种具有生理毒性的小分子，其进入生命体后会导致神经中枢损伤。现阶段的甲醛探针由于缺少靶向性和双光子特性，一方面对生命体损伤较大，不利于活体成像；另一方面由于缺少靶向性，无法针对细胞内特定细胞器进行靶向，无法对甲醛引起的内质网应激进行评估，也就无法实现对神经退行性疾病致病机制和早期诊断的研究。

本发明公开了上述内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针的制备方法，其制备工艺简单，产物收率高，具有工业扩大化生产推广价值。

本发明公开了上述内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针在检测内质网甲醛含量中的应用。本发明的内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针能够实现内质网定位及甲醛响应，进而达到研究甲醛对内质网应激的目的。细胞毒性实验还表明该探针具有较低的生物毒性，双光子共聚焦显微镜成像实验表明该探针对PC12细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的内质网(定位系数为0.93).适用于细胞内质网甲醛含量的双光子荧光成像，进而实现对内质网氧化应激的监测。

附图说明

图1是探针SKD-1-HCHO在不同极性有机溶剂中的紫外吸收光谱图以及荧光发射光谱图；其中，(a)为探针分子在二恶烷(Dioxane)、二氯甲烷(Dichloromethane)、二甲基甲酰胺(Dimethylformamide)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran)、甲苯(Toluene)、氯仿(Chloroform)、乙醇(Ethanol)的紫外吸收光谱图，(b)为探针分子在二恶烷、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、甲苯、氯仿、乙醇的荧光发射光谱图；

图2是探针SKD-1-HCHO的荧光强度与不同甲醛浓度之间的线性关系图；

图3是探针SKD-1-HCHO的有效双光子吸收截面图；

图4是PC12细胞在不同浓度的探针SKD-1-HCHO溶液中存活率图；

图5是探针SKD-1-HCHO的亚细胞器共定位实验共聚焦荧光成像图；其中，(a)为探针分子在PC12细胞中染色30min的情况，(b)为市售ER-Tracker染料在PC12细胞中染色30min的情况，(c)为(a)和(b)的叠加图像，(d)为内质网对应的两种通道的强度散点图，(e)为内质网的ROI强度分布图。(f)为探针分子在PC12细胞中染色30min的情况，(g)为市售Mito-Tracker染料在PC12细胞中染色30min的情况，(h)为(f)和(g)的叠加图像，(i)为线粒体对应的两种通道的强度散点图，(j)为线粒体的ROI强度分布图。(k)为探针分子在PC12细胞中染色30min的情况，(l)为市售Lyso-Tracker染料在PC12细胞中染色30min的情况，(m)为(k)和(l)的叠加图像，(n)为溶酶体对应的两种通道的强度散点图，(o)为溶酶体的ROI强度分布图；

图6是探针SKD-1-HCHO与不同浓度的甲醛(0，1，2，4，8，10，15，20，25，30μM)孵育30min后的细胞荧光图；其中，a1)、b1)、c1)、d1)、e1)、f1)、g1)、h1)、i1)、j1)是明场中的细胞图像；此外，a2)、b2)、c2)、d2)、e2)、f2)、g2)、h2)、i2)、j2)是细胞孵育后在绿色荧光通道中的图像；此外，a3)、b3)、c3)、d3)、e3)、f3)、g3)、h3)、i3)、j3)是将明场与绿色荧光通道合并后的细胞图像；

图7是基于图6根据不同甲醛浓度所对应的荧光强度的线性关系图；

图8是探针SKD-1-HCHO对小鼠脑组织中不同深度的双光子荧光成像；其中，(a)为对照组中组织穿深260μm的荧光成像，(b)为对照组中组织穿深220μm的荧光成像，(c)为对照组中组织穿深180μm的荧光成像，(d)为对照组中组织穿深140μm的荧光成像，(e)为对照组中组织穿深100μm的荧光成像，(f)为甲醛组中组织穿深260μm的荧光成像，(g)为对照组中组织穿深220μm的荧光成像，(h)为甲醛组中组织穿深180μm的荧光成像，(i)为甲醛组中组织穿深140μm的荧光成像，(j)为甲醛组中组织穿深100μm的荧光成像，(k)为抗炎组中组织穿深260μm的荧光成像，(l)为抗炎组中组织穿深220μm的荧光成像，(m)为抗炎组中组织穿深180μm的荧光成像，(n)为抗炎组中组织穿深140μm的荧光成像，(o)为抗炎组中组织穿深100μm的荧光成像；

图9是对照组、甲醛组、抗炎组三组中大鼠脑组织对应的平均荧光强度图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本发明公开了一种内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针，可以实现检测内质网甲醛含量，其结构式如下：

本发明公开了上述内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：在搅拌条件下，将4-甲苯磺酰氯与乙二胺均匀分散在溶剂二氯甲烷中，在30～50℃加热反应15分钟后冷却到室温。得到的取代产物混合物用蒸馏水洗涤两次，硫酸钠干燥后旋蒸除去溶剂，得到白色固体产物，命名为化合物1。其中，4-甲苯磺酰氯、乙二胺的投料摩尔比为1:5～20。

具体地，在本发明的具体实施例中，4-甲苯磺酰氯、乙二胺投料摩尔比为1：10，产率为75％-85％；为1：20，产率为55％-60％；为1：8，产率为60％-70％；为1；5，产率为50％-55％。

具体地，在本发明的具体实施例中，30℃时，产率为25％-30％；40℃时，产率为70％-85％；50℃时，产率为60％-70％。

步骤2：在搅拌条件下，将化合物1和4-溴-1，8-萘酐在氮气保护的环境中均匀分散在溶剂中，70～90℃温度下回流反应8小时后冷却到室温。得到的取代产物混合物用蒸馏水洗涤两次，得到固体粉末用体积比为二氯甲烷：甲醇＝20：1的洗脱剂进行柱层析纯化，得到灰色固体产物，命名为化合物2。其中，化合物1、4-溴-1，8-萘酐的投料摩尔比为1:1～3。溶剂为甲醇或者乙醇。

具体地，在本发明的具体实施例中，化合物1、4-溴-1，8-萘酐的投料摩尔比为1：1，产率为80％-85％；为1：2，产率为75％-80％；为1：3，产率为65％-70％。

具体地，在本发明的具体实施例中，70℃时，产率为70％-80％；80℃时，产率为80％-85％；90℃时，产率为70％-75％。

步骤3：在搅拌条件下，将化合物2和水合肼均匀分散在溶剂中，70～90℃温度下反应6小时后冷却到室温。抽滤后将滤饼真空干燥得到白色固体粉末，即为内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针，命名为SKD-1-HCHO。其中，化合物2、水合肼的投料摩尔比为1:1～3。溶剂为甲醇或者乙醇。

具体地，在本发明的具体实施例中，化合物2、水合肼的投料摩尔比为1：1，产率为80％-85％；为1：2，产率为75％-80％；为1：3，产率为70％-75％。

具体地，在本发明的具体实施例中，70摄氏度时，产率为70％-75％，80℃时，产率为80％-85％，90℃时，产率为75％-80％。

本发明内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针SKD-1-HCHO的合成路线如下：

a)乙二胺，二氯甲烷，40℃，15分钟；b)4-溴-1,8-萘酐，乙醇或甲醇，80℃，8小时；c)水合肼，乙醇或甲醇，80℃，6小时。

本发明的内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针的用途，是在双光子激发的条件下，实现皮革样品中甲醛对内质网氧化应激的原位检测及其诱导神经炎症的评估。检测及评估方法如下：

将本发明的内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针溶于DMSO溶液中制得0.1mM的母液，各取5μL母液与3mL不同极性的溶剂中，获得探针SKD-1-HCHO在不同溶剂中的紫外光谱图。随后立即测试每组溶液的紫外最佳激发波长、荧光最佳发射波长以及相应的荧光量子产率。为了进一步确定探针对于甲醛的响应特征，首先在不同浓度的甲醛溶液中测定探针SKD-1-HCHO的荧光光谱，所有的荧光检测均在激发波长为430nm处激发。同时采用双光子激发荧光法测定了探针SKD-1-HCHO的双光子荧光截面。随着甲醛含量的增加。探针溶液在550nm处的荧光强度逐渐增强，同时甲醛的浓度达到30μM时，探针的荧光强度逐渐趋于平稳且没有太大变化，这表明此时探针与甲醛的反应趋于饱和，而且甲醛浓度在0～20μM之间存在良好的线性关系，线性方程为y＝46.58+122.98x，R²＝0.96。荧光强度与甲醛浓度的表征实验说明探针对于甲醛检测具有优异的响应性能。

本发明的内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针能够实现内质网定位及甲醛响应，进而达到研究甲醛对内质网应激的目的。细胞毒性实验还表明该探针具有较低的生物毒性，双光子共聚焦显微镜成像实验表明该探针对PC12细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的内质网(定位系数为0.93).适用于细胞内质网甲醛含量的双光子荧光成像，进而实现对内质网氧化应激的监测。

下面通过实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1：