阅读说明：本技术 一种制备肌红蛋白配对单抗的方法及由该方法制备得到的配对单抗 (Method for preparing myoglobin pairing monoclonal antibody and pairing monoclonal antibody prepared by method ) 是由 熊宁 张晓杰 李光 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备肌红蛋白配对单抗的方法及由该方法制备得到的配对单抗。所述方法包括分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备以及筛选配对单抗的步骤。本发明采用羊抗MYO纯化IgG预包被酶标板,再加入MYO抗原,对MYO抗原进行间接包被。与直接包被MYO抗原相比,间接包被的MYO抗原暴露出的位点发生了变化,突破了之前的表位偏好性,有利于筛选到针对新的MYO抗原表位的单抗,从而提高了MYO配对单抗的筛选几率。(The invention discloses a method for preparing a myoglobin pairing monoclonal antibody and the pairing monoclonal antibody prepared by the method. The method comprises the steps of preparing hybridoma cells secreting the anti-myoglobin monoclonal antibody and screening paired monoclonal antibodies. The invention adopts sheep anti-MYO purified IgG to pre-coat the ELISA plate, and then MYO antigen is added to indirectly coat the MYO antigen. Compared with direct coating of MYO antigen, the site exposed by indirect coating of MYO antigen is changed, the previous epitope preference is broken through, monoclonal antibody aiming at new MYO antigen epitope is screened, and thus the screening probability of MYO paired monoclonal antibody is improved.)

一种制备肌红蛋白配对单抗的方法及由该方法制备得到的配 对单抗

技术领域

本发明涉及一种单抗的制备方法，特别涉及一种制备肌红蛋白配对单抗的方法，还涉及由该方法制备得到的配对单抗。本发明属于生物技术领域。

背景技术

肌红蛋白(Myoglobin，MYO)是一个具有153个氨基酸的多肽链和一个含铁血红素辅基组成的亚铁血红素蛋白，存在于哺乳动物的骨骼肌和心肌等组织中，主要用于储存和分配氧。由于Mb的分子量小，可以很快从破损的细胞中释放出来，在AMI发病后1～3小时血中浓度迅速上升，6～7小时达峰值，l2小时内几乎所有急性心肌梗塞(AMI)患者MYO都有升高，升高幅度大于各心肌酶，因此可以作为AMI的早期诊断标志物，并能据此推测心肌梗死面积和判断溶栓疗效。

目前国内检测MYO的方法有放射免疫法(radio immunoassay，RIA)、ELISA、荧光免疫测定法等。其中，ELISA具有灵敏度高、特异性强、定量准确、操作简单、适用于多份标本同时检测、不需特殊设备仪器等优点，具有广阔的应用前景。国外已经制备了高质量的MYO单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)并成功研制了MYO双抗体夹心ELISA试剂盒，但是试剂盒价格昂贵，检测成本较高。 ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbentassay——sandwich technique) 的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量，在双抗体夹心配对过程中，只有针对的2个不同表位并且空间位置相隔较远的单抗，才有可能形成配对。因此，制备MYO双抗体夹心ELISA试剂盒的关键在于获得高质量的配对单抗，然而肌红蛋白配对单抗制备难度较大，主要原因在于用常规方法包被肌红蛋白时，抗原在酶标板上暴露的优势位点过于集中，导致筛选到的单抗识别位点也集中在MYO的少数位点，具有很强的偏好性，因此很难筛选到配对的单抗细胞株。

为了筛选到更多的MYO配对单抗，本发明采用羊抗MYO纯化IgG预包被酶标板，再加入MYO抗原，对MYO抗原进行间接包被。与直接包被MYO抗原相比，间接包被的MYO抗原暴露出的位点发生了变化，突破了之前的表位偏好性，有利于筛选到针对新的MYO抗原表位的单抗，从而提高了MYO配对单抗的筛选几率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的制备肌红蛋白配对单抗的方法，该方法能够克服现有方法筛选到的单抗识别位点集中，偏好性强等缺点。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种制备肌红蛋白配对单抗的方法，包括分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备以及筛选配对单抗的步骤；其中在使用间接ELISA方法筛选分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞时，先用羊抗MYO纯化IgG包被酶标板，然后再加入MYO抗原，之后再依次加入杂交瘤细胞培养上清、羊抗小鼠 IgG-HRP，进行显色读板，获得分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后从中筛选得到能够配对的单抗。

在本发明所述的方法中，优选的，分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备按照以下步骤进行：

1)细胞融合：分离免疫肌红蛋白抗原的小鼠的脾脏，制备B细胞悬液，与 SP2/0细胞混合离心后，进行细胞融合培养；

2)酶标板包被：羊抗MYO纯化IgG用Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液稀释后加入酶标板中，2-8℃过夜包被，PBST洗板1次；

3)加入MYO抗原：MYO抗原用PBST后加入酶标板中，37℃温育，PBST 洗板1次；

4)加入杂交瘤细胞培养上清：将融合细胞培养上清液进行无菌取样，加入酶标板中，37℃温育，PBST洗板1次；

5)加入羊抗小鼠IgG-HRP：用PBST将羊抗小鼠IgG-HRP稀释至工作浓度， 37℃温育，PBST洗板2次；

6)显色与读板：加入H₂O₂-TMB底物，37℃避光显色，加入2M H₂SO₄终止显色，置于酶标仪，450nm/630nm双波长读板，得到分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。

其中，优选的，分离免疫肌红蛋白抗原的小鼠的脾脏，制备B细胞悬液，与 SP2/0细胞混合离心后，用PEG1450进行细胞融合，用含2％v/v HAT，10％v/v 胎牛血清的DMEM培养基进行培养，融合后第4天换液，轻轻吸出原培养基，换成含1％v/v HT，10％v/v胎牛血清的DMEM培养基进行培养。

其中，优选的，步骤2)中羊抗MYO纯化IgG用50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH9.6)稀释至5ug/ml，100ul/孔，2-8℃过夜包被，PBST洗板1次；步骤3)中MYO抗原用PBST稀释至1ug/ml，100ul/孔，37℃温育30min，PBST 洗板1次。

其中，优选的，步骤5)中用PBST将羊抗小鼠IgG-HRP稀释至工作浓度， 100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板2次。

在本发明所述的方法中，优选的，筛选配对单抗按照以下步骤进行：

1)纯化单抗包被：纯化分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的腹水单抗，纯化单抗稀释后加入新的酶标板中，包被过夜，PBST洗板1次；

2)MYO抗原加样：MYO抗原用PBST后加入酶标板中，37℃温育，PBST 洗板1次；

3)HRP酶标单抗加样：用PBST将与包被单抗配对的HRP酶标单抗稀释后加入酶标板中，37℃温育，PBST洗板2次；

4)显色与读板：加入H₂O₂-TMB底物，37℃避光显色，加入2M H₂SO₄终止显色，置于酶标仪，450nm/630nm双波长读板，450nm/630nm≥1.0认为能够进行配对。

其中，优选的，步骤1)中纯化单抗用50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH9.6) 稀释至5ug/ml，100ul/孔，2-8℃过夜包被，PBST洗板1次。

其中，优选的，步骤2)中MYO抗原用PBST稀释至1ug/ml，100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板1次；步骤3)中用PBST将与包被单抗配对的HRP酶标单抗稀释至工作浓度，100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板2次。

进一步的，本发明还提出了按照以上任一项所述的方法筛选得到的肌红蛋白配对单抗，其中，优选的，所述的配对单抗分别由MYO 3F1以及MYO 5A8两株杂交瘤细胞分泌产生；

其中，杂交瘤细胞株MYO 3F1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18184，保藏时间为2019年7月5日；

其中，杂交瘤细胞株MYO 5A8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18185，保藏时间为2019年7月5日。

更进一步的，本发明还提出了所述的肌红蛋白配对单抗在制备检测肌红蛋白抗原试剂中的用途，其中，优选的，所述的试剂适用于ELISA双抗体夹心法。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、因包被抗体与酶标二抗本质为同种属来源的IgG，采用羊抗MYO纯化IgG 预包板，既能实现对MYO抗原的捕获，完成间接包被，也不影响羊抗小鼠 IgG-HRP(酶标二抗)的正常使用；

2、采用抗体预包被的间接包被方法改变了常规包被法抗原表位暴露的偏好性，获得了针对MYO不同表位的单抗细胞株，提高了配对筛选几率，最终成功获得了配对细胞株。

附图说明

图1A为MYO抗原示意图；

图1B为传统筛选方法：MYO抗原直接包被，后续步骤按间接ELISA操作： 1)上清加样；2)酶标二抗；3)显色；

图1C为本发明筛选方法：先包被羊抗MYO纯化IgG，再加入MYO抗原，后续步骤按间接ELISA操作：1)上清加样；2)酶标二抗；3)显色。

图1D为MYO单抗配对示意图；

图2为单抗MYO-3F1与MYO-5A8的配对结果。

菌种保藏信息：

肌红蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为MYO 3F1，分类命名为肌红蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18184，保藏时间为2019年7月5日。

肌红蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为MYO 5A8，分类命名为肌红蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18185，保藏时间为2019年7月5日。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、材料准备：1)肌红蛋白抗原购自北京利德曼生化股份有限公司；2)羊抗MYO纯化IgG购自北京利德曼生化股份有限公司；3)羊抗小鼠IgG-HRP购自北京利德曼生化股份有限公司；4)Balb/C小鼠购自北京华阜康；5)CB缓冲液：50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH9.6)；6)PBST：150mM PBS(pH7.4,含 0.05％Tween20)。

2、实验过程：

2.1小鼠免疫：小鼠免疫按下表1进行，肌红蛋白抗原与佐剂乳化后颈背部及腹部皮下多点注射。

表1

免疫次数	时间间隔(天)	免疫佐剂	抗原剂量
				1	0	FCA	25ug
2	21	FIA	25ug
				3	14	FIA	25ug
4	14	FIA	25ug
				5	14	FIA	25ug

2.2细胞融合：

融合前3天采用不含佐剂的肌红蛋白抗原腹腔注射进行冲击免疫，融合当天无菌分离免疫脾脏，制备B细胞悬液，与SP2/0细胞混合离心后，用PEG1450 进行细胞融合，用含2％HAT，10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。融合后第4天换液，轻轻吸出原培养基，换成含1％HT，10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，第6-12天检测。

2.3融合板筛选

2.3.1本发明方法

1)酶标板包被：羊抗MYO纯化IgG用50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH9.6) 稀释至5ug/ml，100ul/孔，2-8℃过夜包被，PBST洗板1次；

2)MYO抗原加样：MYO抗原用PBST稀释至1ug/ml，100ul/孔，37℃温育 30min，PBST洗板1次；

3)融合板上清加样：于超净工作台内对杂交瘤细胞培养上清液进行无菌取样，100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板1次；

4)羊抗小鼠IgG-HRP：用PBST将羊抗小鼠IgG-HRP(酶标二抗)稀释至工作浓度，100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板2次；

5)显色与读板：H₂O₂-TMB底物，100ul/孔，37℃避光显色5-10min，2M H₂SO₄ 50ul/孔终止显色，置于酶标仪，450nm/630nm双波长读板。

2.3.2传统方法

1)酶标板包被：MYO抗原用50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH9.6)稀释至5ug/ml，100ul/孔，2-8℃过夜包被，PBST洗板1次；

2)融合板上清加样：于超净工作台内对杂交瘤细胞培养上清液进行无菌取样，100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板1次；

3)羊抗小鼠IgG-HRP：用PBST将羊抗小鼠IgG-HRP(酶标二抗)稀释至工作浓度，100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板2次；

4)显色与读板：H₂O₂-TMB底物，100ul/孔，37℃避光显色5-10min，2M H₂SO₄ 50ul/孔终止显色，置于酶标仪，450nm/630nm双波长读板。

2.4杂交瘤建株与单抗制备

对筛选得到的阳性细胞用有限稀释法进行克隆，克隆一般进行2-3次，获得单克隆阳性杂交瘤细胞株后，进行扩大培养，对细胞进行冻存与腹水制备。采用 Protein G亲和纯化法纯化腹水单抗。采用改良过碘酸钠法将单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。

2.5酶标单抗工作浓度测定

1)MYO抗原包被：MYO抗原用CB缓冲液稀释至1ug/ml，100ul/孔，2-8℃过夜包被，PBST洗板1次；

2)单抗-HRP加样：用PBST将单抗-HRP(酶标单抗)稀释至工作浓度，100ul/ 孔，37℃温育30min，PBST洗板2次；

3)显色与读板：H₂O₂-TMB底物，100ul/孔，37℃避光显色5-10min，2M H₂SO₄ 50ul/孔终止显色，置于酶标仪，450nm/630nm双波长读板。选取OD值在1.5左右时，单抗-HRP的最高稀释倍数作为其工作浓度。

2.6单抗配对实验

1)纯化单抗包被：纯化分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的腹水单抗，纯化单抗用50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH9.6)稀释至5ug/ml，100ul/ 孔，2-8℃过夜包被，PBST洗板1次；

2)MYO抗原加样：MYO抗原用PBST稀释至1ug/ml，100ul/孔，37℃温育 30min，PBST洗板1次；

3)单抗-HRP加样：用PBST将与包被单抗配对的HRP酶标单抗稀释至工作浓度，100ul/孔，37℃温育30min，PBST洗板2次；

4)显色与读板：H₂O₂-TMB底物，100ul/孔，37℃避光显色5-10min，2M H₂SO₄ 50ul/孔终止显色，置于酶标仪，450nm/630nm双波长读板，450nm/630nm≥1.0 认为能够进行配对。

2.7单抗配对结果

利用传统方法共获得46株杂交瘤细胞，但不能配对；采用本发明方法得到6 株杂交瘤细胞，其中可选出2个配对：3F1-5A8；4D6-5A8，其中3F1-5A8为最佳组合(表2)，其中3F1的结合亲和常数(M^-1)为5.28×10⁹，4D6的结合亲和常数(M^-1)为7.9×10⁹，5A8的结合亲和常数(M^-1)为5.21×10⁹。

将筛选得到的杂交瘤细胞株3F1命名为MYO 3F1，分类命名为肌红蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18184，保藏时间为2019年7月5日。

将筛选得到的杂交瘤细胞株5A8命名为MYO 5A8，分类命名为肌红蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18185，保藏时间为2019年7月5日。

表2单抗筛选结果