一种ror1单克隆抗体、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种ror1单克隆抗体、制备方法及其应用 (ROR1 monoclonal antibody, preparation method and application thereof ) 是由 范国煌 丁成立 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种ROR1单克隆抗体,包括所述ROR1单克隆抗体包括重链和轻链结构,所述重链的重链可变区和所述轻链的轻链可变区各自具有3个互补决定区CDR,并添加分泌优化的信号肽,能够高效表达ROR1单克隆抗体,与ROR1受体的Frizzled结构域特异性结合,抑制相关通路的传递,有效治疗癌症,特别是在治疗非小细胞肺腺癌方面具有显著应用性。(The invention provides a ROR1 monoclonal antibody, which comprises a heavy chain and a light chain structure of the ROR1 monoclonal antibody, wherein a heavy chain variable region of the heavy chain and a light chain variable region of the light chain respectively have 3 CDRs, and a secretion-optimized signal peptide is added, so that the ROR1 monoclonal antibody can be efficiently expressed, is specifically combined with a Frizzled domain of a ROR1 receptor, inhibits the transmission of related channels, and effectively treats cancer, particularly has remarkable application in the aspect of treating non-small cell lung adenocarcinoma.)
技术领域
本发明属于生物技术领域及抗体领域，具体涉及一种ROR1单克隆抗体、制备方法及其应用。
背景技术
受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(receptor tyrosine kinase-like orphanreceptor，ROR1)是一个跨膜蛋白，分子量大小约104kDa，糖基化修饰后的大小约130kDa。ROR1受体的胞外域由三个相异域组成：膜远端的免疫球蛋白样(Ig-like)域；中间的卷曲(Frizzled)域；以及膜近端的克林格(Kringle)域。
有研究表明ROR1在胚胎发育过程中高水平表达，并在胚胎、肌肉、骨骼、肺以及神经系统发育调控中发挥重要的作用。在发育成熟之后，ROR1蛋白的表达被限制了，其仅仅少量表达在一些器官和组织中，包括肺、胰脏、脂肪细胞等。但是，ROR1在多种肿瘤细胞中表达，包括慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌以及卵巢癌等。
目前已经有一个ROR1单克隆抗体药物(UC-961)在进行临床实验，用于治疗慢性淋巴细胞白血病和套细胞淋巴瘤。UC-961特异性结合在ROR1蛋白的免疫球蛋白样(Ig-like)域。尚未发现针对ROR1其他结构域的ROR1单克隆抗体的问世。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种ROR1单克隆抗体，所述ROR1单克隆抗体包括重链和轻链结构，所述重链的可变区和所述轻链的可变区各自具有3个互补决定区CDR，其中：重链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，重链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，重链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
即重链CDR1：GGSFSG(SEQ ID NO:3)；
重链CDR1：NHSGSTS(SEQ ID NO:4)；
重链CDR1：GHSSGWYRRYFDL(SEQ ID NO:5)；
轻链CDR1：RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:6)；
轻链CDR2：DASNRAT(SEQ ID NO:7)；
轻链CDR3：QQRSNWPPT(SEQ ID NO:8)。
本发明进一步提供ROR1单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明进一步提供ROR1单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明中，将该单克隆抗体命名为G3单克隆抗体。
进一步地，本发明提供ROR1单克隆抗体，在所述的重链可变区的氨基酸和轻链可变区的氨基酸序列基础上，在重链可变区(VH)的N端加上针对重链分泌表达优化的信号肽序列(例如序列是ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCA，如SEQ ID NO.11所示；蛋白序列为MGWSCIILFLVATATGVHS，如SEQ ID NO.12所示)，在VH的C端加上人IgG1恒定区序列CH1-CH3(例如核苷酸序列为：
GCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCTCCCTCTTCCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCTGCTCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATTCCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTATAGCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTGCCTAGCTCCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTAGCAATACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAATGATAA，如SEQ ID NO.13所示；氨基酸序列ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，如SEQ ID NO.14所示)，构造出了重链全长的氨基酸序列。
进一步地，本发明提供ROR1单克隆抗体，在轻链可变区VL的N端加上轻链分泌表达优化的信号肽序列(例如核苷酸序列为：
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCA，如SEQ IDNO.15所示；氨基酸序列为：MGWSCIILFLVATATGVHS，如SEQ ID NO.16所示)，在VL的C端加上人Kappa恒定区序列(例如核苷酸序列为：
AGGACCGTGGCTGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGAGCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGAGCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCTGATTATGAGAAGCACAAGGTGTATGCTTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGATAA，如SEQ ID NO.17所示；氨基酸序列为RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC，如SEQ ID NO.18所示)，构造出轻链的全长氨基酸序列。
即，根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链恒定区为人IgG1-Fc恒定区，轻链恒定区为人κ链恒定区。
根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；该抗体为本发明的抗ROR1的全人源单克隆抗体G3的具体示例。(SEQ ID NO.1和2不含信号肽，但是含恒定区)
另一方面，本发明还提供了ROR1单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示；该抗体为本发明的抗ROR1的全人源单克隆抗体G3的具体示例。
本发明进一步提供一种ROR1单克隆抗体的制备方法，由以下步骤组成：
1)根据重链和轻链的核苷酸序列进行合成序列，构建到表达抗体中；
2)按照重链和轻链比例进行真核细胞转染，表达抗体进行蛋白纯化后得到相应ROR1单克隆抗体。
在上述制备方法中，所述表达抗体为pcDNA3.4。
在上述制备方法中，所述重链和轻链的质粒量摩尔比例为1：1-5。优选1：2。防止产生没有轻链的Fc二聚体。
进一步地，在上述制备方法中，上述重链和轻链中包括优化分泌的信号肽。
一种上述ROR1单克隆抗体在制备治疗癌症药物中的应用。
在上述应用中，癌症包括：慢性粒细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，非小细胞肺癌和乳腺癌
在上述应用中，所述癌症为非小细胞肺癌腺癌。
综上所述，本发明利用从天然噬菌体展示库中筛选得到一个单克隆抗体的VH和VL序列，构建与制备出全人源的全长单克隆抗体。本发明中的单克隆抗体G3特异性得与人ROR1的卷曲(Frizzled)域结合，效果优于结合于人ROR1其他结构域的治疗效果，首次发现，本单克隆抗体非小细胞肺腺癌具有突出的效果，其在临床肿瘤的诊疗上有重要的应用价值。
附图说明
图1抗人ROR1抗体G3与人ROR1的结合(ELISA)；
图2抗人ROR1抗体G3与鼠ROR1的结合(ELISA)；
图3抗人ROR1单克隆抗体G3与JeKo-1细胞ROR1蛋白的结合(FACS)；
图4抗人ROR1单克隆抗体G3与CHO-K1-hROR1细胞表面的ROR1的结合(FACS)；
图5抗人ROR1单克隆抗体G3与人ROR1蛋白卷曲(Frizzled)域的结合(ELISA)；
图6 G3抗体能抑制NCI-H1975细胞的增殖。
具体实施方式
以下实施例为本领域常用方法或依据商用试剂盒说明书进行操作。
实施例1
抗ROR1抗体的制备方法
本发明中的ROR1抗体VH和VL序列来自于天然噬菌体展示库(ProMabBiotechnologies,Inc)。
抗体重链和轻链的序列通过基因合成(即SEQ ID NO.9和10，并加入相应的分泌信号肽SEQID NO.11和15)的方式得到，分别构建到pcDNA3.4载体上。将Expi-CHO-S细胞扩培到一定密度后，通过瞬时转染的方式(Gibco，ExpiFectamine CHO Transfection Kit 1L)，将该质粒DNA以重链轻链摩尔比为1:2转染到Expi-CHO-S中，根据转染试剂盒操作规程在转染后第1天和第5天分别进行补料，在转染后第7天进行纯化。
表达结束后用Protein A(GE mabselect Sure)进行纯化，得到纯化后的抗体。最后采用SDS-PAGE和SEC-HPLC对抗体进行质量分析。
抗体分子量为150kDa，抗体纯度为93.9％。
实施例2
ROR1抗体的活性鉴定
I酶联免疫(ELISA)法
用包被液(3.56g Na2CO3和8.4g NaHCO3，pH9.5)稀释重组人ROR1蛋白(购自北京百普赛斯生物科技有限公司，产品编号为：RO1-H522y)至1μg/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入100μL，4℃孵育过夜；PBS含2％BSA的缓冲液封闭96孔板，室温孵育1h；PBST(PBS含0.05％Tween 20)洗涤3次后，每个孔中加入100μL ROR1的抗体分子G3(0.6μg/ml起始浓度，按5倍稀释成8个浓度梯度)室温孵育1h；以1:10000稀释辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG Fc二抗(购自Abcam公司，产品编号：ab97225)，按100μL/孔加入到孔内，室温孵育1h；配制辣根过氧化物酶底物显色液(购自上海生工生物工程有限公司，产品编号：C520026)，按100μL/孔加入到孔内，室温下孵育1-2min后用2mol硫酸中止反应，酶标仪读取OD450值。
用包被液(3.56g Na2CO3和8.4g NaHCO3，pH9.5)稀释重组鼠ROR1蛋白(购自北京百普赛斯生物科技有限公司，产品编号为：RO1-M5221)至1μg/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入100μL，4℃孵育过夜；PBS含2％BSA的缓冲液封闭96孔板，室温孵育1h；PBST(PBS含0.05％Tween 20)洗涤3次后，每个孔中加入100μL ROR1的抗体分子G3(15μg/ml起始浓度，按5倍稀释成8个浓度梯度)室温孵育1h；PBST洗涤3次后，以1:10000稀释辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG Fc二抗(购自Abcam公司，产品编号：ab97225)，按100μL/孔加入到孔内，室温孵育1h；配制辣根过氧化物酶底物显色液(购自上海生工生物工程有限公司，产品编号：C520026)，按100μL/孔加入到孔内，室温下孵育1-2min后用2mol硫酸中止反应，酶标仪读取OD450值。
上述结果显示抗人ROR1抗体G3与人ROR1及鼠ROR1都能结合(图1和2)。证明该抗体能够与受体稳定结合。
II流式细胞术(FACS)
采用流式细胞仪(FACS)分析人ROR1抗体与内源性ROR1抗原的结合活性。
具体方法：收集JeKo-1细胞，平均分至1.5mL EP管，每管5×105个JeKo-1细胞。用PBS洗1次，1000rpm，5min。每管加入含1％BSA的PBS封闭液，4℃孵育1h，PBS洗1次，1000rpm，5min。将2管细胞均用100μL PBS重悬，其余管的细胞分别用100μL不同浓度的ROR1抗体G3(20μg/mL起始浓度，4倍稀释成8种浓度梯度)重悬，4℃孵育1h，PBS洗2次，1000rpm，5min。
加入ROR1抗体的细胞用100μL PE标记的羊抗人IgG-Fc二抗(购自Abcam公司，产品编号：ab98596)重悬，其余2管细胞分别用100μL PBS和PE标记的羊抗人IgG-Fc二抗重悬，4℃避光孵育30min。PBS洗1次后，每管均用200μL PBS重悬，在FACS上进行免疫荧光分析。
采用流式细胞仪(FACS)分析人ROR1抗体与外源性ROR1抗原的结合活性。具体方法：用包装人ROR1蛋白表达质粒的慢病毒感染CHO-K1细胞，得到过表达ROR1的稳转细胞株CHO-K1-hROR1。收集稳定表达人ROR1的细胞株CHO-K1-hROR1，平均分至1.5mL EP管，每管5×105个CHO-K1-human-ROR1细胞。PBS洗1次，300g，5min。每管加入含1％BSA的PBS封闭液，4℃孵育1h，PBS洗1次，300g，5min。将其中2管细胞用100μL PBS重悬，其余管的细胞分别用100μL不同浓度的ROR1抗体G3(30μg/mL起始浓度，3倍稀释成8种浓度梯度)重悬，4℃孵育1h，PBS洗2次，300g，5min。加入ROR1抗体的细胞用100μL PE标记的羊抗人IgG-Fc二抗(购自Abcam公司，产品编号：ab98596)重悬，其余2管细胞分别用100μL PBS和PE标记的羊抗人IgG-Fc二抗重悬，4℃避光孵育30min。PBS洗1次后，每管均用200μL PBS重悬，在FACS上进行免疫荧光分析。
上述结果显示抗人ROR1抗体G3能与JeKo-1和CHO-K1-hROR1细胞表面的ROR1结合(图3和4)。
实施例3
ROR1抗体抗原结合表位鉴定
重组ROR1蛋白包含3种胞外结构域：Ig结构域，卷曲结构域，克林格结构域(购自北京百普赛斯生物科技有限公司，产品编号分别为：RO1-H5221、RO1-H5222、RO1-H5223)。用包被液(3.56g Na2CO3和8.4g NaHCO3，pH9.5)分别稀释3种ROR1蛋白的胞外结构域至1μg/mL，包被ELISA 96孔板，每孔加入100μL，4℃孵育过夜；PBS含2％BSA的缓冲液封闭96孔板，室温孵育1h；PBST(PBS含0.05％Tween 20)洗涤3次后，每个孔中加入100μL ROR1的抗体分子G3和C3(20μg/ml起始浓度，按5倍稀释成8个浓度梯度)室温孵育1h；PBST洗涤3次后，以1:10000稀释辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG Fc二抗(购自Abcam公司，产品编号：ab97225)，按100μL/孔加入到孔内，室温孵育1h；配制辣根过氧化物酶底物显色液(购自上海生工生物工程有限公司，产品编号：C520026)，按100μL/孔加入到孔内，室温下孵育10min后用2mol硫酸中止反应，酶标仪读取OD450值。
上述结果显示抗人ROR1抗体G3能人ROR1蛋白卷曲(Frizzled)域结合(图5)。
实施例4
G3抗体能抑制NCL-H1975细胞的增殖
选择96孔板，每孔铺入3×103个NCL-H1975细胞(人非小细胞肺癌腺癌细胞，ATCC，CRL-5908)，37℃，5％CO2培养箱培养过夜。第二天分别加入ROR1抗体G3和UC-961(根据US20160097776A1制得)(24μg/ml起始浓度，按2倍稀释成10个梯度)，37℃，5％CO2培养箱培养3天。
每个孔加入50μlLuminesent试剂(购自Promega,产品编号为：G7572)，室温裂解10分钟。在微孔板检测仪(购自Tecan,型号为：Infinite 200pro)读值。
实验结果显示G3对NCL-H1975细胞的增殖抑制效果明显优于UC-961(图6)。
序列表
<110> 安萌得医药科技（上海）有限公司
<120> 一种ROR1单克隆抗体、制备方法及其应用
<141> 2019-09-27
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly His Ser Ser Gly Trp Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Lys Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Gly Ser Phe Ser Gly
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Asn His Ser Gly Ser Thr Ser
1 5
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gly His Ser Ser Gly Trp Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 9
<211> 1359
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
caggtgcagc tgcagcagtg gggcgccgga ctgctgaagc cttccgagac cctgtccctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg ctccttcagc ggctattact ggtcctggat ccggcagcct 120
cctggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaatcaca gcggctccac ctcctataac 180
cccagcctga agagccgggt gaccatcagc gtggatacca gcaagaatca gttcagcctg 240
aagctgagct ccgtgaccgc cgctgacacc gccgtgtatt attgtgccag gggccacagc 300
agcggctggt atcggcggta cttcgatctg tggggcaggg gcaccctggt gaccgtgagc 360
tccgcttcca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggctc cctcttccaa gagcaccagc 420
ggcggcaccg ctgctctggg atgtctggtg aaggactact tccctgagcc tgtgaccgtg 480
tcctggaatt ccggcgccct gacctccggc gtgcacacat tccctgctgt gctgcagtcc 540
tccggcctgt atagcctgtc ctccgtggtg acagtgccta gctccagcct gggcacccag 600
acctatatct gcaacgtgaa ccacaagcct agcaatacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cctaagagct gcgacaagac ccacacctgt cctccatgtc ctgctccaga actgctcggc 720
ggaccttccg tgttcctgtt tcctccaaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg atcccgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 900
aacagcacct acagagtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg ctcctatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc tagggaaccc caggtttaca cactgcctcc aagcagggac 1080
gagctgacca agaatcaggt gtccctgacc tgcctggtca agggcttcta cccttccgat 1140
atcgccgtgg aatgggagag caatggccag cctgagaaca actacaagac aacccctcct 1200
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tacagcaagc tgacagtgga caagagcaga 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gtctcctggc aaatgataa 1359
<210> 10
<211> 648
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gagatcgtgc tgacccagtc ccctgccacc ctgagcctgt cccccggaga gagagctacc 60
ctgagctgcc gggctagcca gagcgtgagc agctatctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggccaggccc cccggctgct gatctatgac gctagcaacc gggccaccgg catccctgct 180
aagttcagcg gctccggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctggagccc 240
gaggacttcg ctgtgtacta ctgtcagcag aggtccaact ggccccctac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa gaggaccgtg gctgccccca gcgtgttcat cttccctcct 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgct agcgtggtgt gtctgctgaa taacttctat 420
cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caactcccag 480
gagtccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgagctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ctgattatga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac acaccagggc 600
ctgtccagcc ctgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctgataa 648
<210> 11
<211> 57
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattca 57
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 13
<211> 996
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gcttccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggctccct cttccaagag caccagcggc 60
ggcaccgctg ctctgggatg tctggtgaag gactacttcc ctgagcctgt gaccgtgtcc 120
tggaattccg gcgccctgac ctccggcgtg cacacattcc ctgctgtgct gcagtcctcc 180
ggcctgtata gcctgtcctc cgtggtgaca gtgcctagct ccagcctggg cacccagacc 240
tatatctgca acgtgaacca caagcctagc aataccaagg tggacaagaa ggtggagcct 300
aagagctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaact gctcggcgga 360
ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaacccct 420
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 480
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 540
agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 600
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgagaa aaccatcagc 660
aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacacac tgcctccaag cagggacgag 720
ctgaccaaga atcaggtgtc cctgacctgc ctggtcaagg gcttctaccc ttccgatatc 780
gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 840
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga cagtggacaa gagcagatgg 900
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960
cagaagtccc tgagcctgtc tcctggcaaa tgataa 996
<210> 14
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 15
<211> 57
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattca 57
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 17
<211> 327
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
aggaccgtgg ctgcccccag cgtgttcatc ttccctccta gcgacgagca gctgaagagc 60
ggcaccgcta gcgtggtgtg tctgctgaat aacttctatc ccagggaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg ataacgccct gcagagcggc aactcccagg agtccgtgac cgagcaggac 180
tccaaggaca gcacctactc cctgagctcc accctgaccc tgtccaaggc tgattatgag 240
aagcacaagg tgtatgcttg cgaggtgaca caccagggcc tgtccagccc tgtgaccaag 300
agcttcaacc ggggcgagtg ctgataa 327
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105