阅读说明：本技术 一种hao兔多克隆抗体的制备方法及应用 (Preparation method and application of HAO rabbit polyclonal antibody ) 是由 赵辰 邱志刚 王景峰 谌志强 薛斌 王尚 李辰宇 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种HAO兔多克隆抗体的制备方法,包括：通过原核表达得到HAO重组蛋白、将所得HAO重组蛋白制备成悬浮液,并对动物进行注射,2～4h后,对动物血清进行分离,得到HAO抗体及采用抗原亲和纯化的方法对HAO抗体进行纯化,得到多克隆抗体的过程,该方法制得的多克隆抗体特异性好,可直接对HAO蛋白进行检测。(The invention discloses a preparation method of an HAO rabbit polyclonal antibody, which comprises the following steps: obtaining HAO recombinant protein through prokaryotic expression, preparing the HAO recombinant protein into suspension, injecting the suspension into an animal, separating animal serum after 2-4 h to obtain an HAO antibody, and purifying the HAO antibody by adopting an antigen affinity purification method to obtain a polyclonal antibody.)

一种HAO兔多克隆抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及多克隆抗体制备技术领域，更具体地说是涉及一种Hydroxylamineoxidoreductase兔多克隆抗体的制备方法

背景技术

氨氧化菌是革兰氏阴性菌，归属于Proteobacteria门的β-Proteobacteria纲或γ-Proteobacteria纲，系统中氨氧化代谢过程受温度、氧量、碱度、基质浓度等宏观环境因素影响巨大，被认为是污水生物处理系统中最为敏感、脆弱的代谢途径，是系统稳定运行的关键环节。

硝化反应在自然界的氮循环中起着重要作用，是污水系统生物脱氮的关键反应。而亚硝化反应是整个过程的限速步骤，是由氨氧化菌(AOB)完成的，这个过程包括氨单加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)催化氨成为羟胺，以及羟胺由羟胺氧化酶(Hydroxylamine oxidoreductase,HAO)催化生成亚硝酸盐的过程；因此，HAO的表达量可以作为衡量生物脱氮系统处理能力的指标。

目前，检测HAO多采用荧光定量PCR法，但是该方法表征的是HAO基因的mRNA水平，并不能直接对HAO的蛋白表达水平进行表达，致使无法直接对HAO的表达量进行检测；而利用ELISA法，使HAO抗体与HAO抗原结合，可以直接对蛋白进行定量分析，简洁方便，准确性高；但是现有技术中，并未公开HAO抗体的制备方法。

因此，如何提供一种HAO多克隆抗体的制备方法与应用是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种HAO兔多克隆抗体的制备方法与应用，制备出的多克隆抗体可特异识别氨氧化菌ATCC 19718中的内源Hydroxylamine oxidoreductase蛋白，Hydroxylamine oxidoreductase蛋白的兔多克隆抗体的构建为氨氧化菌中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种HAO兔多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

1)制备HAO重组蛋白：通过原核表达得到HAO重组蛋白；

2)制备HAO抗体血清：将步骤1)所得HAO重组蛋白制备成悬浮液，并对动物进行注射，得到HAO抗体血清；

3)HAO多克隆抗体纯化：采用抗原亲和纯化的方法对HAO抗体血清进行纯化，得到多克隆抗体。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，将HAO重组蛋白制成悬浮液并进行注射的具体过程为：

首次免疫时，将HAO重组蛋白0.3mg与弗氏完全佐剂混合，对动物进行免疫，第二、三、四次免疫将HAO重组蛋白0.15mg与不完全弗氏佐剂混合，形成油包水的乳浊液，震荡混匀后，吸入针管进行注射。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，从动物血清中制备HAO抗体的具体过程为：

第1天常采用完全弗氏佐剂免疫动物，在第12、26、40天采用不完全弗氏佐剂进行第二、三、四次免疫，第52天处死动物采血得到抗HAO血清抗体。

一种HAO多克隆抗体的制备方法制备得到的HAO多克隆抗体在制备ELISA法检测Hydroxylamine oxidoreductase蛋白的试剂中的应用。

一种HAO多克隆抗体的制备方法制备得到的HAO多克隆抗体在制备检测HAO试剂盒中的应用。

以上技术方案达到的技术效果是：HAO多克隆抗体可以特异性识别HAO，因此，将HAO多克隆抗体制备成检测试剂或检测试剂盒，可提高HAO的检测效率和准确度。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明利用工程菌株表达、纯化得到的高纯度Hydroxylamine oxidoreductase作为抗原，通过免疫日本大耳白兔获得抗血清纯化后得到的抗体间接ELISA效价为1:512000，所述多克隆抗体可以特异识别氨氧化菌ATCC19718中的内源Hydroxylamine oxidoreductase蛋白，Hydroxylamine oxidoreductase蛋白的兔多克隆抗体的构建为氨氧化菌中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为对构建的重组质粒进行PCR的扩增示意图；

图2附图为对导入HAO基因后菌株的表达产物检测示意图，其中，目的蛋白条带为1638bp；1代表0.4mg/ml BSA电泳条带、2代表0.2mg/ml BSA电泳条带、3代表Marker条带、4代表上清条带、5代表上清2条带、6代表对包涵体2倍稀释后的电泳条带、7代表对包涵体10倍稀释后的电泳条带；

图3附图为对抗血清亲和纯化用蛋白的检测示意图；其中，1代表marker电泳条带、2代表0.4mg/ml BSA电泳条带、3代表pET-28a-SUMO-hydroxylamine oxidoreductasediluted in 5 folds的电泳条带、4代表pET-28a-SUMO-hydroxylamine oxidoreductasediluted in 10 folds的电泳条带

图4附图为HAO蛋白WB检测结果示意图；

图5-1附图为实施例4得到的多克隆抗体的效价检测示意图；

图5-2附图为实施例4得到的多克隆抗体的滴度检测示意图；

图6附图为实施例4得到的多克隆抗体的特异性检测示意图，其中1为表达菌株未诱导的电泳条带、2为表达菌株已诱导的电泳条带、3为待测样品的电泳条带；

图7附图为pET28a(+)-SUMO质粒的酶切位点示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中用到的氨氧化细菌购自美国模式培养物集存库(American typeculture collection,ATCC)，编号为ATCC 19718。

实施例1制备HAO重组蛋白

以ATCC 19718培养物为模板，以Pfu高保真DNA聚合酶(天根ep101)PCR扩增Hydroxylamine oxidoreductase 25-570个氨基酸的核酸序列，片段长度1638bp，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，参见图1；用DNA产物回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250)将目的条带切胶回收，回收产物经限制性内切酶Bam HI和XhoI酶切、经胶回收与进行同样酶切、胶回收处理的pET28a(+)-SUMO质粒片段于4℃过夜连接，转化DH5α感受态细胞(天根)，挑取克隆，经PCR鉴定和测序确认阳性后，用质粒DNA小量提取试剂盒(Axygen，AP-MN-P-250)提取质粒，进行下一步转化。将所得质粒转化至BL21感受态细胞(天根)，挑取克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中进行培养，恒温摇床37℃培养3-4小时，检测OD值至0.5-0.6之间，加入1/1000体积1M浓度的IPTG溶液(Sigma-Aldrich)诱导3-4小时，得到已经表达有目的蛋白的表达菌株。

实施例2免疫用蛋白表达鉴定

将实施例1得到的已经表达有目的蛋白的表达菌株4000rpm离心10min收集菌体弃去上清，磷酸盐缓冲液(索莱宝)重悬菌体，加入1/1000体积的β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，将菌液置于冰块中，超声波破碎仪破碎菌体，功率400W，超声时间3s间隔时间3s共10min，9000rpm离心10min，得到菌体上清液1和包涵体沉淀。将2M尿素溶液加入到沉淀中，同条件超声破碎后离心，得到上清液2和包涵体沉淀。采用8M尿素溶液溶解包涵体沉淀，12000rpm离心1min得到上清液为包涵体蛋白溶液，分别稀释2倍和10倍进行下一步检测。将上清液1和上清液2以及稀释过的包涵体蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后考马斯亮蓝染色，结果显示，该蛋白主要表达在包涵体中，浓度为5mg/ml，纯度达到免疫要求，诱导菌株表达目的蛋白成功。参见图2。

实施例3抗血清亲和纯化用蛋白检测

重复实施例1和实施例2的过程，得到包涵体蛋白溶液，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色，结果显示，蛋白浓度为2mg/ml，纯度与抗原蛋白相当，可用于抗原亲和纯化。结果见图3；

实施例4制备HAO兔多克隆抗体

一种HAO兔多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤

1)按照实施例1的方法制备HAO重组蛋白：

2)制备多克隆抗体血清：第1天采用完全弗氏佐剂+0.3mgHAO重组蛋白免疫日本大耳白兔(购于湖北省实验动物研究中心)，在第12、26、40天分别采用不完全弗氏佐剂+0.15mgHAO重组蛋白进行第二、三、四次免疫，第52天处死动物采血得到抗HAO血清抗体。

3)多克隆抗体血清纯化：采用抗原亲和纯化的方法，取2ml Sulfolink coupinggel(Thermo Fisher)于层析柱中，加入10mgHAO重组蛋白溶液，将层析柱置于旋转培养器上旋转2-3小时后静置在层析架上30分钟，连接恒流泵。顺序泵入40ml磷酸盐缓冲液、30ml100mM甘氨酸缓冲液、30ml磷酸盐缓冲液将层析柱平衡至中性。在待纯化的抗体血清中按照体积比1/20加入4M氯化钠溶液，过柱两遍，加入40ml洗液(磷酸盐缓冲液中加入320mM氯化钠)清洗一次，加入100mM甘氨酸缓冲液洗脱抗体，收集8管，每管2ml共16ml，加入透析袋混匀后，放入混有50％甘油的磷酸盐缓冲液中透析浓缩过夜，得到浓缩好的多克隆抗体。

以实施例3中的蛋白对HAO抗体进行纯化，得到多克隆抗体。

实施例5抗原蛋白WB检测

将得到的抗原蛋白取10ng、5ng、1ng和500pg进行Western Blot检测，SDS-PAGE恒压电泳2h，100mA恒流将凝胶上蛋白转移2h至PVDF膜，以实施例4中得到的多克隆抗体作为一抗(1：1000)孵育过夜，二抗Goat Anti-Rabbit IgG(Abclonal，AS070，1：5000)孵育45min，TBST(索莱宝)洗膜后显色剂(Thermo Fisher)显色后，全自动化学发光检测系统(Tanon 5500)检测，结果见图4；

实施例6多克隆抗体的效价和滴度测定

将实施例4得到的多克隆抗体，以免疫用蛋白pET-28a-SUMO-hydroxylamineoxidoreductase为抗原(200ng)包被96孔板，间接ELISA法检测效价，将得到的多克隆抗体分别进行1：1000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000及1：512000倍稀释，以免疫前血清作为对照，并对不同稀释度下的多克隆抗体进行ELISA检测，依次加入抗体、底物、显色剂，孵育后检测吸光度值，结果见图5-1、5-2，由图5-2可知，纯化后的多克隆抗体滴度为1：512000。

实施例7多克隆抗体特异性检测

以实施例1中转化得到的表达菌株(BL-21)诱导前和诱导后的全蛋白提取物、ATCC19718 Nitrosomonas europaea(ATCC 19718)的全蛋白提取物进行WB检测(提取方法见实施例1)，以纯化的多克隆抗体作为一抗(1：2000)，HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Abclone)为二抗(1：5000)，用Tanon 5200检测WB结果，结果见图6。图6结果显示，该抗体可以特异性识别内源性的Hydroxylamine oxidoreductase。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。