阅读说明：本技术 一种银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1及其应用 (Ginkgo flavonoid 3 '-hydroxylase gene GbF3' H1 and application thereof ) 是由 徐立安 吴雅琼 辛月 祁铭 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1及其应用,属于分子生物学技术领域。基因GbF3′H1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其表达的蛋白产物氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过构建基因GbF3′H1载体转化山新杨,并对转化的山新杨和非转基因型进行过量表达分析和差异代谢物分析,结果显示,与非转基因植株相比,转基因植株生长相对较慢,叶片容易沉积红色素,黄酮类化合物合成的下游产物浓度明显高于非转基因植株,表明过量表达基因GbF3′H1能够提高植物类黄酮产量,可以作为促进植物体内积累黄酮类化合物的重要参考和科学依据。(The invention discloses a ginkgo flavonoid 3 '-hydroxylase gene GbF3' H1 and application thereof, belonging to the technical field of molecular biology. The nucleotide sequence of the gene GbF3' H1 is shown as SEQ ID No.1, and the amino acid sequence of the expressed protein product is shown as SEQ ID No. 2. According to the invention, a gene GbF3'H1 vector is constructed to transform the populus deltoids, and overexpression analysis and differential metabolite analysis are carried out on the transformed populus deltoids and non-transgenic plants, and the result shows that compared with the non-transgenic plants, the transgenic plants grow relatively slowly, red pigment is easy to deposit on leaves, the concentration of downstream products synthesized by flavonoids is obviously higher than that of the non-transgenic plants, and the overexpression gene GbF3' H1 can improve the yield of plant flavonoids, and can be used as an important reference and scientific basis for promoting the accumulation of flavonoids in plants.)

一种银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地说，涉及一种银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1及其应用。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba)是银杏科唯一的现存物种，常被认为是“活化石”。它起源于约3亿年前的二叠纪，在植物界具有重要的进化地位。此外，银杏是一种多用途树种，尤其是药用价值备受关注。银杏叶提取物(GBE)，因能治疗早期阿尔茨海默症、脑功能障碍和血管性痴呆而受到广泛的关注。GBE中黄酮类化合物是目前银杏叶中最为突出的药理成分。黄酮类化合物是一系列具有典型的C₆-C₃-C₃-C₆类黄酮骨架的化合物，由两个芳香环通过C3连在一起。黄酮类化合物是植物组织中最著名的红、蓝、紫三色花青素色素。在类黄酮途径的早期，查尔酮通过异构化和氧化被修饰为二氢黄酮醇。在大多数植物中，二氢黄酮醇(二氢山奈酚、二氢槲皮素、二氢杨梅素)是类黄酮生物合成途径中的一个主要分支点，后续反应可以通过糖基化反应生成二氢黄酮醇苷，通过氧化反应生成黄酮醇或花青素，通过还原反应生成黄烷-3-醇(儿茶素，没食子儿茶素)。

目前，类黄酮生物合成途径产生的黄酮类化合物的形成和积累在拟南芥中已被得到很好地研究，相关酶和基因也在不同的物种中得到了广泛的研究。类黄酮3′-羟化酶(flavonoid 3′-hydroxylase，F3′H)是类黄酮生物合成途径中的关键酶。它是细胞色素P450亚家族的重要成员之一，具有催化多种依赖NADPH和O₂为基础的单加氧反应。在类黄酮生物合成途径中，F3′H将柚皮苷和二氢山奈酚B环的3′-位羟基化生成黄酮类化合物，并领导了红氰化物基颜料的生产。目前已经从矮牵牛、拟南芥、大豆和葡萄等植物中分离鉴定了F3′H基因。此外，Shih et al.(2006)过量表达高粱的SbF3′H得出黄酮醇生物合成的大多数前体被转化变成3′-羟基化的形式。Han et al.(2010)在拟南芥tt7突变体中检测到苹果愈伤组织MdF3′H基因的异位表达促进了花青素的积累。由此可见，F3′H具有广泛的作用特异性，对下游类黄酮(花青素)代谢物的合成有重大影响。因此，获得和分析黄酮合成通路中关键酶基因，将为进一步了解黄酮类化合物在植物体内积累的分子机制提供重要参考和科学依据。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种银杏类黄酮3′-羟化酶GbF3′H1基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述银杏类黄酮3′-羟化酶GbF3′H1基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

所述的银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1的载体。

优选地，所述载体为35S：：GbF3′H1。

所述的银杏类黄酮3′-羟化酶GbF3′H1基因或所述的载体在提高植物类黄酮的产量中的应用。

优选地，所述的应用，包括以下步骤：(1)构建所述的载体；(2)将所构建的载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到植物类黄酮表达量高的植株。

优选地，所述的植物类黄酮为表没食子儿茶素、没食子儿茶素或儿茶素。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

(1)首次克隆获得了银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1的cDNA序列，通过生物信息学分析和时空表达分析，揭示了银杏类黄酮3′-羟化酶GbF3′H1系统进化地位和在银杏中表达的特点，结果显示，在银杏叶中和4、9月中该基因表达量较高；

(2)本发明进行了银杏类黄酮3′-羟化酶基因GbF3′H1亚细胞定位和植物体内功能分析，及其转基因杨树和非转基因杨树的表型观察和代谢物含量测定分析。GbF3′H1-GFP蛋白主要在细胞质中发出GFP信号，为其在植物生物学过程中的作用提供线索。qRT-PCR分析表明转基因杨树该基因的表达量最高可达非转基因苗的5162倍。此外，与非转基因植株相比，转化的植株生长较慢，叶片容易沉积红色素，黄酮类化合物合成的下游产物浓度明显高于非转基因植株，表明过量表达基因GbF3′H1能够提高植物类黄酮产量，因此，该基因可以作为促进植物体内积累黄酮类化合物的重要参考和科学依据。

附图说明

图1为GbF3′H1蛋白的结构特征及系统发育分析图；A.推导出的GbF3′H1与其他物种F3′Hs蛋白的序列比对，序列中这些蛋白的Genbank登录号如下：Taxus chinensis(ATG29929.1)，Picea sitchensis(ABR16821.1)，Corchorus olitorius(OMO79261.1)，Epimedium sagittatum(ADE80941.1)，Cephalotus follicularis(GAV84063.1)，Vitisamurensis(ACN38268.1)，Vitis vinifera(BAE47003.1)，Cichorium intybus(ACN65825.1)，Chromolaena odorata(AEA06595.1)，Cosmos sulphureus(ACO35752.1)，and Dahlia pinnata(ADB77826.1)；B.采用极大似然法构建F3′Hs蛋白的分子系统发育树；

图2为qRT-PCR检测GbF3′H1基因的时空表达规律图；R、S、L、K、B和P分别为根、茎、叶、果仁、芽和叶柄，时间表达模式4、5、6、7、8、9、10分别代表4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月；误差条表示三个生物学复制的偏差，不同字母的均值差异有统计学意义(p＜0.05)；

图3为GbF3′H1蛋白的亚细胞定位及过量表达分析图；A.GbF3′H1蛋白亚细胞定位分析：GFP：绿色荧光；Auto：自发荧光；Merged 1：GFP+Auto；Merged 2：Merged 1+bright.标尺：10μm.B.GbF3′H1基因在转基因植物中的表达水平；WT：非转基因杨树，L1-L8：转基因株系1-8；

图4为转基因苗的生长状况和表型变化图；

图5为非转基因杨树与GbF3′H1转基因杨树组中重要的3种差异类黄酮代谢物的含量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料：以1年生银杏幼苗(叶、茎、根、叶柄)和25年生银杏(核、芽)为材料，进行银杏该基因的组织表达实验。以1年生银杏幼苗为试验材料，在不同的叶片发育阶段，从4月到10月每月采集一次叶片。收集后，将植物材料快速冷冻在液氮中，置于-80℃的超低温冰箱中。每个取样点进行三次生物学重复试验。此外，无性系山新杨(Populus davidiana×Populusbolleana)组培苗在16h光照和8h暗光周期下和25℃(白天)和18℃(夜晚)条件下进行生长。

实施例1：GbF3′H1基因克隆及生物信息学分析

采用植物基因组DNA试剂盒Plant Genomic DNA Kit(cetyltrimethylammoniumbromide(CTAB))(Zoman，Beijing，China)进行银杏DNA的提取。采用RNAprep Pure Plantkit(Polysaccharides&Polyphenolics-rich，TIANGEN，Beijing，China)从银杏叶中提取总RNA。基于银杏转录组数据(NCBI Short Reads Archive(SRA)database under accessnumber SRP137637)设计GbF3′H1基因的特异性引物，利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆GbF3′H1全长cDNA序列。嵌套引物设计用于扩增全长cDNA采用SMARTer RACE 5’/3’Kit(Clontech，Palo Alto，CA，USA)试剂盒。所有引物均采用Oligo 6.0软件设计(表1)。

表1 GbF3′H1基因克隆引物

通过PCR扩增，切胶回收纯化，经pMD19-T载体转入大肠杆菌感受态细胞。采用PCR检测菌落，选择阳性菌落进行Sanger测序。通过拼接5′和3′-RACE序列得到GbF3′H1的全长，并利用NCBI ORF Finder预测开放阅读框。之后，GbF3′H1 ORF在以下程序中PCR扩增：95℃反应3min；35循环下的95℃30s，55℃40s，72℃90s；最后在72℃反应10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段经纯化回收，然后将目标片段连接到pMD19-T载体上，转化到大肠杆菌TOP 10中。取单菌落进行培养。筛选阳性克隆送Sanger测序，获得GbF3′H1基因ORF序列。

利用ExPASy ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)对其理化性能进行预测。利用在线SOPMA软件对GbF3′H1基因的二级结构进行预测。利用在线BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)工具获得同源比对的相似序列。利用DNAMAN软件对推导出的GbF3′H1氨基酸序列和F3′Hs同源蛋白序列进行多重比对。此外，采用极大似然法，分析F3′Hs氨基酸序列，并利用MEGA7.0软件进行1000次自举构建系统发育树。

GbF3′H1基因克隆测序的结果如核苷酸和氨基酸序列表所示，GbF3′H1基因的全长cDNA为1907bp(SEQ ID No.1)，其中1560bp的ORF编码了520个氨基酸(SEQ ID No.2)。生物信息学预测GbF3′H1的理论等电点(pI)为7.76，假定分子量是58107.32，亲水性的总平均值为-0.113。此外，二级结构分析表明，GbF3′H1蛋白含有49.23％的α螺旋、34.62％的无规则卷曲和10.77％的延伸链。

NCBI BLASTn分析表明，基于保守结构和序列特征可知该基因序列与其他植物的F3′Hs基因具有高度同源性(图1A)。氨基酸序列比较表明，不同物种的N端前30个左右的氨基酸存在差异。不同物种F3′Hs蛋白之间存在三种常见的序列“PPGP”、“AGTDT”和“FGAGRRICAG”。此外，利用NCBI BLASTp检索GbF3′H1完整ORF，结果表明，GbF3′H1基因的功能域分析属于细胞色素P450超家族。

为了得到GbF3′H1与其他植物F3′Hs的进化关系，根据GbF3′H1和其他11个不同植物F3′Hs的氨基酸序列，构建了系统发育树(图1B)。结果表明，GbF3′H1与中国红豆杉和云杉的亲缘关系最为密切，属于裸子植物。其他F3′Hs蛋白属于被子植物，相同科的植物聚在一起，符合生物学分类特征。

实施例2：实时荧光定量PCR分析银杏GbF3′H1基因表达

为了检测GbF3′H1基因的转录和表达水平，进行qRT-PCR分析。用RNAprep植物试剂盒(TIANGEN，Beijing，China)提取总RNA，然后用PrimeScript^TM RT Master Mix(TAKAEA，Dalian，China)转录总RNA。将cDNA作为模板稀释5倍。设计用于GbF3′H1基因qRT-PCR扩增的引物和内参基因引物见表2。

表2 GbF3′H1的qRT-PCR引物和内参基因引物

在ABI ViiA 7 Real-time PCR platform使用FastStart Universal SYBR GreenMaster with ROX for RT-PCR Kit(Roche，Indianapolis，IN，USA)进行qRT-PCR分析。10μL反应体系和PCR反应程序如下：95℃反应2min；40循环下的95℃15s和95℃1min。每个样品制备三个生物重复，采用2^-ΔΔCt方法计算相对表达水平。利用SPSS 22.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行邓肯多重检验，p值＜0.05有统计学意义。

不同组织表达模式的结果(图2A)表明，GbF3′H1在银杏各组织中(除根以外)均有不同的表达水平。其中，在叶片中的表达量最高，其次是叶柄。种仁中的表达量最低。这说明GbF3′H1主要在叶片中表达。为了进一步探索GbF3′H1在不同时期的表达规律，我们测定了GbF3′H1在银杏叶(4-10月)中的转录水平，发现该基因在4月和9月的表达量明显高于其他时期(图2B)。

实施例3：GbF3′H1在杨树中的亚细胞定位及过表达分析

利用Gateway技术(Invitrogen，CA，Carlsbad)构建过量表达载体，将GbF3′H1基因ORF克隆到入门载体pCR8/GW/TOPO vector(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，经过阳性克隆PCR检测及测序验证，将带有的GbF3′H1基因的入门载体与植物表达载体PBI121进行LR反应。通过PCR检测及测序验证后，确认过量表达载体构建成功，命名为35S：：GbF3′H1。将35S：：GbF3′H1导入农杆菌菌株EHA105中进行转化。利用山新杨(以下简称杨树)稳定和高效的遗传转化体系，将银杏的GbF3′H1基因转基因到杨树中。采用卡那霉素抗性筛选后，我们随机选择了非转基因杨树和8个转基因杨树株系叶片进行qRT-PCR测定。此外，我们还观察了同一时期转基因苗和非转基因苗的生长状况和表型变化，包括不定芽生长、幼苗强化和根系生长阶段。

亚细胞定位的方法：将不含终止密码子的GbF3′H1编码区域克隆到载体pCR8/GW/TOPO vector(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，进行简单的TOPO克隆反应。对标记蛋白的亚细胞定位，使用LR克隆酶将***物GbF3′H1片段从入门载体转移到目的载体(p2GWF7)，并在***物的C端放置绿色荧光蛋白GFP标记。生成的GFP融合载体(35S：：GbF3′H1-GFP)为双35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子驱动的高拷贝载体，以氨苄青霉素为细菌选择筛选标记。原生质体分离和PEG介导转染参照Tan et al.(2013)所述。所有荧光实验均独立重复三次。具体的实验操作步骤为：(1)杨树叶肉原生质体的分离与纯化。首先配制酶液：向10mL的无菌管中加入500μL 200mM的MES溶液、3.75mL 0.8M的甘露醇、500μL 0.2M的KCL溶液和75μL灭菌的超纯水。然后70℃水浴3-5min，趁热加入纤维素酶100μL，果胶酶25μL。55℃水浴10min，将10mL管置于冰上冷却至室温。再加入50μL的1M CaCl₂，牛血清蛋白0.005g，混匀后用0.45mm的过滤膜灭菌至小烧杯中。挑选生长30天左右、状态良好的杨树组培苗，选择平展、幼嫩的叶片4-6片，去中脉，将叶片切成细丝放入配制好的酶液中，避光28℃酶解3h。同时配制30％的PEG溶液：向10mL的无菌管中加入1.25mL 0.8M的甘露醇、0.5mL 1M的CaCl₂溶液、2mL ddH₂O和1.5g的PEG4000。大力摇匀后使用0.45mm过滤膜灭菌至10mL管中。预冷W5溶液后缓缓加入酶解液中，轻轻摇匀，用细胞筛将酶解液过滤至50mL圆底离心管中，然后900rpm4℃离心5min，弃上清。向离心管中缓加入1-2mL W5溶液，重悬细胞轻摇匀。然后使用血球计数板计数，并用W5溶液将原生质体浓度稀释至6×10⁵个/mL。将离心管避光置于冰上30min，待原生质体沉入管底。弃上清，使用等量的MMG溶液重悬细胞。(2)PEG介导法转化原生质体。向2mL离心管中加入10μL的目基因载体质粒(10μg)和100μL已经分离纯化的杨树叶肉原生质体，轻柔混匀。加入110μL 30％PEG轻弹混匀，室温静置15min后加入1mL室温的W5溶液以终止反应，轻柔颠倒离心管使之混匀。1000rpm，室温水平离心5min，吸取上清液，加入100μL室温的0.6m WI溶液，轻柔重悬原生质体。25℃黑暗培养16-24h后使用荧光显微镜观察实验结果。

亚细胞定位结果表明，GbF3′H1-GFP蛋白在杨树叶片原生质体中瞬时表达。它主要在细胞质中发出GFP信号，为其在植物生物学过程中的作用提供了一些线索(图3A)。为了进一步获知GbF3′H1的功能，我们对获得的多个35S：：GbF3′H1转基因株系进行PCR验证。之后，我们随机选择了8个转基因株系，用qRT-PCR检测GbF3′H1的表达水平。qRT-PCR分析表明，转基因苗的表达量高于非转基因苗(图3B)。在这8个转基因株系中，转基因杨树L7的表达量最高，是非转基因苗的5162倍，其次是L1和L5(图3B)。

为了确定GbF3′H1基因过量表达是否影响转基因植株的生长，我们将转染后的对照叶片置于愈伤组织诱导培养基上，观察再生植株的生长结果。我们观察到转基因植株在不定芽生长、幼苗强化和根系生长阶段的生长速度比非转基因苗慢(图4A)。为了进一步进行表型比较分析，选择非转基因苗和转基因株系7进行观察，发现表达量最高的转基因苗7号株系的叶片在不同时期都存在轻度红色色素沉着(图4B，C，D)。

实施例4：非靶向代谢组分析转基因杨树和非转基因杨树

(1)样品处理

1.每个植物样本精密称取60mg，放入1.5mL的离心管中，加入40μL内标(L-2-氯-苯丙氨酸，0.3mg/mL，甲醇配置)；

2.依次加入两颗小钢珠，360μL的冷甲醇，在-20℃冰箱中放置2min；

3.放入研磨机中研磨(60Hz，2min)；

4.冰水浴超声提取30min；

5.加入200μL的氯仿，漩涡机中涡旋(60Hz，2min)，加入400μL的水，漩涡机中涡旋(60Hz，2min)；

6.冰水浴超声提取30min；

7.-20℃静置30min；

8.低温离心10min(13000 rpm，4℃)，取300μL的上清液装入玻璃衍生瓶中；

9.质控样本(QC)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC的体积与样本相同；

10.用离心浓缩干燥器挥干样本。

11.向玻璃衍生小瓶中加入80μL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液(15mg/mL)，涡旋震荡2min后，于震荡培养箱中37℃中90min进行肟化反应。

12.将样本取出后再加入80μL的BSTFA(含1％TMCS)衍生试剂和20μL的正己烷，加入11种内标(C8/C9/C10/C12/C14/C16，0.8mg/mL；C18/C20/C22/C26/C28，0.4mg/mL，均为氯仿配置)10μL，涡旋震荡2min后，于70℃反应60min。

13.取出样本后，在室温放置30min，进行气相色谱-质谱(GC-MS)代谢组分析。

(2)气相色谱-质谱分析条件

色谱条件：DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent J&W Scientific，Folsom，CA，USA)，载气为高纯氦气(纯度不小于99.999％)，流速1.0mL/min，进样口的温度为260℃。进样量1μL，分流进样比为4∶1，溶剂延迟5min。

程序升温：柱温箱的初始温度为60℃，以8℃/min程序升温至125℃，5℃/min升温至210℃；10℃/min升温至270℃，20℃/min升温至305℃保持5min。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围：m/z 50-500。

(3)差异代谢物筛选

采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异代谢产物。正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA)中，变量权重值可用来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物意义的差异代谢物，一般以VIP＞1的代谢物被认为是差异代谢物。进一步利用t检验(student’s t test)进行验证组间差异代谢物是否具有显著性。筛选的标准为OPLS-DA模型第一主成分的VIP值＞1，p值＜0.05。其中，变化倍数为代谢物在两组中的平均含量的比值。

通过定性定量和分析得到199种不同的代谢物。通过多维和单维分析，筛选出非转基因组与GbF3′H1转基因组间含有112个差异代谢物。其中，与非转基因组相比，有93个显著上调的差异代谢物和19个显著下调的差异代谢产物。通过对112个差异代谢物进行分类，发现有3种黄烷类代谢物(黄酮类化合物合成的下游产物)，即表没食子儿茶素(epigallocatechin)、没食子儿茶素(gallocatechin)和儿茶素(catechin)。并且这些黄烷类代谢物在转基因植株中(表没食子儿茶素、没食子儿茶素和儿茶素)的浓度明显高于非转基因植株，依次分别约为2.7，2.3和1.9倍(图5)。由此，可见过量表达银杏类黄酮3′-羟化酶GbF3′H1可提高转基因植物类黄酮的产量。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种银杏类黄酮3'-羟化酶基因GbF3'H1及其应用

<130> 100

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1907

<212> DNA

<213> Ginkgo biloba

<400> 1

atacagagag agaggtactg caattcatat gaatataggg aggtattgca ctttattgtg 60

atcacaattc caaatcgcca tggctggcat ggtctctggc cctcatgatc tcttggattc 120

tcttgcaatt aacagggttt ggttgttgat gagtgtgttg ggtgtggtgg gggtaattgg 180

gtacgttata agtggcatga ggaggaggag gaagaggttg ccaccggggc catcaggatg 240

gccagtgatg ggaaacctgc cgctgctggg aaaaatgcct caccattccc tgcaccgtct 300

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ttcctcaccc ggcatagcca aagagtttct gaagacgaac gatgccaatt tcgccaacag 420

gccgggaaac gcaggggcca agtacatggc ctacgactcc aacgatttgg tgtgggctcc 480

ctacggcccc cgctggagaa tgctgcgcaa agtgtgcaac attcacctct tcgcaggaaa 540

ggctctggac gatttccagg cggtgaggga agaggaggtg aggcttatgg tcacgtctat 600

tgcacaacat caacgtcaag gccagggcgc cgttaacctc ggggaggtgc tcaatgtctg 660

cacggccaac gtgttgggcc agataatgct gagcaagcga gtgttcgaat ctcaaggatc 720

ggaggccggc gagttcagag agatggtgct ggagctcatg gtgttggccg gcgtcttcaa 780

catcggagac ttcgtgccgt ccttggcgtg gatggatttg cagggcgtgc aggccaagat 840

gaagaaactc caccaacgct tcgacgactt cttcggcaga atactgcgcg aacaccaaaa 900

cggccacggg tccccggccg actttctcag tgtgcttttg tctctcagaa acaatgccga 960

tggcgaaggc gggcagctca cggacaccga catgaaggct cttctgctgg atttgttcac 1020

ggcgggaaca gatacgtcat ccagtacggt cgaatgggcg attacagagc tcatccggca 1080

cccagatatg atggcaaaat gtcgggacga aatcgatacc gttgtgggtc ggacgaggaa 1140

gctgaaagaa gccgacatcc aaaatctaag ctatttgcag gcggttgtga aagaaacatt 1200

caggctgcat ccgtccactc cgcttctcct tccacgtatg gcaggagaag cgtgcgaagt 1260

gggaggatac cacatcccga aggacacccg gctaatggtg aacgtgtggg gcatgggacg 1320

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tacgcatatt gacatgaggg gtacggattt cgagctgatt ccttttgggg caggcaggcg 1440

catctgtgca ggcttcaaca tgggtatcag aatggtccaa ttcatgctcg ccactctcct 1500

ccattccttc gactggtctc ttcccgatgg ccagactccc cagacgctca acatggagga 1560

ggctttcggt atcactctcc agagggctgt gcctcttctt gtcttgcctt ctcctcgctt 1620

gccggcccat ctctaccagt aagaaaactg agacgccggt ggttggagat aagtctttcc 1680

gaatcagata cctctgttaa tcgtaccagt acaatagtca tatcaccatt agccttggtg 1740

tttgtccatt aaatttgtct cgttatgcac ctcggcggag tttctgctta tgagcaaaat 1800

tgttttaaac ctttttgttt tgtttcaaac ttttgtaccc gtagttctac tatattatga 1860

ttttgttttg ttttgtttca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1907

<210> 2

<211> 520

<212> PRT

<213> Ginkgo biloba

<400> 2

Met Ala Gly Met Val Ser Gly Pro His Asp Leu Leu Asp Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ile Asn Arg Val Trp Leu Leu Met Ser Val Leu Gly Val Val Gly Val

20 25 30

Ile Gly Tyr Val Ile Ser Gly Met Arg Arg Arg Arg Lys Arg Leu Pro

35 40 45

Pro Gly Pro Ser Gly Trp Pro Val Met Gly Asn Leu Pro Leu Leu Gly

50 55 60

Lys Met Pro His His Ser Leu His Arg Leu Ala Arg Gln Phe Gly Pro

65 70 75 80

Ile Met Tyr Leu Lys Leu Gly Thr Thr His Thr Val Val Ala Ser Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Ala Lys Glu Phe Leu Lys Thr Asn Asp Ala Asn Phe Ala

100 105 110

Asn Arg Pro Gly Asn Ala Gly Ala Lys Tyr Met Ala Tyr Asp Ser Asn

115 120 125

Asp Leu Val Trp Ala Pro Tyr Gly Pro Arg Trp Arg Met Leu Arg Lys

130 135 140

Val Cys Asn Ile His Leu Phe Ala Gly Lys Ala Leu Asp Asp Phe Gln

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Glu Glu Val Arg Leu Met Val Thr Ser Ile Ala Gln

165 170 175

His Gln Arg Gln Gly Gln Gly Ala Val Asn Leu Gly Glu Val Leu Asn

180 185 190

Val Cys Thr Ala Asn Val Leu Gly Gln Ile Met Leu Ser Lys Arg Val

195 200 205

Phe Glu Ser Gln Gly Ser Glu Ala Gly Glu Phe Arg Glu Met Val Leu

210 215 220

Glu Leu Met Val Leu Ala Gly Val Phe Asn Ile Gly Asp Phe Val Pro

225 230 235 240

Ser Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Val Gln Ala Lys Met Lys Lys

245 250 255

Leu His Gln Arg Phe Asp Asp Phe Phe Gly Arg Ile Leu Arg Glu His

260 265 270

Gln Asn Gly His Gly Ser Pro Ala Asp Phe Leu Ser Val Leu Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Asn Asn Ala Asp Gly Glu Gly Gly Gln Leu Thr Asp Thr Asp

290 295 300

Met Lys Ala Leu Leu Leu Asp Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser

305 310 315 320

Ser Ser Thr Val Glu Trp Ala Ile Thr Glu Leu Ile Arg His Pro Asp

325 330 335

Met Met Ala Lys Cys Arg Asp Glu Ile Asp Thr Val Val Gly Arg Thr

340 345 350

Arg Lys Leu Lys Glu Ala Asp Ile Gln Asn Leu Ser Tyr Leu Gln Ala

355 360 365

Val Val Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Ser Thr Pro Leu Leu Leu

370 375 380

Pro Arg Met Ala Gly Glu Ala Cys Glu Val Gly Gly Tyr His Ile Pro

385 390 395 400

Lys Asp Thr Arg Leu Met Val Asn Val Trp Gly Met Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Asp Val Trp Glu Lys Pro Leu Glu Phe Asp Pro Asp Arg Phe Trp Leu

420 425 430

Gln Asn Thr His Ile Asp Met Arg Gly Thr Asp Phe Glu Leu Ile Pro

435 440 445

Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Phe Asn Met Gly Ile Arg

450 455 460

Met Val Gln Phe Met Leu Ala Thr Leu Leu His Ser Phe Asp Trp Ser

465 470 475 480

Leu Pro Asp Gly Gln Thr Pro Gln Thr Leu Asn Met Glu Glu Ala Phe

485 490 495

Gly Ile Thr Leu Gln Arg Ala Val Pro Leu Leu Val Leu Pro Ser Pro

500 505 510

Arg Leu Pro Ala His Leu Tyr Gln

515 520

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> GbF3'H1_5'OUTER F引物序列(Artificial)

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ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> GbF3'H1_5'OUTER R 引物序列(Artificial)

<400> 4

ctccaacggc ttttcccaca cg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> GbF3'H1_5'INNER F引物序列(Artificial)

<400> 5

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> GbF3'H1_5'INNER R引物序列(Artificial)

<400> 6

caccatctct ctgaactcgc 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> GbF3'H1_3'OUTER F引物序列(Artificial)

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gacgatttcc aggcggtgag gg 22

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<212> DNA

<213> GbF3'H1_3'OUTER R引物序列(Artificial)

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actctgcgtt gataccactg cttgccctat agtgagtcgt attag 45

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<212> DNA

<213> GbF3'H1_3'INNER F引物序列(Artificial)

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ggcgagttca gagagatgg 19

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<212> DNA

<213> GbF3'H1_3'INNER R引物序列(Artificial)

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gccctatagt gagtcgtatt ag 22

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<212> DNA

<213> GbF3'H1_qPCR F引物序列(Artificial)

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tgagtgtgtt gggtgtggtg 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> GbF3'H1_qPCR R引物序列(Artificial)

<400> 12

actgtgtgtg tggtgccga 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> Ginkgo内参基因 F引物序列(Artificial)

<400> 13

ggtgccaaaa aggtggtcat 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> Ginkgo内参基因 R 引物序列(Artificial)

<400> 14

caacaacgaa catgggagca t 21