群体感应信号分子DSF降解基因fadT及和编码的降解酶FadT及其应用
阅读说明：本技术 群体感应信号分子DSF降解基因fadT及和编码的降解酶FadT及其应用 (Quorum sensing signal molecule DSF degradation gene fadT, encoded degradation enzyme FadT and application thereof ) 是由 陈少华 许旭丹 叶田 张文平 周田 张炼辉 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种群体感应信号分子DSF降解基因fadT,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明从贪铜菌(Cupriavidus pinatubonensis)菌株HN-2中克隆得到了一种新的负责脂肪酸降解的基因-DSF降解酶编码基因fadT。该编码基因fadT在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)中表达后,能够显著降低Xcc的致病力,对Xcc引起的黑腐病有显著的防治效果。(The invention discloses a quorum sensing signal molecule DSF degradation gene fadT, the nucleotide sequence of which is shown in SEQ ID NO. 1. The invention clones a new gene responsible for fatty acid degradation, namely DSF degrading enzyme coding gene fadT from a cuprianus cupriaefolius (cupriavidius pinatubonensis) strain HN-2. The coding gene fadT can obviously reduce the pathogenicity of Xcc after being expressed in Xanthomonas campestris wild rape pathogenic variants (Xcc), and has obvious prevention and treatment effect on black rot caused by Xcc.)
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及基因fadT在防治植物黑腐病方面的应用。
背景技术
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)引起植物的黑腐病。黑腐病是一种世界性的植物病害，该病主要影响植物在任何生长阶段的地上部分，造成严重的产量损失。所有十字花科蔬菜，包括小白菜、花椰菜、大白菜、萝卜、花椰菜、羽衣甘蓝、芦笋、芥菜和芜菁，都容易受到Xcc的侵染而患黑腐病。
Xcc通过一种可扩散的信号分子(Diffusible Signal Factor，DSF，又称群体感应信号分子DSF)的积累来表达致病性基因，从而引起植物黑腐病的发生。DSF家族成员的信号与细菌的胞外酶形成、胞外多糖形成和病原体的抗生素耐受性密切相关。DSF是一种脂肪酸分子，其化学结构为顺11-甲基-2-十二烯酸，是一个广泛保守的群体感应信号家族的代表，参与调节各种革兰氏阴性细菌产生毒性因子。DSF不仅存在于所有黄单胞菌(Xanthomonassp.)中，而且广泛存在于各种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)和各类海洋细菌中。然而，目前对黑腐病的防治手段主要是化学农药和抗生素，化学农药和抗生素的使用易使致病菌产生抗药性，甚至是多重抗药性。此外，农药的不合理使用或滥用会带来农药残留和环境污染、生态平衡破坏、食品安全和人类健康威胁等一系列安全问题。因此，开发一种高效、环境友好，且不产生耐药性的防治植物黑腐病的方法具有重要的意义和生态效益。
发明专利ZL 201810997336.8公开了一种贪铜菌(Cupriavidus pinatubonensis)菌株HN-2，能够降解DSF、防治植物黑腐病。但是其防治机理还不清楚。另外生防菌因为存在退化的问题，需要不断的充实菌库，需要大量的工作，而且生防菌在防治病菌的同时，可能也对植物与环境等产生负面影响。因此对于淬灭信号分子、防治相关致病菌的手段，除了降解菌，还有降解酶的方法，而降解酶相对于降解菌来说，其优势在于不会产生降解菌所带来的对植物或环境可能存在的负面影响或不可控因素，而且可以利用更简单的基因工程等现代技术手段实现。如现有专利(申请号为201910731498.1)公开了DSF群体感应信号降解基因dig1、dig2、dig3和dig4，这些降解基因在降解DSF家族信号中能够广泛应用。但是，该专利表明将筛选到的降解基因在致病菌内表达后，也只是部分抑制了菌株的致病力，并不是十分有效的降解DSF的基因。因此，寻找对致病菌的致病力有更好抑制效果，且能高效降解DSF的基因和降解酶尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是利用种群体感应信号分子DSF降解基因fadT/酶实现对植物黑腐病的生物防治。本发明中，导入fadT目的基因重组菌与植物共生，能有效防止Xcc菌所致的植物黑腐病的发生。
本发明的目的是提供一种群体感应信号分子DSF降解基因fadT。
本发明的另一目的是提供一种群体感应信号分子DSF降解基因fadT编码的降解酶FadT。
本发明的另一目的是提供一种重组质粒。
本发明的另一目的是提供一种重组微生物。
本发明的另一目的是提供群体感应信号分子DSF降解基因fadT，或其编码的降解酶FadT，或含有基因fadT序列或其片段的重组质粒，或含有所述重组质粒转化获得的重组微生物在防治植物黑腐病方面的应用或在制备防治植物黑腐病的产品方面的应用。
本发明的另一目的是提供群体感应信号分子DSF降解基因fadT，或其编码的降解酶FadT，或含有基因fadT序列或其片段的重组质粒，或含有所述重组质粒转化获得的重组微生物在降解群体感应信号分子DSF或防治群体感应信号分子DSF介导致病的致病菌方面的应用。
本发明的另一目的是提供一种防治植物黑腐病的药物。
本发明的另一目的是提供一种防治植物黑腐病的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明利用全基因组测序方法，通过对贪铜菌(Cupriavidus pinatubonensis)菌株HN-2基因组特征分析及基因功能基因注释，在脂肪酸代谢途径相关基因中寻找菌株HN-2中可能存在的能降解DSF的基因以及相应蛋白；利用基因敲除方法构建相关基因突变体进行验证，找到高效的降解DSF的基因fadT和降解DSF的酶FadT。因此，要保护以下技术方案：
一种群体感应信号分子DSF降解基因fadT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述的降解基因fadT编码的降解酶FadT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组质粒，包含上述的编码基因fadT或其片段，或能够表达上述的降解酶FadT。
一种重组微生物，能够表达上述的编码基因fadT或其片段，或能够表达上述的降解酶FadT。
上述的基因fadT、酶FadT、重组质粒或重组微生物在防治植物黑腐病方面的应用或在制备防治植物黑腐病的产品方面的应用。
上述的基因fadT、酶FadT、重组质粒或重组微生物在降解群体感应信号分子DSF或防治群体感应信号分子DSF介导致病的致病菌方面的应用。
一种防治植物黑腐病的药物，含有上述的基因fadT序列或其片段的重组质粒，或含有上述重组质粒转化获得的重组菌。
一种防治植物黑腐病的药物，含有上述的酶FadT，或含有编码酶FadT蛋白的开放阅读框的重组质粒，或含有表达酶FadT的重组菌。
其中，优选地，所述的重组质粒为pGEX-fadT，所述的重组菌为Escherichia coilBL21/pGEX-fadT。
一种防治植物黑腐病的方法，包括如下步骤：
(1)构建含有上述基因fadT序列或其片段的重组菌，或能够表达上述酶FadT的重组菌；
(2)将(1)中重组菌接种植物。
其中，优选地，所述的重组菌为Escherichia coil BL21/pGEX-fadT；
其中，优选地，所述的重组菌为菌液状态，浓度为5～7×108CFU/mL。
本发明具有以下有益效果：
(1)该编码基因fadT在病原菌Xcc中表达后，能够显著降低病原菌Xcc的致病力，对Xcc引起的黑腐病有显著的防治效果。
(2)防治植物黑腐病不需要化学药物(减少农药的使用)，植物不会产生耐药性，对环境友好。
附图说明
图1基因fadT对萝卜黑腐病的生防效果验证结果；其中，(A)图为萝卜用野油菜黄单胞菌Xcc接种；(B)图为萝卜用野油菜黄单胞菌Xcc+野生型HN-2接种；(C)图为萝卜用野油菜黄单胞菌Xcc+突变体ΔfadT接种；(D)图为萝卜用无菌水接种。
图2是酶FadT的表达与纯化结果；其中，M代表Marker，1代表未加入IPTG诱导剂得到的重组蛋白FadT，7代表加入IPTG诱导剂得到的上清。
图3是对DSF降解酶FadT对萝卜黑腐病的生防效果测定结果；其中，(A)图为萝卜用野油菜黄单胞菌Xcc接种；(B)图为萝卜用野油菜黄单胞菌Xcc+野生型HN-2接种；(C)图为萝卜用野油菜黄单胞菌Xcc+突变体ΔfadT接种；(D)图为萝卜用野油菜黄单胞菌Xcc+回补体ΔfadT(fadT)接种；(E)图为萝卜用转入了fadT基因的野油菜黄单胞菌Xcc(fadT)接种；(F)图为萝卜用无菌水接种。
图4是对DSF降解酶FadT对白菜黑腐病的生防效果测定结果；其中，(A)图为白菜用野油菜黄单胞菌Xcc接种；(B)图为白菜用野油菜黄单胞菌Xcc+野生型HN-2接种；(C)图为白菜用野油菜黄单胞菌Xcc+突变体ΔfadT接种；(D)图为白菜用野油菜黄单胞菌Xcc+fadT基因回补体ΔfadT(fadT)；(E)图为白菜用转入了fadT基因的野油菜黄单胞菌Xcc(fadT)接种；(F)图为白菜用无菌水接种。
图5是对DSF降解酶FadT对上海青黑腐病的生防效果测定结果；其中，(A)图为上海青用野油菜黄单胞菌Xcc接种；(B)图为上海青用野油菜黄单胞菌Xcc+野生型HN-2接种；(C)图为上海青用野油菜黄单胞菌Xcc+突变体ΔfadT接种；(D)图为上海青用野油菜黄单胞菌Xcc+回补体ΔfadT(fadT)接种；(E)图为上海青用转入了fadT基因的野油菜黄单胞菌Xcc(fadT)接种；(F)图为上海青用无菌水接种。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中用到的贪铜菌(Cupriavidus pinatubonensis)菌株HN-2，该菌株在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为：GDMCC 60432(ZL 201810997336.8)。
实施例1贪铜菌(Cupriavidus pinatubonensis)菌株HN-2的全基因组测序分析
本实施例采用全基因组测序方法，通过对菌株HN-2基因组特征分析及功能基因注释，分析菌株HN-2中可能存在的DSF降解基因。具体实验方法和结果如下：
(1)菌株HN-2的基因组特征
为了了解贪铜菌(Cupriavidus pinatubonensis)菌株HN-2的基因功能和结构，对菌株HN-2进行了全基因组测序。根据全基因组测序结果可得，菌株HN-2基因组的总长度为7,548,664bp，其中N50为10,533bp。有7,101个编码基因，编码基因的总长度为6,556,812bp，占基因组总长度的86.86％。散在重复序列总长度是6,886bp，占基因组总长度的0.0912％。基因岛和前噬菌体分别为14个和4个。
(2)KEGG数据库注释
KEGG是一个综合数据库，它们大致分为系统信息、基因组信息和化学信息三大类。各个数据库中包含了大量的有用信息。GENES数据库存储了基因组信息，包括完整和部分测序的基因组序列；PATHWAY数据库里存储更高级的功能信息，包括利用图解的细胞生化过程如代谢通路、信号传递、膜转运、细胞周期和同系保守的子通路等信息。
用KEGG对菌株HN-2的全基因组测序结果进行分析注释，根据代谢通路分类图可知，概观类基因1150个、脂质代谢类161个、聚糖的生物合成和代谢类48个、萜类和多酮类化合物的代谢类65个、碳水化合物代谢类基因356个、氨基酸代谢类基因408和异型生物质降解和代谢类基因有223个。
实施例2 DSF降解基因fadT的获得
本实施例根据实施例1菌株HN-2基因组特征分析及功能基因注释的结果，利用基因敲除的方式构建可能的基因突变体进行表型验证，以准确找到高效的降解酶。具体实验方法和结果如下：
(1)实验方法
根据实施例1中KEGG数据库功能注释的基础上，我们选择了8个基因进行进一步的研究；这些基因有中四个基因编码长链酰基辅酶A合成酶(HN.2_GM000231，HN.2_GM003041，HN.2_GM005970，HN.2_GM000743用KO系统的K01897注释，也是rpfB的同源物)、三个3-羟酰基辅酶A脱氢酶(HN.2_GM000404，HN.2_GM003236，HN.2_GM004234，用KO系统的K07516注释)，和一个丁酰辅酶A脱氢酶(HN.2_GM004237)。
然后，以野生型HN-2为亲本，构建野生型HN-2缺失这些基因的突变体，最后在上述8个基因中选择了其中4个基因，分别构建了4突变体，分别是Δ0404、Δ4237、Δ3041和Δ0743。
对这四个突变体进行验证，实验分为四个处理：将浓度相同的菌液均匀接种在白萝卜切片上，无菌水接种作为空白对照，菌液分别为Xcc；Xcc+野生型HN-2；Xcc+突变体Δ0404/Δ4237/Δ3041/Δ0743。最后置于温度为28℃，湿度为60％，光照为0的人工培养箱下培养2天后拍照记录。同时，进行DSF降解实验，以野生型HN-2为亲本，分别构建野生型HN-2缺失突变体Δ0404/Δ4237/Δ3041/Δ0743，以及互补体用于进行互补实验进一步验证上述4个基因是否影响DSF的降解，实验分为4个处理组：空白对照组CK、野生型HN-2组、突变体组Δ0404/Δ4237/Δ3041/Δ0743、互补体组；在MSM基础培养基中，加入2mM的DSF为唯一碳源，培养24h后，使用高效液相色谱法分别测定空白对照组CK、野生型HN-2组、突变体组Δ0404/Δ4237/Δ3041/Δ0743、互补体组的DSF降解情况。
(3)实验结果
DSF降解基因fadT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
最终在这四个突变体中，GM004237被确定为HN-2具DSF降解能力和黑腐病防治能力所必需的基因，并被命名为fadT。降解实验结果表明，野生型HN-2组24h后完全降解DSF；突变体ΔfadT组与空白对照组CK均不能在以DSF为唯一碳源的MSM培养基内生长，也丧失降解DSF的能力，但其互补ΔfadT(fadT)组在互补回基因fadT后恢复了表型，培养24h后能够降解90％以上的DSF；结果表明：基因fadT对DSF的降解有重要的影响。
其生物活性测定效果如图1所示：萝卜切片单独接种Xcc菌液时，出现了典型的黑腐病症状；萝卜切片接种Xcc+野生型HN-2时，没有出现黑腐病症状；萝卜切片接种Xcc+突变体ΔfadT时，同样出现了黑腐病症状；空白对照组的萝卜没有黑腐病症状。结果表明，菌株HN-2能很好地抑制DSF介导的Xcc致病力，而fadT缺失突变体ΔfadT对DSF介导的Xcc致病力没有抑制作用，其回补体ΔfadT(fadT)可以恢复DSF介导的Xcc致病力。因此，基因fadT是HN-2降解DSF所必需的基因。
实施例3 DSF降解酶FadT的表达与纯化
(1)实验方法
根据实施例1贪铜菌(Cupriavidus pinatubonensis)菌株HN-2的全基因组测序分析的结果，基因fadT被推测编码一个丁酰辅酶A脱氢酶。
为了得到更纯净和更高产量的降解酶，基因fadT密码子首先得到了优化。通过PCR扩增密码子优化后的编码DSF降解酶FadT的DNA片段，并将其亚克隆到表达载体pGEX-6p-1上，得到重组质粒pGEX-fadT，再将重组质粒pGEX-fadT转入到大肠杆菌BL21中，得到重组菌Escherichia coil BL21/pGEX-fadT。菌体接种于LB培养基(含终浓度100μg/mL的氨苄青霉素)中37℃培养，在OD600达到约0.6时，加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)，并以未加入IPTG诱导剂的处理作为对照，18℃培养24h。取出菌液离心并弃上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀。经过超声破碎后，用0.45μm微孔过滤器(微孔)过滤，之后用蛋白纯化仪纯化滤液，将纯化回收的重组蛋白FadT-GST进行SDS-PAGE电泳，最后以电泳结果分析重组蛋白FadT-GST的大小及纯度。
(2)实验结果
酶FadT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
酶FadT的表达与纯化结果如图2所示，7泳道成功表达得到了降解酶FadT，说明本发明使用IPTG诱导剂的条件下，利用E.coil BL21/pGEX-fadT能够成功制备得到降解酶FadT。且扩增出单一、清晰、纯度高、大小为93kDa的重组蛋白FadT-GST条带。
实施例4 DSF降解酶FadT对萝卜、白菜和上海青的黑腐病的生防效果测定
(1)实验方法
将健康萝卜、白菜和上海青种子种在花盆中，设置防虫网罩，定期浇水，在不施加农药的条件下健康种植30天。用浓度为6×108CFU/mL的菌液或无菌水分别处理萝卜、白菜和上海青幼苗叶片。实验包括6个处理，以无菌水接种作为空白对照，处理菌液分别为Xcc；Xcc+野生型HN-2；Xcc+突变体ΔfadT；Xcc+回补体ΔfadT(fadT)；Xcc+转入了fadT基因的野油菜黄单胞菌Xcc(fadT)。植物叶片接种后继续在盆栽中种植，每天记录症状，并在接种8天后分别收获萝卜和白菜并拍照，在接种10天后收获上海青进行拍照。实验期间，昼夜温度、光周期和湿度与周围自然环境相同。
(2)实验结果
酶FadT对萝卜黑腐病的生防效果测定结果如图3所示；酶FadT对白菜黑腐病的生防效果测定结果如图4所示；酶FadT对上海青黑腐病的生防效果测定结果如图5所示。从三种植物的叶片症状均可以看出，单独接种野油菜黄单胞菌Xcc和接种Xcc+突变体ΔfadT混合菌液的叶片发病，黄色病斑呈"V"字形向内发展，萝卜黑腐病症状明显，说明Xcc的致病力无法被抑制；而接种了Xcc+野生型HN-2混合菌液、Xcc+回补体ΔfadT(fadT)混合菌液和转入了fadT基因的野油菜黄单胞菌Xcc(fadT)的叶片均未出现黑腐病症状，Xcc的致病力被显著抑制。
以上结果表明：酶FadT对野油菜黄单胞菌Xcc的致病力有显著的抑制效果，且对Xcc引起的黑腐病具有显著的生物防治效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 群体感应信号分子DSF降解基因fadT及和编码的降解酶FadT及其应用
<130> YGZS217764
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1857
<212> DNA
<213> Cupriavidus pinatubonensis HN-2的fadT
<400> 1
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gaactgctgg ctacgctgga ccgtaccacg ctggatatgc aggacgcctg gttctga 1857
<210> 2
<211> 618
<212> PRT
<213> Cupriavidus pinatubonensis HN-2的FadT
<400> 2
Met Ser Leu Ile Leu Ser Arg Arg Asp Leu Asn Phe Val Leu Tyr Glu
1 5 10 15
Trp Leu Lys Ala Asp Glu Leu Thr Arg Ile Pro Arg Tyr Ala Asp His
20 25 30
Ser Arg Glu Thr Phe Asp Ala Ala Leu Asp Thr Cys Glu Lys Ile Ala
35 40 45
Thr Asp Leu Phe Ala Pro His Asn Lys Lys Asn Asp Gln His Glu Pro
50 55 60
Glu Phe Asp Gly Glu Thr Val Thr Ile Ile Pro Glu Val Gly Thr Ala
65 70 75 80
Leu Lys Ala Phe Cys Glu Ala Gly Leu Met Ala Ala Gly Gln Asp Tyr
85 90 95
Glu Ile Gly Gly Met Gln Leu Pro Val Leu Val Glu Lys Ala Gly Phe
100 105 110
Ala Tyr Phe Lys Gly Ala Asn Val Gly Thr Ser Ser Tyr Pro Phe Leu
115 120 125
Thr Ile Gly Asn Ala Asn Leu Leu Leu Thr His Gly Thr Pro Ala Gln
130 135 140
Ile Asp Thr Phe Val Lys Pro Glu Met Glu Gly Arg Phe Phe Gly Thr
145 150 155 160
Met Cys Leu Ser Glu Pro Gln Ala Gly Ser Ser Leu Ser Asp Val Thr
165 170 175
Thr Arg Ala Glu Tyr Glu Gly Glu Ser Pro Leu Gly Ala Gln Tyr Arg
180 185 190
Leu Arg Gly Asn Lys Met Trp Ile Ser Ala Gly Glu His Glu Leu Ser
195 200 205
Asp Asn Ile Val His Leu Val Leu Ala Lys Ile Pro Gly Pro Asp Gly
210 215 220
Lys Leu Val Pro Gly Val Lys Gly Ile Ser Leu Phe Ile Val Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Leu Val Asn Ala Asp Gly Ser Leu Gly Glu His Asn Asp Val Val
245 250 255
Leu Ala Gly Leu Asn His Lys Met Gly Tyr Arg Gly Thr Thr Asn Cys
260 265 270
Leu Leu Asn Phe Gly Glu Gly Met Lys Tyr Lys Pro Ala Gly Lys Ala
275 280 285
Gly Ala Ile Gly Tyr Leu Val Gly Glu Pro Gly Lys Gly Leu Ala Cys
290 295 300
Met Phe His Met Met Asn Glu Ala Arg Ile Gly Val Gly Leu Gly Ala
305 310 315 320
Val Met Leu Gly Tyr Thr Gly Tyr Leu His Ala Val Asp Tyr Ala Arg
325 330 335
Asn Arg Pro Gln Gly Arg Pro Val Gly Pro Gly Gly Lys Asp Pro Ala
340 345 350
Ser Pro Gln Val Lys Leu Val Glu His Ala Asp Ile Arg Arg Met Leu
355 360 365
Leu Ala Gln Lys Ser Tyr Val Glu Gly Gly Leu Ala Leu Asn Leu Tyr
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Cys Ala Lys Leu Val Asp Glu Glu Arg Ala Ala Ser Ala Asp Ala Val
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Lys His Glu Gln Leu Ser Leu Leu Leu Asp Ile Leu Thr Pro Ile Ala
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Gln Val His Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Arg Glu Tyr Asn Val Glu Gln
435 440 445
Phe Tyr Arg Asp Asn Arg Leu Asn Pro Ile His Glu Gly Thr His Gly
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Ile Gln Gly Leu Asp Leu Leu Gly Arg Lys Val Val Met Lys Asp Gly
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Ala Ala Phe Arg Leu Leu Gly Glu Arg Val Arg Glu Thr Cys Glu Cys
485 490 495
Ala Leu Ser Ser Gly Asp Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ala Arg Ala Leu
500 505 510
Gly Ala Ala Ala Thr Arg Leu Ala Glu Val Thr Lys Val Leu Trp Ser
515 520 525
Ala Gly Asp Ala Asn Val Thr Leu Ala Asn Ala Ser Ile Tyr Leu Glu
530 535 540
Ala Phe Gly His Val Val Val Ala Trp Ile Trp Leu Glu Gln Ala Leu
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Val Ala Gln Ala Ala Leu Ala Gly Gly Ala Ser Gly Glu Asp Glu Thr
565 570 575
Phe Tyr Arg Gly Lys Leu Ala Ala Ala Thr Tyr Phe Ser Arg Trp Glu
580 585 590
Leu Pro Lys Val Gly Pro Gln Leu Glu Leu Leu Ala Thr Leu Asp Arg
595 600 605
Thr Thr Leu Asp Met Gln Asp Ala Trp Phe
610 615