阅读说明：本技术 班氏跳小蜂葡糖脱氢酶gld基因及其扩增用引物组合和克隆方法 (Brachychiton rupestris glucose dehydrogenase GLD gene and primer combination and cloning method for amplification thereof ) 是由 张娟 黄�俊 吕要斌 唐娅媛 李明江 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法,属于分子生物学以及基因克隆技术领域。所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。该基因的获得可以进一步研究该基因在班氏跳小蜂细胞中的组成及基因结构,并为其在班氏跳小蜂生殖生理中的作用和功能区域位置,以及与其他物种的区别提供理论依据。(The invention provides a bombesi hopping small bee glucose dehydrogenase GLD gene and a primer combination and a cloning method for amplification thereof, belonging to the technical field of molecular biology and gene cloning. The nucleotide sequence of the GLD gene is shown as SEQ ID No. 6. The acquisition of the gene can further research the composition and the gene structure of the gene in the Brachypodium semifasciatus cell and provide a theoretical basis for the function and the functional region position of the gene in the reproduction physiology of the Brachypodium semifasciatus and the difference with other species.)

班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆 方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因克隆技术领域，尤其涉及班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法。

背景技术

葡糖脱氢酶Glucose dehydrogenase(GLD)是一类结构功能多样的小肽分子，分子量大小为2Kbp左右，等电点介于5～7之间。该基因广泛分布于节肢动物体内，在卵和幼虫阶段，该基因分布在昆虫的诸多表皮衍生组织中，包括一些体壁繁殖器官中；然而，在成虫阶段，该基因仅保守分布于某些生殖器官中，如受精囊。对于寄生蜂雌蜂而言，因其吸收和释放的***数量与受精卵的数量密切相关。GLD基因可通过影响受精囊内***储存和释放量，来提高雌性的受精能力。

班氏跳小蜂Aenasius bambawalei是重要外来入侵性害虫——扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis的优势种寄生蜂。目前，班氏跳小蜂种群的室内大量饲养和繁殖存在较多技术瓶颈，其中种群退化和子代偏雄性是制约该蜂研究与应用的重要因素。而提高雌蜂的受精能力，可以有效解决以上问题。

目前未见关于班氏跳小蜂GLD基因的相关研究报道，NCBI数据库中关于其他寄生蜂GLD基因的序列亦为预测序列，尚无准确的序列上传记录及相关的文献报道。

发明内容

鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因，所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了用于班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因扩增的引物组合，包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括A-Gld-P 1F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物包括A-Gld-P 2R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述上游引物还包括A-Gld-P 2F，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物还包括A-Gld-P 1R，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述上游引物还包括A-Gld-P 2F，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物还包括A-Gld-P 1.1R，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明提供了一种克隆班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因的方法，包括如下步骤：

(1)提取班氏跳小蜂基因组DNA，得到扩增用模板DNA；

(2)用上述的引物组合对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行测序，得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因序列。

优选的，步骤(2)所述PCR扩增包括反应A和反应B；

所述反应A为：用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增；

所述反应B为：用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。

优选的，所述反应A和反应B使用的酶独立为高保真DNA聚合酶。

优选的，步骤(2)所述PCR扩增包括反应A’和反应B；

所述反应A’为：用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1.1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增；

所述反应B为：用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。

优选的，所述反应A’使用的酶为Taq酶。

有益效果：本发明提供了班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法。所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。该基因的获得可以进一步研究该基因在班氏跳小蜂细胞中的组成及基因结构，并为其在班氏跳小蜂生殖生理中的作用和功能区域位置，以及与其他物种的区别提供理论依据。

附图说明

图1为本发明实施例1所述班氏跳小蜂GLD基因CDS区PCR产物经1％凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因，所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明通过对班氏跳小蜂GLD基因CDS区进行预测，然后针对预测序列进行引物设计，再通过PCR扩增克隆，得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因(包括完整CDS区序列)的表达序列。该基因的获得可以进一步研究该基因在班氏跳小蜂细胞中的组成及基因结构，并为其在班氏跳小蜂生殖生理中的作用和功能区域位置，以及与其他物种的区别提供理论依据。

本发明提供了用于班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因扩增的引物组合，包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括A-Gld-P 1F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物包括A-Gld-P 2R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。在本发明中，所述A-Gld-P 1F是基于起始密码子前段130bp内的部分设计得到；所述A-Gld-P 2R是基于TAA之后130bp的外显子部分设计得到。

本发明所述上游引物优选还包括A-Gld-P 2F，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物优选还包括A-Gld-P 1R或A-Gld-P 1.1R，所述A-Gld-P 1R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述A-Gld-P 1.1R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。在本发明中，所述A-Gld-P 2F能和A-Gld-P 2R组成新的引物对；所述A-Gld-P 1R或A-Gld-P 1.1R的能和A-Gld-P 1F组成新的引物对。由于GLD基因片段较长，中间引物(A-Gld-P 2F、A-Gld-P 1R或A-Gld-P 1.1R)的加入能对GLD基因进行分段扩增，进而有助于扩增得到更为完整、准确的GLD基因序列。

本发明还提供了一种克隆班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因的方法，包括如下步骤：

(1)提取班氏跳小蜂基因组DNA，得到扩增用模板DNA；

(2)用上述提供的引物组合对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行测序，得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因序列。

本发明先提取班氏跳小蜂基因组DNA，得到扩增用模板DNA。本发明对班氏跳小蜂基因组DNA的提取方法不作特别限定，本领域常规操作即可。

得到扩增用模板DNA后，本发明用上述提供的引物组合对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物。

在本发明中，所述PCR扩增优选包括反应A和反应B；所述反应A为：用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增；所述反应B为：用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。

在本发明的一种优选方案中，所述反应A和反应B使用的酶独立优选为高保真DNA聚合酶。在本发明中，所述反应A的反应体系优选为：模板1μL，10μmol/L上游引物A-Gld-p1F和下游引物A-Gld-p 1R各2μL，2×Phata Max Master Mix 25μL，用PCR水将反应体系补充至50μL；所述反应A的程序优选为：1个循环，95℃变性2min；30个循环，94℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸35s；1个循环，72℃延伸5min；4℃保温。所述反应B的反应体系优选为：模板1μL，10μmol/L上游引物A-Gld-p 2F和下游引物A-Gld-p 2R各2μL，2×Phata Max MasterMix 25μL，用PCR水将反应体系补充至50μL。所述反应B的程序优选为：1个循环，95℃变性2min；30个循环，94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸35s；1个循环，72℃延伸5min；4℃保温。

在本发明的另一种优选方案中，所述PCR扩增包括反应A’和反应B；所述反应A’为：用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1.1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增；所述反应B为：用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。

在本发明中，所述反应A’使用的酶优选为普通Taq酶。在本发明中，所述反应A’的反应体系优选为：模板1μL，10μmol/L上游引物A-Gld-p 1F和下游引物A-Gld-p 1.1R各2μL，2×Phata Max Master Mix 25μL，用PCR水将反应体系补充至50μL；所述反应A的程序优选为：1个循环，95℃变性2min；30个循环，94℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸35s；1个循环，72℃延伸5min；4℃保温。

得到扩增产物后，本发明对所述扩增产物进行测序，得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因序列。本发明对具体的测序方法不作特别限定，本领域常规操作均可。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)班氏跳小蜂基因组DNA的提取

取5头班氏跳小蜂雌成虫全虫进行基因组DNA的提取，提取方法参照TIANamp公司Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。

(2)班氏跳小蜂GLD基因CDS区序列引物设计

根据本实验室已有的班氏跳小蜂GLD基因转录组数据，并参照NCBI数据库预测的班氏跳小蜂近似种蝇蛹金小蜂GLD基因序列(GenBank登录号为：XM_016982053)，对班氏跳小蜂GLD基因CDS区进行预测，针对预测序列进行引物设计，设计的引物序列如下：在起始密码子前段130bp内(序列如下)设计上游扩增引物(A-Gld-p1F：ctcgcagtacactcgcaaac)，并在TAA之后130bp左右的外显子上设计下游引物(A-Gld-p2R：aacaggttggagtgcgagag)。

同时，由于扩增片段较长，需要在中间设计1对引物，分别为A-Gld-p1R：atccccgacagcatgagcag和A-Gld-p2F：cgagaactggactacaacgc。

(3)用高保真DNA聚合酶对2个大片段进行PCR扩增。

在后续测序中，发现目标片段1(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)中存在缺失的情况，因此新设计引物A-Gld-p1.1R(序列：catgctgtagagggtgctgg)，与A-Gld-p1F一起用普通Taq酶对目标片段1进行2轮扩增，TA克隆后测序。

通对PCR产物以及TA克隆的测序，分别获得了片段1(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)、片段2(核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)、片段3(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)、片段4(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)的核酸序列。然后，对以上片段进行拼接，共获得2204(2203)bp的有效的基因组序列，包含完整的CDS序列，ATG之前获得122bp的有效基因组序列，TGA之后获得77bp的有效基因组序列

结果：预扩增片段长度为2204bp，其中包含完整CDS区及部分UTR区。

(4)班氏跳小蜂GLD基因CDS区序列的PCR扩增

利用上下游引物进行PCR扩增。

反应体系1为：模板1μL，10μmol/L上游引物A-Gld-p1F和下游引物A-Gld-p1R各2μL，2×Phata Max Master Mix 25μL，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件如下：1个循环，95℃变性2min；30个循环，94℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸35s；1个循环，72℃延伸5min；4℃保温。

反应体系2为：模板1μL，10μmol/L上游引物A-Gld-p2F和下游引物A-Gld-p2R各2μL，2×Phata Max Master Mix 25μL，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件如下：1个循环，95℃变性2min；30个循环，94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸35s；1个循环，72℃延伸5min；4℃保温。

(5)测序

班氏跳小蜂GLD基因CDS区PCR产物经1％凝胶电泳后的结果见图1。用诺唯赞公司的DNA胶回收试剂盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit进行回收纯化，纯化产物按照TaKaRa公司pMD19-T Vector试剂盒说明书进行操作，采用蓝白斑法筛选克隆产物，最终送生物公司测序。

结果：扩增目的片段长度为2204(2203)bp，包含完整的CDS序列，ATG之前获得122bp的有效基因组序列，TGA之后获得77bp的有效基因组序列。所构建的重组质粒序列与NCBI数据库剪辑变异体序列比对相符，说明班氏跳小蜂GLD基因CDS区序列克隆成功。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgcagtac actcgcaaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacaggttgg agtgcgagag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagaactgg actacaacgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atccccgaca gcatgagcag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catgctgtag agggtgctgg 20

<210> 6

<211> 2204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgcagtac actcgcaaac tttcaataaa aagtccaatt tctcggcgta gatccaatta 60

attggaatta accatcctgg agaagaaaat tggtcgttgg aatttgcgaa ggaggaaggg 120

ccatgtcttg ttcgcagagc agcacggacg cgcggatttg caggcccgac tcctgcagct 180

cgtccgccct gacttttctc gcgctgctct cccactacct cggctactcg tacgaccaga 240

atttcaaact cgtcagcgag gagagcgagt ccacggagtt cgacttcata gtcgtgggcg 300

cgggcagcgc cggctgcgtc gtcgcgaatc gcctcagcga gaacgccaac tggagcgtag 360

gttgcacact ctcttgtatt ccccccgagc tcccgggctt cggccgagct aatacgccgc 420

ggcgtgcgcg caggttctgt tgctggaggc gggcccggag gagccggcca tcgccgacag 480

ccccggactg atgcacctgc tctgggccag cgagctcaac tacggctaca ggacgcagcc 540

ggaggcccgg gcctgcggcg accagccggg ccgcacctgt aactgggtcc gtggccgggt 600

catgggcggc tccagcaccc tctacagcat gcacgtggtg cgcggcaacc gctgggacta 660

cgaccactgg gcgagcctgg gcaacccggg ctggagctgg gccgaggtgc tgccctactt 720

caagaagtcc gaggacttcc ggatccccga ggtgagtagt gctggctgcg gtagcagagg 780

cagcccccgc tccgtttccc ctccccgttc tcggcttcta cggctgcaac tcgtcttcct 840

cgggcgcagg tgctgcgcga gtccggccag ttccacggga ccggcggcta ccagagcatc 900

gaggccgagc gcttcgaccc gaacgcccag gtcctgctgg aggcctggaa ggagctcggg 960

ctgcgagaac tggactacaa cgccggcgac aacctgggca ccgcccggct gcagtacgcg 1020

atgctcgcgg gcgcccggca gagcgccaac ggggccttcc tccggccgat ccgcggccgc 1080

cggccgaacc tgcagctccg ggcgaacagc cgggtcgtcc ggctgctgct cgacccgagc 1140

ggcagtcggg ccctcggcgt ggagtaccgg gccccgggct ccccgccgcg gctgcgccgg 1200

ctctacgcgc gcaaggaggt cgtcctctcg gccggcgtca tcgactccgc gaagctgctc 1260

atgctgtcgg ggatcgggcc cgcccggaac ctccgggagt ccggcatccc cctggtccgg 1320

gagctgcccg tcggccggaa cctgcagaac cacgtctcga tcacgccgct cgtggtgcgg 1380

ctggccaaca gctccgggcc cggcttcgac ttccgcgaga tggagcgcga cctcgtctac 1440

tggctgagcg cccggcgggg ccccatgcgg gagaacggct tcatggacaa cgtggccttc 1500

ctgcggacga gcttcgagcc ccggccggag ctgccggacg tccaggtcgg ctacatcaag 1560

tacgcgcgcg aggccggccg cggggcctgc cgcacccacc tgccctacta cgagggcttc 1620

ctgctgacga gcctgtacct cgcgcccaag agccggggcg agctgctgct gaacagctcg 1680

gacccgctgg ccggccagcc gctcatacgc gccaactact tctcggagcc ggaggacctg 1740

ctcgccctgg cggaggcggc gcggctcact cgccggctgc tccgcacccg ggcggccggg 1800

cgcgccggct tcgtcgcgag caggctgccg ggcccgctct gcgaccacct cgagttcgag 1860

tccgagccgt actaccgctg cctcgcgtac aactacacgg gcatcatcca ccacgaggtg 1920

ggcacttgta aaatgggccc ggccaatgac cccggggccg tggtcgaccc caggctcagg 1980

gtccacggcg tcgccgggct cagggtcgtc gacgcctcga tcatgccggt cctgccccgg 2040

ggcaacaccc aggcgcccac tgtgatgatt ggcgagaagg gcagcgacct catcaagcaa 2100

gactggatgg gagtagcggg caattgagtg tcccggaccc gattctcctg gatccgtccc 2160

atcctccttc ttggtcactc cccgtgcaat taccactgcc gcat 2204

<210> 7

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgacgtagct gcagtcgacg attcatgctg tagagggtgc tggagccgcc catgacccgg 60

ccacggaccc agttacaggt gcggcccggc tggtcgccgc aggcccgggc ctccggctgc 120

gtcctgtagc cgtagttgag ctcgctggcc cagagcaggt gcatcagtcc ggggctgtcg 180

gcgatggccg gctcctccgg gcccgcctcc agcaacagaa cctgcggcac gccttggcgt 240

attagctcgg ccgaagcccg cgagctcggg gggaatacaa gagagtgtgc aacctacgct 300

ccagttggcg ttctcgctga ggcgattcgc gacgacgcag ccggcgctgc ccgcgcccac 360

gactatgaag tcgaactccg tggactcgct ctcctcgctg acgagtttga aattctggtc 420

gtacgagtag ccgaggtagt gggagagcag cgcgagaaaa gtcagggcgg acgagctgca 480

ggagtcgggc ctgcaaatcc gcgcgtccgt gctgctctgc gaacaagaca tggcccttcc 540

tccttcgcaa attccaacga ccaattttct tctccaggat ggttaattcc aattaattgg 600

atctacgccg agaaattgga ctttttattg aaagtttgcg agtgtactgc gagaatctct 660

agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 720

aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 780

ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 840

ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 900

cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 960

tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcgggt aatacgggtt atccacagaa 1020

tcagggataa cgcaggaaga catgtgagca aaaggccagc aaaagccagg accgtaaaag 1080

gcgcgttgct ggcgttttca tagctccgcc cccctgacga gcatcacaaa atcgacgctc 1140

aagtcagagg tgggcgaacc cgacaggaac tattaaagg 1179

<210> 8

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggacgaagct gcagtcgacg attcatgctg tagagggtgc tggagccgcc catgacccgg 60

ccacggaccc agttacaggt gcggcccggc tggtcgccgc aggcccgggc ctccggctgc 120

gtcctgtagc cgtagttgag ctcgctggcc cagagcaggt gcatcagtcc ggggctgtcg 180

gcgatggccg gctcctccgg gcccgcctcc agcaacagaa cctgcgcgca cgccgcggcg 240

tattagctcg gccgaagccc gggagctcgg ggggaataca agagagtgtg caacctacgc 300

tccagttggc gttctcgctg aggcgattcg cgacgacgca gccggcgctg cccgcgccca 360

cgactatgaa gtcgaactcc gtggactcgc tctcctcgct gacgagtttg aagttctggt 420

cgtacgagta gccgaggtag tgggagagca gcgcgagaaa agtcagggcg gacgagctgc 480

aggagtcggg cctgcaaatc cgcgcgtccg tgctgctctg cgaacaagac atggcccttc 540

ctccttcgca aattccaacg accaattttc ttctccagga tggttaattc caattaattg 600

gatctacgcc gagaaattgg actttttatt gaaagtttgc gagtgtactg cgagaatctc 660

tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 720

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 780

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 840

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 900

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 960

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacgggtt atccacagaa 1020

tcaggggata acgcaggaaa gacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggacgtaaa 1080

aaggcgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc ctgacgagca tcacaaaaat 1140

cgacgcctca agtcagaggg tggcgaagct cgaacaggga ctatataaag gaaataacca 1200

gggcgttttt ctctctctgg cagt 1224

<210> 9

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggccgagagg acgacctcct tgcgcgcgta gagccggcgc agccgcggcg gggagcccgg 60

ggcccggtac tccacgccga gggcccgact gccgctcggg tcgagcagca gccggacgac 120

ccggctgttc gcccggagct gcaggttcgg ccggcggccg cggatcggcc ggaggaaggc 180

cccgttggcg ctctgccggg cgcccgcgag catcgcgtac tgcagccggg cggtgcccag 240

gttgtcgccg gcgttgtagt ccagttctcg cagcccgagc tccttccagg cctccagcag 300

gacctgggcg ttcgggtcga agcgctcggc ctcgatgctc tggtagccgc cggtcccgtg 360

gaactggccg gactcgcgca gcacctgcgc ccgaggaaga cgagttgcag ccgtagaagc 420

cgagaacggg gaggggaaac ggagcggggg ctgcctctgc taccgcagcc agcactactc 480

acctcgggga tccggaagtc ctcggacttc ttgaagtagg gcagcacctc ggcccagctc 540

cagcccgggt tgcccaggct cgcccagtgg tcgtagtccc agcggttgcc gcgcaccacg 600

tgcatgctgt agagggtgct ggagccgccc atgacccggc cacggaccca gttacaggtg 660

cggcccggct ggtcgccgca ggcccgggcc tccggctgcg tcctgtagcc gtagttgagc 720

tcgctggccc agagcaggtg catcagtccg gggctgtcgg cgatggccgg ctcctccggg 780

cccgcctcca gcaacagaac c 801

<210> 10

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctgcagta cgcgatgctc gcgggcgccc ggcagagcgc caacggggcc ttcctccggc 60

cgatccgcgg ccgccggccg aacctgcagc tccgggcgaa cagccgggtc gtccggctgc 120

tgctcgaccc gagcggcagt cgggccctcg gcgtggagta ccgggccccg ggctccccgc 180

cgcggctgcg ccggctctac gcgcgcaagg aggtcgtcct ctcggccggc gtcatcgact 240

ccgcgaagct gctcatgctg tcggggatcg ggcccgcccg gaacctccgg gagtccggca 300

tccccctggt ccgggagctg cccgtcggcc ggaacctgca gaaccacgtc tcgatcacgc 360

cgctcgtggt gcggctggcc aacagctccg ggcccggctt cgacttccgc gagatggagc 420

gcgacctcgt ctactggctg agcgcccggc ggggccccat gcgggagaac ggcttcatgg 480

acaacgtggc cttcctgcgg acgagcttcg agccccggcc ggagctgccg gacgtccagg 540

tcggctacat caagtacgcg cgcgaggccg gccgcggggc ctgccgcacc cacctgccct 600

actacgaggg cttcctgctg acgagcctgt acctcgcgcc caagagccgg ggcgagctgc 660

tgctgaacag ctcggacccg ctggccggcc agccgctcat acgcgccaac tacttctcgg 720

agccggagga cctgctcgcc ctggcggagg cggcgcggct cactcgccgg ctgctccgca 780

cccgggcggc cgggcgcgcc ggcttcgtcg cgagcaggct gccgggcccg ctctgcgacc 840

acctcgagtt cgagtccgag ccgtactacc gctgcctcgc gtacaactac acgggcatca 900

tccaccacga ggtgggcact tgtaaaatgg gcccgggcaa tgaccccggg gccgtggtcg 960

accccaggct caggtccacg ggcgtcgcgg ctcagggtcg tcgacgctcg atcatgccgg 1020

tcctgccccg gggcacacca gcgccactgt gatgattgcg agagggcagc gactcatcag 1080

cagactgaat gggagtagcg gccatgagtg tcccgacccg atctcctgga tcgtcccatc 1140

ctccttcttg gtcactccca t 1161

<210> 11

<211> 860

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagatgcggc agtggtaatt gcacggggag tgaccaagaa ggaggatggg acggatccag 60

gagaatcggg tccgggacac tcaattgccc gctactccca tccagtcttg cttgatgagg 120

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tcgaccacgg ccccggggtc attggccggg cccattttac aagtgcccac ctcgtggtgg 300

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tccgagaagt agttggcgcg tatgagcggc tggccggcca gcgggtccga gctgttcagc 540

agcagctcgc cccggctctt gggcgcgagg tacaggctcg tcagcaggaa gccctcgtag 600

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acctggacgt ccggcagctc cggccggggc tcgaagctcg tccgcaggaa ggccacgttg 720

tccatgaagc cgttctcccg catggggccc cgccgggcgc tcagccagta gacgaggtcg 780

cgctccatct cgcggaagtc gaagccgggc ccggagctgt tggccagccg caccacgagc 840

ggcgtgatcg agacgtggtt 860