单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用
阅读说明：本技术 单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用 (Monooxygenase MpdA, encoding gene mpdA thereof and application of monooxygenase MpdA and encoding gene mpdA in synthesis of vitamin E precursor ) 是由 闫新 纪俊宾 于 2021-01-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用。MpdA的氨基酸序列为SEQ ID NO.2,全长413个氨基酸,其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,全长1242bp。MpdA是首次发现的可以催化2,3,6-三甲基苯酚转化形成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌的单加氧酶。含有MpdA的工程菌细胞或酶液可高效地将2,3,6-三甲基苯酚转化为2,3,5-三甲基氢醌。2,3,5-三甲基氢醌是维生素E合成的两个前体之一,2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶MpdA与其编码基因mpdA在生物法合成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌中的应用潜力巨大。(The invention discloses a monooxygenase MpdA, a coding gene mpdA thereof and application of the monooxygenase MpdA and the coding gene mpdA in synthesis of a vitamin E precursor. The amino acid sequence of MpdA is SEQ ID NO.2, the total length is 413 amino acids, the nucleotide sequence of the coding gene is SEQ ID NO.1, and the total length is 1242 bp. MpdA is the first monooxygenase to be found that can catalyse the conversion of 2,3, 6-trimethylphenol to the vitamin E precursor 2,3, 5-trimethylhydroquinone. The MpdA-containing engineering bacteria cells or enzyme liquid can efficiently convert 2,3, 6-trimethylphenol into 2,3, 5-trimethylhydroquinone. 2,3, 5-trimethylhydroquinone is one of two precursors for synthesizing vitamin E, and 2,3, 6-trimethylphenol monooxygenase MpdA and an encoding gene thereof mpdA have great application potential in synthesizing the vitamin E precursor 2,3, 5-trimethylhydroquinone biologically.)
技术领域
本发明属于生物高技术领域，涉及单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用。
背景技术
维生素E具有抗氧化、促进性激素分泌、降低心血管疾病等多种生理功能，广泛应用于食品、保健品、化妆品、临床、医药等行业。随着对维生素E需求的不断攀升，仅仅依靠从自然界植物叶片或种子等中提取已远远不能满足人们的需要，市场上80％以上的维生素E来自工业合成。
目前，维生素E工业合成的主要途径是2,3,5-三甲基氢醌和异植物醇缩合。异植物醇的生物发酵法合成近年来已成功商业化，但是2,3,5-三甲基氢醌仍使用化学合成，包括2,3,6-三甲基苯酚氧化还原法、异佛尔酮法和偏三甲苯氧化还原法等。化学合成效率高，但会带来一些环境问题，例如，催化过程需要重金属和副产物的产生等等。相反，生物合成具有绿色环保、特异性强、生产成本低等特点，在化工合成的中扮演者越来越重要的角色。生物法合成需要特异的微生物或者酶，然而迄今尚无能特异性合成2,3,5-三甲基氢醌的微生物或者酶。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶MpdA与其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌合成中的应用，MpdA酶液或表达MpdA的细胞能将2,3,6-三甲基苯酚转化为2,3,5-三甲基氢醌。
本发明目的可通过如下技术方案实现：
基因mpdA源自菌株分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)B5-4，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2019088。菌株Mycobacterium neoaurumB5-4能够降解2,6-二甲基苯酚和2,3,6-三甲基苯酚。
克隆基因mpdA的策略为比较基因组法。通过在LB培养基(酵母粉，5.0g；蛋白胨，10.0g；NaCl，5.0g；去离子水，1L；pH 7)中连续传代获得一株丧失转化2,3,6-三甲基苯酚能力的突变菌株，命名为Mycobacterium neoaurum B5-4M。通过比较菌株B5-4和突变株B5-4M基因组序列，发现突变株B5-4M中丢失了一个约23kb的DNA片段；综合生物信息学预测和实验验证，获得目的基因mpdA，其编码蛋白命名为MpdA。
把基因mpdA连接于载体pRESQ(van der Geize R,Hessels GI,van Gerwen R,vander Meijden P,Dijkhuizen L.2002.Molecular and functional characterization ofkshA and kshB,encoding two components of 3-ketosteroid 9alpha-hydroxylase,aclass IA monooxygenase,in Rhodococcus erythropolis strain SQ1.Mol Microbiol45:1007–1018.https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2002.03069.x.)上获得质粒pMPDA，将质粒pMPDA导入菌株Rhodococcus qingshengii YL-1(CCTCC AB 2017132)(Li C,Zhang J,Wu ZG,Cao L,Yan X,Li SP.2012.Biodegradation of buprofezin byRhodococcus sp.strain YL-1isolated from rice field soil.J Agric Food Chem 60:2531–2537.https://doi.org/10.1021/jf205185n.Chen X,Ji J,Zhao L,Qiu J,Dai C,Wang W,He J,Jiang J,Hong Q,Yan X.2017.Molecular mechanism and geneticdeterminants of buprofezin degradation.Appl Environ Microbiol 83:e00868-17.https://doi.org/10.1128/AEM.00868-17.)后获得重组菌株YL-mpdA。菌株YL-mpdA的细胞在基础盐MSM培养基(NH4NO3,1.0g；KH2PO4,0.5g；K2HPO4,1.5g；NaCl,1.0g；MgSO4·7H2O,0.2g；去离子水，1L；pH 7)中能将2,3,6-三甲基苯酚转化为2,3,5-三甲基氢醌，也能将2,6-二甲基苯酚转化为2,6-二甲基氢醌。将菌株YL-mpdA的细胞破碎，含有2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶MpdA的破碎液可将2,3,6-三甲基苯酚转化为2,3,5-三甲基氢醌，也能将2,6-二甲基苯酚转化为2,6-二甲基氢醌。
本发明所述的一种2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶的编码基因mpdA，包括：
(a)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
本发明所述的一种2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶蛋白质MpdA，包括：
(a)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
所述的严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，再用2×SSC、0.1％SDS及1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
一种含有本发明所述的2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶的编码基因mpdA的重组表达载体。
含有本发明所述的2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶编码基因mpdA的基因工程菌。
本发明所述的2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶编码基因mpdA在合成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌中的应用。
本发明所述的2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶MpdA在合成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌中的应用。
本发明所述的基因工程菌在合成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌中的应用。
一种合成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌的方法，以本发明所述的基因工程菌催化2,3,6-三甲基苯酚，生物法合成2,3,5-三甲基氢醌。
一种合成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌的方法，以本发明所述的2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶MpdA催化2,3,6-三甲基苯酚，生物法合成2,3,5-三甲基氢醌。
有益效果
1、本发明从菌株Mycobacterium neoaurum B5-4中克隆到2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶编码基因mpdA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长1242bp，其编码的2,3,6-三甲基苯酚单加氧酶MpdA氨基酸序列为SEQ ID NO.2，全长413个氨基酸。
2、MpdA是首次发现的可以催化2,3,6-三甲基苯酚转化形成维生素E前体2,3,5-三甲基氢醌的单加氧酶。MpdA酶液或携带mpdA的基因工程菌细胞能将2,3,6-三甲基苯酚转化为2,3,5-三甲基氢醌。
附图说明
图1基因mpdA在菌株Rhodococcus qingshengii YL-1中表达策略图
图2工程菌株YL-mpdA转化2,3,6-三甲基苯酚生成2,3,5-三甲基氢醌的二级质谱检测图
图3工程菌株YL-mpdA转化2,3,6-三甲基苯酚生成2,3,5-三甲基氢醌的1H NMR检测图
图4粗酶液催化2,3,6-三甲基苯酚生成2,3,5-三甲基氢醌的高效液相色谱检测图生物材料保藏信息
分枝杆菌B5-4(Mycobacterium neoaurum B5-4)保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2019088。保藏日期为2019年1月28日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
实施例1基因mpdA的克隆
(1)细菌基因组总DNA的提取与测序
菌株Mycobacterium neoaurum B5-4及其突变菌株Mycobacterium neoaurum B5-4M分别在液体LB培养基中(30℃、200rpm、48h)大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的两菌株基因组总DNA，分别溶于去离子水中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。将所获的两株细菌的基因组DNA委托测序公司测序。
(2)基因mpdA的功能鉴定
通过对菌株Mycobacterium neoaurum B5-4及其突变菌株的基因组进行比对分析，发现突变菌株中丢失了一个约23kb的DNA片段，结合基因组注释对这个片段进行分析，将可能的目标基因分别连接到载体pMV261(优宝生物，湖南),电击转化至突变菌株B5-4M(转化方法参考文献Gordhan BG,Parish T.2001.Gene replacement using pretreatedDNA.Methods Mol Med 54:77–92.)。将转化子接种于LB培养基，置于恒温摇床中180rpm,30℃振荡培养48小时后离心收集菌体，并重悬于MSM培养基中，调节菌体浓度至OD600＝1.0,加入0.5mM的2,3,6-三甲基苯酚，180rpm，30℃，于恒温摇床中振荡培养24h。加入等体积二氯甲烷终止反应并剧烈振荡提取产物，有机相经无水硫酸钠脱水、氮气吹干后溶于100μL甲醇待测。用高效液相色谱检测克隆子能否转化2,3,6-三甲基苯酚，液相条件为：色谱柱，Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm×5μm)；流动相，甲醇/水/磷酸(体积比55/44.9/0.1)；流速，1ml·min-1；紫外检测器，波长275nm和290nm；进样量，20μl。
将高效液相色谱检测下有转化2,3,6-三甲基苯酚能力的菌株保存，并将其携带的基因命名为mpdA，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；由基因mpdA编码的蛋白质MpdA的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例2 2,3,5-三甲基氢醌的全细胞催化法合成
(1)工程菌株的构建
以菌株B5-4总DNA为模板，用正向引物(SEQ ID NO.3):5’-ACCGAGCTCAGATCTACTAGTATGCAATTTTCCAAAGTTGG-3’和反向引物(SEQ ID NO.4):5’-ACACTGGCGGCCGTTACTAGTTCACAGCCACGGGGTATTCGG-3’扩增出基因mpdA。PCR扩增程序：95℃变性3min；95℃变性1.5min，53℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，进行25个循环；72℃延伸10min，冷却到室温。将获得的基因mpdA片段引入质粒pRESQ的SpeI酶切位点处，构建重组质粒pMPDA；然后，将重组质粒电击转化到菌株Rhodococcus qingshengii YL-1(CCTCC AB 2017132)(Li C,Zhang J,WuZG,Cao L,Yan X,Li SP.2012.Biodegr adation of buprofezin by Rhodococcussp.strain YL-1isolated from rice field soil.J Agric Food Chem 60:2531–2537.https://doi.org/10.1021/jf205185n.Chen X,Ji J,Zhao L,Qiu J,Dai C,Wang W,He J,Jiang J,Hong Q,Yan X.2017.Molecular mechanism and genetic determinantsof buprofezin degradation.Appl Environ Microbiol 83:e00868-17.https://doi.org/10.1128/AEM.00868-17.)后获得重组工程菌株YL-mpdA(图1)(转化方法参考文献Shao Z,Dick W,Behki R.1995.An improved Escherichia coli-Rhodococcus shuttlevector and plasmid transformation in Rhodococcus spp.usingelectroporation.Lett Appl Microbiol 21:261–266.https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.1995.tb01056.x.)。
(2)工程菌株YL-mpdA的功能验证与转化2,3,6-三甲基苯酚的产物测定
菌株YL-mpdA在LB培养基中培养48小时，5000rpm,10min离心后将菌体细胞重悬于MSM培养基中，调节菌体浓度至OD600＝1.0,加入0.5mM的2,3,6-三甲基苯酚，180rpm，30℃，于恒温摇床中振荡培养24至48小时。加入等体积二氯甲烷终止反应并剧烈振荡提取产物，有机相经无水硫酸钠脱水、氮气吹干后溶于100μL甲醇或d6-DMSO中待测。质谱检测及核磁共振结果显示菌株YL-mpdA能将2,3,6-三甲基苯酚转化为2,3,5-三甲基氢醌(图2、图3)，且在48小时内可完全催化0.5mM的2,3,6-三甲基苯酚生成相应的2,3,5-三甲基氢醌，转化效率达92％。
实施例3 2,3,5-三甲基氢醌的酶催化法合成
(1)粗酶液制备
菌株YL-mpdA在LB培养基中培养至对数期，5000rpm,10min离心收集菌体，经PBS缓冲液洗涤两次后在重悬于10ml的PBS缓冲液中，冰水浴中超声破碎10-15分钟(AutoScience,UH-650B ultrasonic processor,30％intensity)，12000rpm离心30min，收集上清，此上清即为制备的粗酶液。
(2)粗酶液催化2,3,6-三甲基苯酚的功能测定
粗酶液催化2,3,6-三甲基苯酚的反应体系为：0.5mM 2,3,6-三甲基苯酚,0.2mMNADH,0.02mM FAD,粗酶液补足10ml。30℃条件下反应2小时后，加入等体积二氯甲烷终止反应并剧烈振荡提取产物，有机相经无水硫酸钠脱水、氮气吹干后溶于100μL甲醇。经高效液相色谱检测发现底物2,3,6-三甲基苯酚的峰有明显下降，并有一对应2,3,5-三甲基氢醌的产物峰产生(图4)，这表明含有MpdA的粗酶液可以转化2,3,6-三甲基苯酚生成相应的2,3,5-三甲基氢醌，转化效率达85％。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1242
<212> DNA
<213> 分枝杆菌B5-4(Mycobacterium neoaurum B5-4)
<400> 1
atgcaatttt ccaaagttgg aaaggaaatg atgaccaccg tcgcaactcc cgaaacagac 60
cctgcttccc aggaggctct ccgctcggaa tacatccagc gggcgaagga cctggtgcct 120
ctgttgcggt cgaatgcccg tcgcaccgac gaggagcgtc gagtcccaca ggagaacatc 180
gacgcactcg aaaagtcggg aatcttgcgc gccagccgcc cggtccagca cggcggcatc 240
gagatggacg aggtaaccaa gttccacgtc ttcagcgagc tcgcccgcgg gtgtggatcc 300
accgggtggg tggcgacgct gttggcggac gccggcttcc tggtgtcgct gttccccgat 360
gaggtgcagg ccgaggtctt cgccgatccc aacacccaca ccaccgcgac gttgatccct 420
gcgggccgcg ccgagcgcga tgggtctgga ttccgggtga ccggccggtg gccgttcaac 480
accgggtgcc gtcacgctca gtgggtagcg gagccggcgg tgatcgaatt ggaatccggc 540
cagcccgaag tatgcatctt cctgatgcca tactcggagt tggagattct cgatgactgg 600
tatgtctccg gactccgcgg caccggcagt agcaccgtgg tcgggtccaa tgtgttcgtg 660
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tcgactatcc cgggtatggc gcaggcggcc tacgacatgt atatggagaa actccagact 840
cgaggcccga ttgcctacac ctcgtacgct cgccgcgtcg atgcgccaat tgcccagcat 900
caggtggcca acgccgcgct gaaaatcgac gccgggaagc atctcatgcg ccaggcgctg 960
gaaatggtga acgatcacgc ggaatcccgc accccatacc tgccgcacga gcaggcgcag 1020
gtctggggaa tcgtgggcta taccactcaa ctgttcaccg aggccatcga catcatccgg 1080
ctggcgtccg gagcgcatgg cgtctatcag aaccagaaca tcgagatcgt gttccgcgac 1140
gtgaatgcat tggcctcgca cgccctgatg atgcccacaa cgggtatcga acactacggt 1200
cgcgcactct gcggtctcga accgaatacc ccgtggctgt ga 1242
<210> 2
<211> 413
<212> PRT
<213> 分枝杆菌B5-4(Mycobacterium neoaurum B5-4)
<400> 2
Met Gln Phe Ser Lys Val Gly Lys Glu Met Met Thr Thr Val Ala Thr
1 5 10 15
Pro Glu Thr Asp Pro Ala Ser Gln Glu Ala Leu Arg Ser Glu Tyr Ile
20 25 30
Gln Arg Ala Lys Asp Leu Val Pro Leu Leu Arg Ser Asn Ala Arg Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Glu Arg Arg Val Pro Gln Glu Asn Ile Asp Ala Leu Glu
50 55 60
Lys Ser Gly Ile Leu Arg Ala Ser Arg Pro Val Gln His Gly Gly Ile
65 70 75 80
Glu Met Asp Glu Val Thr Lys Phe His Val Phe Ser Glu Leu Ala Arg
85 90 95
Gly Cys Gly Ser Thr Gly Trp Val Ala Thr Leu Leu Ala Asp Ala Gly
100 105 110
Phe Leu Val Ser Leu Phe Pro Asp Glu Val Gln Ala Glu Val Phe Ala
115 120 125
Asp Pro Asn Thr His Thr Thr Ala Thr Leu Ile Pro Ala Gly Arg Ala
130 135 140
Glu Arg Asp Gly Ser Gly Phe Arg Val Thr Gly Arg Trp Pro Phe Asn
145 150 155 160
Thr Gly Cys Arg His Ala Gln Trp Val Ala Glu Pro Ala Val Ile Glu
165 170 175
Leu Glu Ser Gly Gln Pro Glu Val Cys Ile Phe Leu Met Pro Tyr Ser
180 185 190
Glu Leu Glu Ile Leu Asp Asp Trp Tyr Val Ser Gly Leu Arg Gly Thr
195 200 205
Gly Ser Ser Thr Val Val Gly Ser Asn Val Phe Val Pro Glu Glu Arg
210 215 220
Met Leu Arg Leu Arg Asp Ala Lys Ile Gly Asn His Arg Ser Ala Leu
225 230 235 240
Asn Ala Ser Lys Ala Ile Phe Gln Val Pro Pro Thr Met Tyr Ile Val
245 250 255
Thr Ser Ala Gly Ser Thr Ile Pro Gly Met Ala Gln Ala Ala Tyr Asp
260 265 270
Met Tyr Met Glu Lys Leu Gln Thr Arg Gly Pro Ile Ala Tyr Thr Ser
275 280 285
Tyr Ala Arg Arg Val Asp Ala Pro Ile Ala Gln His Gln Val Ala Asn
290 295 300
Ala Ala Leu Lys Ile Asp Ala Gly Lys His Leu Met Arg Gln Ala Leu
305 310 315 320
Glu Met Val Asn Asp His Ala Glu Ser Arg Thr Pro Tyr Leu Pro His
325 330 335
Glu Gln Ala Gln Val Trp Gly Ile Val Gly Tyr Thr Thr Gln Leu Phe
340 345 350
Thr Glu Ala Ile Asp Ile Ile Arg Leu Ala Ser Gly Ala His Gly Val
355 360 365
Tyr Gln Asn Gln Asn Ile Glu Ile Val Phe Arg Asp Val Asn Ala Leu
370 375 380
Ala Ser His Ala Leu Met Met Pro Thr Thr Gly Ile Glu His Tyr Gly
385 390 395 400
Arg Ala Leu Cys Gly Leu Glu Pro Asn Thr Pro Trp Leu
405 410
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accgagctca gatctactag tatgcaattt tccaaagttg g 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acactggcgg ccgttactag ttcacagcca cggggtattc gg 42
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