阅读说明：本技术 一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法 (Method for preparing nanofibers by self-assembly of soybean protein enzymatic hydrolysate ) 是由 李良 安迪 赵添 胡安娜 洪瑞 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法,具体涉及胰蛋白酶酶解后的酶解产物通过自组装形成纳米纤维。包括以下步骤：酶的选择和酶活力的测定；大豆蛋白的酶解：将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到蛋白溶液中,在37℃、pH7的条件下酶解18min、40min；酶解液的离心；纳米纤维的制备：使用NaCl溶液将水解度为1％和3％上清液的浓度稀释至1％、3％(W/V),NaCl的最终浓度为20mM。溶液pH值为2,并在85℃下加热8h来制备纳米纤维；4℃保藏。本方法通过胰蛋白酶酶解大豆蛋白作为制备纳米纤维的构建片段,所得的纳米纤维反应活性高,并可显著抑制纳米纤维的逆反应聚集导致的部分功能丧失。(The invention provides a method for preparing nanofibers by self-assembly of soybean protein enzymatic hydrolysis products, and particularly relates to nanofibers formed by self-assembly of enzymatic hydrolysis products after trypsin enzymolysis. The method comprises the following steps: selecting enzyme and measuring enzyme activity; enzymolysis of soybean protein: adding 0.02g trypsin (1:100) into protein solution, and performing enzymolysis at 37 deg.C and pH7 for 18min and 40 min; centrifuging the enzymolysis liquid; preparing the nano-fibers: the concentrations of the 1% and 3% hydrolysis supernatants were diluted to 1%, 3% (W/V) using NaCl solution, the final concentration of NaCl being 20 mM. The pH value of the solution is 2, and the solution is heated for 8 hours at 85 ℃ to prepare the nano fiber; preserving at 4 ℃. The method uses trypsin enzymolysis soy protein as a construction fragment for preparing the nano-fiber, the obtained nano-fiber has high reaction activity, and partial function loss caused by reverse reaction aggregation of the nano-fiber can be obviously inhibited.)

一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法

技术领域

本发明属于食品蛋白质加工技术，具体涉及一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法。

背景技术

自组装是在平衡条件下，分子通过非共价键自发地连接成的结构上具有明确定义的聚集体。自组装作为一种纳米材料的构建手段，它可以将分子、纳米、微米或更大尺寸的物质自发的组装成有序结构。自组装不仅赋予蛋白质结构功能，例如良好的稳定性，而且在调节生物学功能中起到关键作用。自组装形成的纳米纤维通常具有纳米级的直径和微米级的长度，形态上表现为明显的线性纤维状。已经证实纳米纤维的产生主要取决于非共价键的相互作用，这是氢键，疏水相互作用，静电相互作用等协同作用的结果。

自组装过程产生的肽被广泛接受作为热诱导纳米纤维的构建片段。因此，预先水解的蛋白质而不是完整的蛋白质被用于制造纳米纤维。更重要的是，产生肽的水解动力学影响纳米纤维的生长动力学，因此预先的酶水解对大豆蛋白纳米纤维的形成具有重要的影响。

大豆蛋白作为一种重要的食品成分，由于其极高的营养价值，良好的功能性已广泛应用于食品研究中。长期的研究表明，大豆蛋白在pH2的酸性条件进行加热可以形成纳米纤维。并且大豆蛋白作为形成纳米纤维的优秀构建单元，可以制成具有纳米尺度的纤维状成分。大豆蛋白纳米纤维的大多数特性与当下研究热点的乳清蛋白相当，甚至在某些方面要优于乳清蛋白，因此大豆蛋白自组装纳米纤维具有广阔的研究前景。

本方法通过胰蛋白酶酶解大豆蛋白作为制备纳米纤维的构建片段，既能增加构建片段的数量，又可以产生具有优秀自组装性能的片段。与将酸性条件下的大豆蛋白直接加热的传统方法相比，新方法显著提高了纳米纤维的功能性，增加了纳米纤维的产率，所得的纳米纤维反应活性高，并可显著抑制纳米纤维的逆反应聚集导致的部分功能丧失。

发明内容

本发明提供一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法，达到改善纳米纤维的物化性质，标准化工艺、提高纳米纤维应用价值的目的。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一、酶的筛选；二、大豆蛋白的酶解；三、纳米纤维的制备。

利用大豆蛋白酶解产物制备纳米纤维的方法包括以下步骤：

一、对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶活力测定。

二、通过对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶四种酶进行筛选，确定胰蛋白酶为后续实验用酶。

三、大豆蛋白的酶解：将2g大豆蛋白溶于50mL去离子水中，磁力搅拌2h，之后放入4℃冰箱中水化过夜。将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到大豆蛋白溶液中，将溶液pH值调节至7，在37℃的水浴锅中进行酶解反应，反应时间18min、40min，控制溶液的水解度为1％、3％。酶解反应结束后，将酶解液置于沸水浴中10min，以终止酶解反应。

四、将酶解液冷却至室温，在7500rpm下离心15min，取上清液备用。

五、纳米纤维的制备：使用NaCl溶液将上清液的浓度稀释至1％、3％(W/V)通过BCA法测定上清液的蛋白含量，此时溶液中NaCl的最终浓度为20mM，使用2mol/L和0.1mol/L的HCl将溶液的pH值精确调至2，之后将溶液置于85℃的水浴中加热8h，反应结束后将溶液置于冰浴中以停止反应，得到大豆蛋白自组装纳米纤维。

具体实施方式

：

实施例1纳米纤维的制备

一、对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶活力测定。

二、通过对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶四种酶进行筛选，确定胰蛋白酶为后续实验用酶。

三、大豆蛋白的酶解：将2g大豆蛋白溶于50mL去离子水中，磁力搅拌2h，之后放入4℃冰箱中水化过夜。将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到大豆蛋白溶液中，将溶液pH值调节至7，在37℃的水浴锅中进行酶解反应，反应18min。控制溶液的水解度为1％。酶解反应结束后，将酶解液置于沸水浴中10min，以终止酶解反应。

四、将酶解液冷却至室温，在7500rpm下离心15min，取上清液备用。

五、纳米纤维的制备：使用NaCl溶液将上清液的浓度稀释至1％(W/V)通过BCA法测定上清液的蛋白含量，此时溶液中NaCl的最终浓度为20mM，使用2mol/L和0.1mol/L的HCl将溶液的pH值精确调至2，之后将溶液置于85℃的水浴中加热8h，反应结束后将溶液置于冰浴中以停止反应，得到大豆蛋白自组装纳米纤维。

实施例2纳米的制备

一、对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶活力测定。

二、通过对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶四种酶进行筛选，确定胰蛋白酶为后续实验用酶。

三、大豆蛋白的酶解：将2g大豆蛋白溶于50mL去离子水中，磁力搅拌2h，之后放入4℃冰箱中水化过夜。将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到大豆蛋白溶液中，将溶液pH值调节至7，在37℃的水浴锅中进行酶解反应，反应40min。控制溶液的水解度为3％。酶解反应结束后，将酶解液置于沸水浴中10min，以终止酶解反应。

四、将酶解液冷却至室温，在7500rpm下离心15min，取上清液备用。

五、纳米纤维的制备：使用NaCl溶液将上清液的浓度稀释至3％(W/V)通过BCA法测定上清液的蛋白含量，此时溶液中NaCl的最终浓度为20mM，使用2mol/L和0.1mol/L的HCL将溶液的pH值精确调至2，之后将溶液置于85℃的水浴中加热8h，反应结束后将溶液置于冰浴中以停止反应，得到大豆蛋白自组装纳米纤维。