阅读说明：本技术 一种提高毛细管电泳重复性的方法 (Method for improving repeatability of capillary electrophoresis ) 是由 蒲巧生 孙萍 王远航 赵蕾 陶俊宏 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高毛细管电泳重复性的方法,基于两种及两种以上检测方式,采用单检测位点使两种检测模式的信号响应同步且独立,同时,采用与分析物的检测模式不同的检测模式作为参考物的检测模式,利用参考物的检测信号对分析物的检测信号进行迁移时间及峰面积的校准,校准后的RSD值小于校准前的RSD值。使用本方法在消除电泳过程中多种因素波动的影响的基础上,增加了参考物的选择范围,降低了参考物的选择难度和电泳分离难度,提高了分析效率以及CE重复性。(The invention discloses a method for improving the repeatability of capillary electrophoresis, which is based on two or more detection modes, adopts a single detection site to synchronize and independently respond signals of two detection modes, simultaneously adopts a detection mode different from the detection mode of an analyte as the detection mode of a reference substance, utilizes the detection signal of the reference substance to calibrate the migration time and the peak area of the detection signal of the analyte, and the RSD value after calibration is smaller than the RSD value before calibration. By using the method, on the basis of eliminating the influence of various factor fluctuations in the electrophoresis process, the selection range of the reference substance is increased, the selection difficulty of the reference substance and the electrophoresis separation difficulty are reduced, and the analysis efficiency and the CE repeatability are improved.)

一种提高毛细管电泳重复性的方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种提高毛细管电泳重复性的方法。

背景技术

毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）以其分析速度快，试剂和样品消耗少等优势在近几十年得到了广泛应用。然而CE技术重复性差的问题依旧是目前限制其进一步发展的重要因素。进样电压、进样时间、温度、离子强度、样品和缓冲溶液的pH值的微小变化，甚至毛细管的表面化学和几何形状的微小变化，都能导致CE中迁移时间和峰面积的显著变化。样品吸附，缓冲pH变化造成的电渗流波动通常通过在每次运行之间严格的毛细管清洗步骤来消除，但这种方式增加了分析时间和操作的繁琐程度。同时克服这些不利因素最有效的方法是在分析样品中加入参考物，以参考物和分析物的相同变化，来消除电泳过程各种波动造成的不重复现象。

目前，CE用于样品的分离分析时通常采用同一种检测模式因此参考物必须与分析物具有相同机理的响应信号（Electrophoresis, 2008, 29, 1347–1354），还需要参考物足够稳定、有足够的信号响应、与被分析物有相似的性质，特别是要求参考物与分析物或相关分析物完全分离，不能影响分析物的检测。参考物的诸多选择要求增加了其选择难度以及电泳分离的难度，给实际应用中带来不便。

基于此，开发一种能够降低参考物的选择难度以及电泳分离难度，以提高CE重复性的方法十分重要。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种提高毛细管电泳重复性的方法，采用包含至少两种机理的毛细管电泳检测器作为检测装置，使用与分析物不同检测机理的信号作为参考信号，增加参考物的选择范围，降低参考物的选择难度和电泳分离难度，提高毛细管电泳的重复性。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种提高毛细管电泳重复性的方法，使用包含至少两种不同检测模式的共检测位点的毛细管电泳检测器进行分析物和参考物的检测，分别得到分析物的检测信号和参考物的检测信号的电泳谱图；读出电泳谱图中各信号峰的迁移时间和峰面积；通过参考物在谱图中的迁移时间和峰面积，对分析物的迁移时间和峰面积进行校准计算，并以相对标准偏差值的大小评估（RSD）校准前后电泳峰的重复性，最后得到毛细管电泳分析物电泳谱图的重复的结果。

样品峰的重复性包含迁移时间重复性和峰面积重复性。

本发明提高毛细管电泳重复性的方法具有以下优势：

1）参考信号与分析物信号检测机理不同，互不干扰。

2）参考物的选择范围广，可使用与分析物响应机理不同的参考物。

3）参考信号与分析物信号同时同位点检测，具有同步性。

4）通过计算能够降低甚至消除电泳过程中多种因素波动的影响，显著降低迁移时间和峰面积的相对标准偏差值。

本方法在消除电泳过程中多种因素波动的影响的基础上，增加了参考物的选择范围，降低了参考物的选择难度和电泳分离难度，提高了分析效率以及CE重复性。

附图说明

图1 示出了提高毛细管电泳重复性方法的实施流程。

图2是实施例中两种信号的电泳谱图。

图3是实施例中校准前后迁移时间的RSD值比较。

图4是实施例中校准前后峰面积的RSD值比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

本发明提供了一种提高CE重复性的方法，其流程如图1所示，具体按以下步骤进行：

1）使用毛细管电泳检测系统，该检测系统中包含至少两种不同的检测模式；用该毛细管电泳检测系统进行检测时，待分析物和参考物同时进样，用一种检测模式检测待分析物，用另一种检测模式检测参考物，即参考物检测模式与待分析物检测模式不同；不同的检测模式共用一个检测位点；在有效分离的情况下，同时得到不同检测模式下的电泳谱图，即分别得到待分析物的电泳谱图和参考物的电泳谱图；

毛细管电泳样品包括但不限于DNA、蛋白质分子、多肽分子、氨基酸及其衍生物、糖类、无机离子、脂类等中的一种或几种。

参考物的选择不再局限于和待分析物响应信号相同的物质，选择范围可以根据毛细管电泳检测系统中检测器类型拓展到与待分析物响应信号不同的物。

2）以待分析物的电泳谱图作为分析信号，以参考物的检测信号作为参考信号；

3）通过电泳谱图得到该电泳谱图中各信号峰的迁移时间，对电泳谱图进行积分得到各信号峰的峰面积；

即，将待分析物的电泳迁移时间定义为t₁,t₂,…,t_n，将待分析物的电泳峰面积定义为A₁,A₂,…,A_n，将参考物的电泳迁移时间定义为t_R1,t_R2,…,t_Rn，将参考物的电泳峰面积定义为 A_R1,A_R2,…,A_Rn，其中1,2,…,n代表参考物和待分析物的数量；

以参考物的迁移时间为基准，对待分析物的迁移时间进行校准；校准采用单点校准法或两点校准法；单点校准法用于只有一个参考物的情况中，按公式

进行计算，（1）式中，t_i,cal为校准后的第i个待分析物的迁移时间；为距离该待分析物i最近的参考物j的平均迁移时间；t_Rj为参考物的迁移时间；

两点校准法对迁移时间的校准适用于含有两个至多个参考物的情况中，按公式

进行计算（Electrophoresis，2015, 36, 875–883）。（2）式中，，分别为参考物j和n的平均迁移时间；t_Rn，t_Rj分别为参考物n和j的迁移时间；t_i为待分析物的迁移时间，t_Rj＜t_i＜t_Rn。需要指出的是，文献中公式的参考物与分析物迁移时间是使用同一检测方式得到的，而在本发明方法中，参考物的迁移时间是通过与待分析物不同的检测方式得到的。所以，将原公式中由同一检测方式得到的参考物的迁移时间替换为由不同检测方式得到的迁移时间后，通过实施例中的数据证明该公式适用于本发明方法。

峰面积校准采用公式

进行计算，（3）式中，A_i,cal为校准后的分析物i的峰面积；A_i为校准前的分析物i的峰面积；A_Rj为参考物j的峰面积；为参考物的平均峰面积。

样品峰的重复性包含迁移时间重复性和峰面积重复性。

最后，得到校准后的分析物电泳谱图。

实施例

以激光诱导荧光检测（LIF）和电导检测(C⁴D)两种模式作为毛细管电泳的检测器，以罗丹明123（Rh123）、罗丹明6G（Rh6G）和罗丹明B（RhB）为参考物，用于十种无机阳离子Cs⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺的检测。

使用的毛细管电泳分离条件为：毛细管总长度45cm，有效长度30cm；毛细管在使用前分别用1M NaOH、超纯水、1M HCl和超纯水运行缓冲分别冲洗10分钟；然后，运行缓冲浓度20 mM的吗啉乙磺酸，浓度20 mM的L-组氨酸，浓度 2 mM 的18-冠醚-6，0.1% (w/w) 的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；进样方式为重力进样，抬高10 cm，进样15 s；分离电压为16 kV。

实施例中样品及浓度为：Cs⁺、K⁺、Na⁺和Li⁺浓度分别为400 μM， Pb²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺浓度分别为800 μM，Hg²⁺浓度为4 mM，Rh123浓度为50 nM，Rh6G浓度为100 nM，RhB浓度为1 μM。

电泳过程中，Rh123、Rh6G和RhB作为参考物，其信号由LIF检测器检测，得到荧光信号；十种无机阳离子作为待分析物，其信号由C⁴D检测器检测，得到电导信号。图2为同一次电泳过程中同时得到的两种信号的电泳谱图。在相同电泳条件下，连续进行7次电泳。并记录电泳谱图中各信号峰的迁移时间及峰面积。

根据具体实施方式中所述的计算方法对Cs⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺的迁移时间进行校准。Cs⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺、Pb²⁺和Cd²⁺的迁移时间以Rh123为参考物，使用单点校准法进行校准。以Cs⁺为例，K⁺、Na⁺、Li⁺、Pb²⁺和Cd²⁺的校准方法同Cs⁺。由电泳谱图得到的Rh123的平均迁移时间为283.4秒（n=7），单次运行的Cs⁺迁移时间t_Cs为96.14秒，同一次运行中Rh123的迁移时间t_Rh123为282.3秒，则校准后的Cs⁺迁移时间t_Cs,cal为

Hg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺的迁移时间以Rh6G和RhB为参考物，使用两点校准法进行校准。以Hg²⁺为例，Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺的校准方法同Hg²⁺。由电泳谱图得到的Rh6G的平均迁移时间为328.2秒（n=7），RhB的平均迁移时间为744.5秒（n=7），单次运行的Hg²⁺迁移时间t_Hg为331.7秒，同一次运行中Rh6G的迁移时间t_Rh6G为327.0秒，RhB的迁移时间t_RhB为751.6秒，则校准后的Hg²⁺迁移时间t_Hg,cal为

根据具体实施方式中所述的计算方法，以Rh123作为参考物，对Cs⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺的峰面积进行校准。以Ni²⁺为例，其他离子的校准方法同Ni²⁺。由电泳谱图进行积分得到的Rh123的平均峰面积为0.9050（n=7），单次运行的Ni²⁺的峰面积A_Ni为0.6923，同一次运行中Rh123的峰面积A_Rh123为0.9442，则校准后的Ni²⁺的峰面积A_Ni,cal为

通过上述方法进一步计算了连续进行7次电泳，校准前后无机阳离子各峰的迁移时间的RSD值（图3所示），结果表明校准后的迁移时间RSD值明显低于校准前迁移时间RSD值。分析连续进行7次电泳后无机阳离子各峰面积的RSD值（图4所示），结果表明校准后的峰面积的RSD值明显低于校准前迁移时间RSD值。证明本发明所提出的方法能够改善毛细管电泳重复性，有望推广。